用于治疗奶牛乳腺炎和子宫内膜炎的含有苦豆子总碱的中药灌注液及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于治疗奶牛病原性乳腺炎和子宫内膜炎，显效快、毒性低、易代谢、无残留的含有苦豆子总碱的中药灌注液，并提供了其制备方法。本发明的有益效果为：苦豆子总碱灌注液作为纯天然药物，具有毒副作用小，不易产生抗药性等优点，能显著的节省成本，减少弃奶损失，而且中药疗法注重调理，有利于机体整体机能和体况的恢复。此种含有苦豆子总碱的中药灌注液对于治疗奶牛乳腺炎具有广阔的发展前景。

说明书

技术领域

本发明涉及中药应用领域，具体涉及用于治疗奶牛乳腺炎和子宫内膜炎的含有苦豆子总碱的中药灌注液。

背景技术

苦豆子为多年生豆科草本植物，苦豆子的干燥全草及种子。苦豆子广泛分布于甘肃、宁夏、新疆、西藏、内蒙古等地。全草夏季采收，种子春季采收，干燥。全草生用，种子炒用。近年来国家将苦豆子列入重点保护的六大地道药材之一，纳入国家中药现代化科技产业行动计划中，对于生产基地建设和深层次开发都有长足的发展。苦豆子味极苦、性寒有毒，具有清热解毒，抗菌消炎、止痛杀虫等作用。民间用根治疗喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等。目前用于药物开发的主要有8种生物碱：槐果碱，苦参碱，氧化苦参碱，氧化槐果碱一，槐胺碱，槐定碱，莱曼碱，苦豆碱。苦豆子生物碱的药理作用：1、抗菌作用，目前已经成功研制出治疗痢疾药苦豆子片及治疗妇科炎症药妇炎栓（苦豆子）栓；2、对心血管系统的作用，体现在抗心律失常、正性肌力作用，降压和降低心率作用，对心肌缺血和梗塞的保护作用，降血脂作用；3、抗病毒、抗炎及免疫抑制作用，苦豆子总碱能抑制多种病毒繁殖．增强免疫调节功能和免疫促进作用；4、抗肿瘤作用，对肝癌细胞抑制作用明显，对宫颈癌、淋巴肉瘤、肺癌也有抑制作用；5、对平滑肌的作用，苦豆子总碱和一些单体生物碱均能对抗由炎症介质诱导的离体回肠收缩，对支气管平滑肌具有松弛作用，对整体模型也有作用：6、目前临床应用苦豆子浸膏片、苦豆碱治疗急性菌痢，槐果碱片治疗支气管哮喘，苦参碱治疗妇科炎症、苦参素注射液治疗慢性乙型病毒性肝炎均取得很好的疗效。

奶牛乳腺炎和子宫内膜炎是世界奶牛业中最常见和造成经济损失最大的一种疾病，其发病原因主要是病原微生物感染。引起奶牛乳腺炎和子宫内膜炎的病原微生物十分复杂，包括细菌、真菌、病毒、支原体等。其中以细菌感染为主，主要有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌。其次是真菌感染，并且常常混合感染。该病的发生直接影响牛奶的质量和产量，还会降低奶牛的产奶年限，增加了淘汰率。该病在临床上发病率高、难防治，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。

目前奶牛乳腺炎和子宫内膜炎防治措施很多，如抗菌消炎、增强机体抵抗力，并以疫苗免疫和良好的管理饲养等，但是奶牛乳腺炎和子宫内膜炎发病几率还是特别高。特别是临床普遍采用的抗生素和化药治疗奶牛乳腺炎和子宫内膜炎，首先是奶牛乳腺炎和子宫内膜炎的临床症状消失，但很容易复发；其次抗生素和化药抗菌的耐药性普遍存在，使用抗生素和化药的剂量在不断加大，但临床疗效不好，再加上抗生素残留，直接危害人类健康。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于治疗奶牛病原性乳腺炎和子宫内膜炎，显效快、毒性低、易代谢、无残留的中药灌注液。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种中药灌注液，所述中药灌注液中含有苦豆子总碱。

进一步的，上述的中药灌注液，所述中药灌注液中含有苦豆子总碱3-8g。

进一步的，上述的中药灌注液，所述中药灌注液中含有苦豆子总碱6g。

本发明的第二个目的是提供了一种中药灌注液的制备方法，包括以下步骤：

1）取苦豆子种子粉碎至50-80目，加入体积百分比为50%-90%的乙醇水溶液进行超声波提取，超声频率20KHz，5000W，过滤后回收乙醇，加入2%盐酸调pH为2-5，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀，再加入氯仿萃取三次沉淀，减压回收氯仿得到苦豆子总碱；

2）在步骤1）得到的苦豆子总碱中加入注射用水定容，苦豆子总碱和注射用水的质量比为（3-8）：（92-97），采用流通蒸汽灭菌30-40min,在无菌条件下进行灌装得成品中药灌注液。

    进一步的，上述的制备方法，所述步骤2）中，苦豆子总碱和注射用水的质量比为6：94。

本发明的第三个目的是提供了苦豆子总碱在制备用于治疗奶牛乳腺炎和子宫内膜炎的中药灌注液中的应用。

进一步的，上述的应用，所述中药灌注液的使用量为每头奶牛每个乳区30-60ml。

本发明的有益效果为：本发明提供的含有苦豆子总碱的中药灌注液，与注射用氨苄西林钠相比，治疗奶牛乳房炎的治愈率分别是90% 和70%，在治愈率方面苦豆子总碱灌注液较高。在经济效益方面，注射用氨苄西林钠治疗期间加4天的停药期，有近7d的弃奶期，药物的残留影响消费者的健康，频繁使用容易造成耐药性，导致再次治疗更加困难；苦豆子总碱灌注液作为纯天然药物，具有毒副作用小，不易产生抗药性等优点，能显著的节省成本，减少弃奶损失，而且中药疗法注重调理，有利于机体整体机能和体况的恢复。此种含有苦豆子总碱的中药灌注液对于治疗奶牛乳腺炎具有广阔的发展前景。本发明提供的苦豆子总碱灌注液的制备方法，过程简单。本发明还公开了苦豆子的提取物苦豆子总碱灌注液在治疗奶牛乳腺炎和子宫内膜炎中的应用，该药物具有抗菌、消炎、低毒、无残留、不易产生耐药性等优点，而且刺激性小，成本较低，能够有效治疗因细菌、真菌、滴虫引起的奶牛乳腺炎和子宫内膜炎等疾病的防治与治疗，特别是靶向治疗奶牛乳腺炎和子宫内膜炎。本发明具有单味中药的提取物，有利于产品的稳定性和质量可控性；靶向制剂在奶牛乳腺和子宫内释放，减少消化道的吸收，在病变区直接释放且可以较高浓度分散于奶牛乳房和子宫，对疾病的治疗更有效、确切；靶向制剂减少药物对上消化道的刺激，不良反应少，使用方便，顺应性好。使奶农及奶牛养殖企业获得良好的经济效益。

本发明提供的含有苦豆子总碱的中药灌注液的具体检测结果：

一、苦豆子总碱提取物的测定

苦豆子总碱，取本品约 0.15g，精密称定，置烧杯中，加盐酸0.2mol/L5ml 溶解，移入分液漏斗中，用水 10ml 分数次洗涤烧杯，洗液与溶液合并，加氯化钠 6g，摇散，再加入氢氧化钠液1mol/l5ml，用氯仿振摇提取 5 次分别为 25ml、20ml、10ml、10ml、10ml分取的氯仿层依次通过塞有脱脂棉并盛有 1g 无水硫酸钠的玻璃漏斗，滤入另一分液漏斗中，合并氯仿液，精密加入硫酸滴定液0.05mol/L20ml 及水 10ml。振摇提取后，分出酸层，氯仿层用水洗涤三次，每次 10ml。合并酸液及洗液，置锥形瓶中，水浴加热除去残留的氯仿，放冷至室温，加甲基红指示剂 2 滴，用氢氧化钠滴定液0.1mol/l滴定，每 1ml 硫酸滴定液0.05mol/l相当于 24.84mg 的 C1₅H₂₁N₂O。

槐定碱按照高效液相色谱法中国药典 2000 年版二部附录VID测定。 

色谱条件与系统适用性试验：色谱柱，Spherisorb 氨基柱；以乙腈-磷酸水溶液PH2-无水乙醇80:8:10为流动相；检测波长 220nm；槐定碱和其他生物碱的分离度应符合要求；相对标准差应小于2.0％。

测定法：取本品 25mg，精密称定，置 100ml 量瓶中，用乙腈-无水乙醇8:1溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取 20μl 注入液相色谱仪，记录色谱图；另取槐定碱对照品约 10mg，精密称定，置 100ml 量瓶中，用上述溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中槐定碱C₁₅H₂₄N₂O的含量。

二、具体实验过程：

（一）牛津杯法测定苦豆子总生物碱的体外抗菌活性

采用牛津杯法测定了苦豆子总碱对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌的抗菌活性。试验结果表明，苦豆子总碱浓度为5mg/ml时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌的抑菌圈直径分别为9.94mm、10.65mm、10.66mm、6.89 mm。在20mg/ml时抑菌圈直径分别为19.30 mm、13.98 mm、19.69 mm、12.92 mm。可以看出随着浓度的升高，苦豆子总碱对大肠杆菌和表皮葡萄球菌的抑制作用明显高于对金黄色葡萄球菌和无乳链球菌。其中对表皮葡萄球菌的抑制作用最强，对无乳链球菌的抑制作用相对其它三种菌最弱。

1、材料与方法

1.1、材料与试剂

供试菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、表皮葡萄球菌，均由兰州畜牧与兽药研究所兽药研究室提供。

供试样：苦豆子总碱，由广东海纳川药业股份有限公司生产，用水溶解后配制成不同浓度的供试液。

1.2、仪器与设备

KH-300DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；RE-201D旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司；电热恒温培养箱，上海鸿都电子科技有限公司DNP-9272A型；恒温振荡器，美国精骐有限公司IS-RDV1；生物安全柜，上海申力科学仪器有限公司HFsafe-1500。

1.3、菌悬液的制备

将活化培养好的菌液分别接入无菌生理盐水中，依次进行梯度稀释，使菌悬液中的细菌数为107cfu/ml。

1.4、牛津杯法测定抗菌活性

将已融化的培养基20ml加入高压灭菌过的培养皿内，凝固后吸取200微升菌悬液加入其中，用涂布器将菌液涂布均匀，制成带菌平皿，用无菌镊子夹取已高压蒸汽灭菌并烘干的牛津杯，轻轻平置于已涂布菌液的培养皿表面，每个培养皿十字对称放置4个牛津杯，用无菌移液枪分别移取200微升不同质量浓度的试样到牛津杯中，将培养皿缓慢移入恒温培养箱，37℃培养18h，取出观察各培养皿菌落生长情况，并用游标卡尺测定抑菌圈直径，记录数据，供试样的浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml。

2、结果

通过以上方法测定，结果如表1所示。

表1

。

3、结论

苦豆子总碱对奶牛乳腺炎和子宫内膜炎的主要几种致病菌均有抑制作用，并在一定的范围内随着苦豆子总碱浓度的升高抑制作用也逐步增强，其中对表皮葡萄球菌的抑制作用最强，对无乳链球菌的抑制作用相对其它三种菌最弱。可以进一步研究苦豆子总碱对其它细菌的抑制作用，为苦豆子总碱的开发利用提供参考依据。

（二）苦豆子总碱对小鼠急性毒性试验研究：

采用改良寇氏法测定苦豆子总碱对小鼠腹腔注射的急性毒性，评价其安全性，为临床安全用药提供依据。试验时，给试验组小鼠灌服不同浓度的苦豆子总碱，观察给药后小鼠的活动与死亡情况，采用改良寇氏公式计算LD₅₀及LD₅₀的95%可信限，结果表明，苦豆子总碱经腹腔注射的LD₅₀为559.24mg/kg，LD₅₀的95%可信限为471.95mg/kg～663.59ma/kg。试验结果初步提示，苦豆子总碱的毒性较低，临床安全用药可靠。

1、材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验动物

昆明系清洁级健康小鼠，雌雄各半，体重（20±2）ｇ,购自兰州大学试验动物中心（甘医动字14-005）。

1.1.2  受试药物

苦豆子总碱，由广东海纳川药业股份有限公司提取制备。

1.2  方法

1.2.1  苦豆子总碱的提取

取苦豆子种子粉碎，加入乙醇水溶液进行超声波提取，过滤后回收乙醇，加入2%HCl调PH，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀。再加入氯仿萃取，减压回收氯仿得到苦豆子总碱。

1.2.2  预试验

预试验前对小鼠进行7d的喂养观察，观察期内，小鼠自由采食，饮水，淘汰自然死亡小鼠。预试验期内选取健康小鼠25只，雌雄各半，随机分为5组。每组5只，试验前禁食8小时，将苦豆子总碱配制成5个浓度，各组等浓度腹腔注射给药，确定正式试验的剂量范围。

1.2.3  正式试验

根据预试验，确定Dn和Dm，在Dn和Dm之间设6个剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。试验前禁食8小时，自由饮水。腹腔注射给药后立即观察和记录小鼠的行为状态和死亡情况，观察期为7天，根据实验结果计算半数致死量（LD₅₀），对死亡小鼠及时解剖，记录病变情况，观察小鼠腹腔和实质性器官的病理变化。

1.2.4  LD₅₀的计算方法

采用改良寇氏法计算LD₅₀及LD₅₀的95%可信限，计算公式如下：

LD₅₀的95%可信限=lg^-1（lgLD₅₀±1.96×Sx₅₀）

式中：i为组距，即相邻2组剂量的对数剂量之差；Xm为最大死亡率组剂量对数；Σp为各剂量组死亡率之和；p为各剂量组死亡率；q为各剂量组存活率；n为各组动物数；Sx₅₀为lgLD₅₀的标准误。

2、结果与分析

2.1  预试验结果

苦豆子总碱对小鼠急性毒性预试验结果如表2所示。由预试验结果得出，Dn与Dm分别为200mg/kg和1000mg/kg。根据预试验结果确定正式试验分为6个剂量组，按下式求出剂量比：

                             

式中，r为相邻两组剂量的比值；N为正式试验所需组数。计算得出正式试验的r=0.707。

表2

。

根据预试验结果，设为200mg/kg、276.24mg/kg、381.55mg/kg、527.00mg/kg、727.90mg/kg、1000mg/kg体重6个给药剂量组，进行急性毒性试验。结果如表3所示。根据表3中的数据，由公式算出，苦豆子总碱对小鼠的半数致死量LD₅₀=559.24mg/kg，LD₅₀的95%可信限为471.95mg/kg～663.59ma/kg。因此判定苦豆子总碱对小鼠经腹腔注射LD₅₀大于500mg/kg，根据我国动物毒理急性毒性分级法，苦豆子总碱属于低毒物质。

表3

。

2.2、苦豆子总碱对小鼠急性毒性试验临床观察：

小鼠一次性腹腔注射给药，剂量为200mg/kg时，在试验期内小鼠无死亡现象，2小时未死亡小鼠症状逐渐减轻，12小时后基本恢复正常，能正常进食和饮水；剂量为276.24mg/kg时，在1小时内小鼠死亡一只；剂量为381.55mg/kg时，在15分钟之内小鼠死亡2只；剂量为527.00mg/kg时，在10分钟内小鼠死亡3只；剂量为727.90mg/kg时，在10分钟内小鼠死亡6只；剂量为1000mg/kg时，在5分钟内小鼠全部死亡。

小鼠在腹腔注射给药后的主要中毒症状表现为精神萎靡，拱背，全身抽搐，前爪挠嘴，并有间断性兴奋。临死前多呈现出跳跃动作，继而四肢呈游泳状，随后死亡。

2.3、急性毒性试验死亡小鼠剖检结果

对死亡小鼠解剖发现腹腔中有少量积液，心脏色泽暗淡，肝脏有轻微的肿大，肾脏眼观无明显变化，其他脏器无明显眼观病变。对存活小鼠及空白对照组小鼠6天后处死并解剖观察，未发现腹腔积液，其他脏器无明显眼观病变。

3、结果

试验结果表明，苦豆子总碱对小鼠腹腔注射的半数致死量LD₅₀为559.24mg/kg，LD₅₀的95%的可信限为471.95mg/kg～663.59ma/kg，符合低毒物质分级标准。

一次性小鼠腹腔注射给药后，存活小鼠12小时后基本恢复正常，6天后对存活小鼠进行解剖学观察，各脏器均未见明显眼观病变。说明试验后存活小鼠恢复较快，药物对其持续影响较小。

苦豆子总碱在人类临床医学上的研究与应用较多，但在畜牧业生产方面的研究与应用较少，本次试验通过对苦豆子总碱的急性毒性进行评价，为以后苦豆子总碱在畜牧业中的进一步开发研究应用做点准备工作。

（三）苦豆子总碱灌注液治疗奶牛乳腺炎临床试验：

苦豆子总碱灌注液治疗奶牛乳腺炎和子宫内膜炎，效果明确，治愈后不易反弹。

自2011到2012年对苦豆子总碱灌注液治疗奶牛乳腺炎临床试验。通过协商先后选择兰州段家摊奶牛场的18头患乳房炎的奶牛作为试验对象。这些14头患病奶牛临床症状主要表现为：奶牛产奶量下降，乳房部分肿胀发红，有热和痛感，牛奶中有薄片、絮状物、脓块或血液，牛奶呈稀水样或挤不下来。4头患病严重，其乳房表现突然肿胀、发热、变硬、乳区敏感，甚至表现体温升高、饮食大减或废绝、精神萎顿等，根据临床症状、乳房触诊和乳质检查确定为临床型乳腺炎。

1. 试验用药品

苦豆子总碱灌注液：广东海纳川药业有限公司提供，批号为20110218，100ml/瓶。

注射用氨苄西林钠购自本地兽药店，由远征药业有限公司生产，批号为20120308，规格为5g/支。

2.试验

2.1 试验分组

2011年6月5日至19日，在该奶牛场把5头已出现临床症状的患病奶牛作为第一组；6月25日至7月25日在同一牧场有22头出现临床症状的患病奶牛，选出18头与第一组情况基本相似的患病奶牛作为第二组；分别对二组分别给药苦豆子总碱灌注液、注射氨苄西林钠进行治疗。

2.2 试验方法

试验组采用苦豆子总碱灌注液进行治疗，每头牛一剂，乳房灌注，每天2次，每次50ml,连用5d为一个疗程；对照组采用注射用氨苄西林钠，乳房灌注，患病乳室每次5g,每天一次，连用5d为一个疗程。

3结果

用药后治愈表现为红、肿、热、痛及硬症状消失，肉眼观察奶样正常，奶产量恢复。用苦豆子总碱灌注液治疗奶牛乳房炎的治愈率为88.8%，氨苄西林钠治疗奶牛乳房炎的治愈率为77.7%。

苦豆子总碱灌注液组的18头奶牛在用药5d之后有16头乳房炎症状消失或明显改变，治愈率为88.8%（16/18）。氨苄西林钠组的9头奶牛在用药后五天之后有7头乳房炎症状消失或明显改变，治愈率为77.7%（7/9）。苦豆子总碱灌注液组的治疗效果高于氨苄西林钠组。

附图说明

图1为苦豆子总碱浓度为5mg/ml和20mg/ml时，对大肠杆菌的抑菌图。

图2为苦豆子总碱浓度为5mg/ml和20mg/ml时，对金黄色葡萄球菌的抑菌图。

图3为苦豆子总碱浓度为5mg/ml和20mg/ml时，对表皮葡萄球菌的抑菌图。

图4为苦豆子总碱浓度为5mg/ml和20mg/ml时，对无乳链球菌的抑菌图。

具体实施方式

实施例1：

含有苦豆子总碱的中药灌注液的制备方法，包括以下步骤：

1）取苦豆子种子粉碎，加入乙醇水溶液进行超声波提取，过滤后回收乙醇，加入2%盐酸调PH，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀，再加入氯仿萃取沉淀，减压回收氯仿得到苦豆子总碱；

2）在步骤1）得到的苦豆子总碱3g中加入注射用水定容至100ml，采用流通蒸汽灭菌30min,在无菌条件下进行灌装得成品中药灌注液。

实施例2：

含有苦豆子总碱的中药灌注液的制备方法，包括以下步骤：

1）取苦豆子种子粉碎，加入乙醇水溶液进行超声波提取，过滤后回收乙醇，加入2%盐酸调PH，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀，再加入氯仿萃取沉淀，减压回收氯仿得到苦豆子总碱；

2）在步骤1）得到的苦豆子总碱8g中加入注射用水定容至100ml，采用流通蒸汽灭菌40min,在无菌条件下进行灌装得成品中药灌注液。

实施例3：

含有苦豆子总碱的中药灌注液的制备方法，包括以下步骤：

1）取苦豆子种子粉碎，加入乙醇水溶液进行超声波提取，过滤后回收乙醇，加入2%盐酸调PH，加入乙醚洗涤2次，得到滤液沉淀，再加入氯仿萃取沉淀，减压回收氯仿得到苦豆子总碱；

2）在步骤1）得到的苦豆子总碱6g中加入注射用水定容至100ml，采用流通蒸汽灭菌35min,在无菌条件下进行灌装得成品中药灌注液。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。