一种从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-芸香糖苷的方法

摘要

本发明提供了一种从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-芸香糖苷的方法，该方法采用二维液相色谱－质谱联用技术，以甲醇－水或乙腈－水为流动相，以反相C18色谱柱为一维制备色谱柱，对银杏叶提取物进行组分切割，收集目标组分为山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品。再以亲水型TECys为二维制备色谱柱，对山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品进行组分切割，收集，旋转蒸发浓缩，得到高纯度的山奈酚-3-O-芸香糖苷，纯度可以达到80%以上。本发明制备过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求，可用于舒血宁注射液原料制备。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种从银杏叶提取物中制备山 奈酚-3-O-芸香糖苷的方法。

背景技术

山奈酚-3-O-芸香糖苷是黄酮类化合物，存在于菊科植物红花属、凤仙花科、 银杏叶科等植物中。山奈酚-3-O-芸香糖苷具有降低收缩压和舒张压，平均动脉 血压和心率的作用，同时具有抗过敏，镇痛和降低血糖的作用，对治疗心脑血 管疾病和糖尿病具有很大的应用潜力。目前，对于山奈酚-3-O-芸香糖苷的制备， 主要是植物经过醇提，然后经大孔树脂或葡聚糖凝胶等多次柱层析步骤进行分 离纯化，操作步骤繁琐，过程复杂，同时需要消耗大量的有机溶剂，耗时费力。 从银杏叶提取物中用二维液相色谱－质谱方法制备山奈酚-3-O-芸香糖苷的方法 还未见报道。

二维液相色谱技术是通过用两根性质相同或不同的色谱柱对复杂样品进行 分离。作为一种分析复杂样品的理想工具，它已被广泛应用于医药卫生、食品 科学、环境和农业科学等各个领域。与单维制备色谱相比，二维液相色谱不但 具有更高的峰容量，而且两维具有不同的选择性。经过第一维简化的组分可以 在第二维上根据不同的选择性而实现互补分离，结构相似的化合物可能在第二 维可到有效分离，从而提高制备的效率和化合物纯度。

发明内容

本发明提供一种从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-芸香糖苷的方法。该方 法是以银杏叶提取物为原料，采用二维液相色谱－质谱技术制备山奈酚-3-O-芸 香糖苷的方法，山奈酚-3-O-芸香糖苷的纯度可以达到80%以上。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-芸香糖苷的方法，其特征在于：以 银杏叶提取物为原料，经甲醇-水溶液溶解后，得到银杏叶提取物溶液，再经过 二维液相色谱分离纯化技术，得到山奈酚-3-O-芸香糖苷。

进一步地说：

所述银杏叶提取物溶于40-80%的甲醇-水溶液，制得银杏叶提取物溶液，银 杏叶提取物浓度为10－1000mg/mL。

所述银杏叶提取物最佳溶于50－60%的甲醇－水溶液，银杏叶提取物浓度 最佳为250－550mg/mL。

更进一步地说：

所述二维液相色谱分离纯化技术为二维液相色谱－质谱联用进行银杏叶提 取物制备山奈酚-3-O-芸香糖苷；采用液相色谱进行一维制备的色谱柱为反相 C18，二维制备的色谱柱为亲水型TECys色谱柱；

一维液相色谱制备采用的流动相为有机相和水相的混合，洗脱条件按照有 机相15－65%等度或0－30分钟有机相由5%提高到60%梯度进行；其中有机相 为甲醇或乙腈，水相为水；

对一维收集浓缩后的样品，进行二维液相色谱制备，二维液相色谱制备采 用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机相70－90%等度或经0－20 分钟有机相由95%降低到55%梯度进行，二维液相色谱制备根据质谱选择离子 指导组分收集；其中有机相为甲醇或乙腈，水相为水；

将二维液相色谱制备收集到的山奈酚-3-O-芸香糖苷馏分进行旋转蒸发浓缩 至干，得到山奈酚-3-O-芸香糖苷化合物。

更进一步地说：

所述对保留时间10－30分钟主成分为山奈酚-3-O-芸香糖苷的组分进行收 集，旋转蒸发至干，作为一维制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品。将一维制备山奈 酚-3-O-芸香糖苷粗品用40%－80%的甲醇－水溶液溶解，至浓度为20－200 mg/mL。

更进一步地说：

所述制备时流动相流速为60－120mL/min，制备时柱温为室温或25－ 40℃，制备时进样量为200－3000μL/针，检测器为DAD紫外检测器和质谱 检测器。

更进一步地说：

所述一维制备最佳流动相为乙腈与水，采用梯度方式，乙腈比例由10%经 15－20分钟增加到15%－25%。

所述一维制备收集15－20分钟为主要含山奈酚-3-O-芸香糖苷的组分，一维 制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品用50%－60%的甲醇－水溶液制成浓度为60－ 100mg/mL的山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品溶液。

所述二维制备最佳流动相为乙腈（或含0.1%甲酸）与水（或含0.1%甲酸）， 采用等度条件，乙腈（或含0.1%甲酸）浓度为75－85%，二维制备质谱选择离 子为m/z＝303和287，收集m/z=287的馏分。

更进一步地说：

所述制备时流动相最佳流速为80－100mL/min，制备时柱温为室温，制备 时进样量为2000－2500μL/针，紫外检测器为360nm。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明与现有技术相比具有 以下特点：

1）、山奈酚-3-O-芸香糖苷纯度高。本发明采用二维液相色谱－质谱方法， 具有分离制备的正交性而达到互补分离，因此得到的山奈酚-3-O-芸香糖苷纯度 高，可以达到80%以上。

2）、方法简单易行，操作简便。本发明所涉及的制备高纯度山奈酚-3-O-芸 香糖苷的方法，仪器自动化程度高，操作方便、简单，常温常压下就可进行， 适合大规模生产的需要。

3）、药材来源广，易获得，价格便宜。银杏是我国特有的珍贵树种，占全 世界资源的70%，银杏叶的总产量每年在2×107kg以上，资源极大丰富。

三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂作为应用时间久、疗效明确、使用安全 的中药注射剂，有着广泛的应用，而本发明制得的山奈酚-3-O-芸香糖苷是三九 牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂中一种重要的原料。而本发明提供的制备方法， 过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生 产的要求，可用于舒血宁注射液、银杏叶酊剂原料山奈酚-3-O-芸香糖苷的制备。

具体实施方式

实施例：

本发明是以银杏叶提取物为原料，采用二维液相色谱－质谱技术制备山奈 酚-3-O-芸香糖苷的方法，山奈酚-3-O-芸香糖苷的纯度可以达到80%以上。

本发明为从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-芸香糖苷的方法，步骤如下：

1）、银杏叶提取物溶于40%－80%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液， 银杏叶提取物浓度为10－1000mg/mL，最佳银杏叶提取物溶于50－60%的甲醇 －水溶液，银杏叶提取物浓度最佳为250－550mg/mL。

2）、采用液相色谱进行一维制备的色谱柱为反相C18，二维制备的色谱柱为 亲水型TECys色谱柱。

3）、一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈（有机相）与水（水相） 混合，洗脱条件按照有机相15－65%等度或0－30分钟有机相由5%提高到60% 梯度进行。一维制备最佳流动相为乙腈（或含0.1%甲酸）与水（或含0.1%甲酸）， 采用梯度方式，有机相比例由10%经15－20分钟增加到15－25%。

4）、对保留时间10－30分钟主成分为山奈酚-3-O-芸香糖苷的组分进行收 集，旋转蒸发至干，作为一维制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品。将一维制备山奈 酚-3-O-芸香糖苷粗品用甲醇－水溶解，至浓度为20－200mg/mL。一维制备最 佳收集时间为15－20分钟，为主要含山奈酚-3-O-芸香糖苷的组分，浓缩至浓度 为60－100mg/mL。

5）、对一维收集浓缩后的样品，进行二维液相色谱制备。采用的流动相为 甲醇或乙腈与水混合，洗脱条件按照有机相70－90%等度或经0－20分钟有机 相由95%降低到55%梯度进行。二维制备最佳流动相为乙腈与水，采用等度条 件，乙腈浓度为75－85%；二维制备根据质谱选择离子指导组分收集，质谱选 择离子为m/z＝303和287，收集m/z=287的馏分。

6）、制备时流动相流速为60－120mL/min，制备时柱温为室温或25－40℃， 制备时进样量为200－3000μL/针，检测器为DAD紫外检测器和质谱检测器， 质谱选择离子指导组分收集；最佳流速为80－100mL/min，柱温为室温，进样 量为2000－2500μL/针，紫外检测器为360nm。

7）、将二维液相色谱制备收集到的山奈酚-3-O-芸香糖苷馏分旋转蒸发浓缩 至干，得到高纯度的山奈酚-3-O-芸香糖苷化合物。

以下是根据本发明的内容，给出的三种实施例。

实施例1：

称取银杏叶提取物10g，溶于50mL40%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提 取物溶液，浓度为200mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。 一维液相色谱采用Xterra C18，流动相采用乙腈为有机相，水为水相，梯度洗脱 方式：有机相浓度由10%经20分钟提高到25%。采用DAD紫外检测器360nm 选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为500μL/针，流动相流速为90mL/min， 收集28－30分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-芸香 糖苷粗品。用50%的甲醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品，浓度为80 mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为TECys流动相选 择乙腈为有机相，水为水相，采用70%有机相等度洗脱。采用DAD紫外检测器 360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为303和287，制备温度为室温，进 样量为1000μL/针，流动相流速为90mL/min，收集m/z为287的馏分，旋转蒸 发至干，得到山奈酚-3-O-芸香糖苷化合物，经液相色谱分析，纯度为99.5%， 一维制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品中山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量为30%。

实施例2：

称取银杏叶提取物1g，溶于100mL80%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提 取物溶液，浓度为10mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。 一维液相色谱采用Xterra C18，流动相采用甲醇为有机相，水为水相，有机相浓 度为65%等度，采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为40℃， 进样量为200μL/针，流动相流速为60mL/min，收集10－11分钟的馏分，进行 旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品。用40%的甲醇－水 溶液溶解山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品，浓度为20mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行 二维液相色谱制备，色谱柱为TECys，流动相选择甲醇为有机相，水为水相， 采用梯度洗脱方式，有机相浓度由95%经20分钟降低到55%。采用DAD紫外 检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为303和287，制备温度为室 温，进样量为1000μL/针，流动相流速为100mL/min，收集m/z为287的馏分， 旋转蒸发至干，得到山奈酚-3-O-芸香糖苷化合物，经液相色谱分析，纯度为85%， 一维制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品中山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量为10%。

实施例3：

称取银杏叶提取物100g，溶于200mL 50%的甲醇－水溶液，制得银杏叶 提取物溶液，浓度为500mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制 备。一维液相色谱采用Xterra C18，流动相采用甲醇为有机相，水为水相，采用 15%有机相等度方式洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备 温度为30℃，进样量为3000μL/针，流动相流速为120mL/min，收集22－25 分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品。 用60%的甲醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品，浓度为80mg/mL，经微 孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为TECys，流动相选择甲醇为有 机相，水为水相，采用90%有机相等度洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选 择吸收波长，质谱选择离子m/z为303和287，制备温度为25℃，进样量为3000 μL/针，流动相流速为120mL/min，收集m/z为287的馏分，旋转蒸发至干， 得到山奈酚-3-O-芸香糖苷化合物，经液相色谱分析，纯度为80%，一维制备山 奈酚-3-O-芸香糖苷粗品中山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量为9%。

实施例4：

称取银杏叶提取物100g，溶于100mL40%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提 取物溶液，浓度为1000mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制 备。一维液相色谱采用Xterra C18，流动相采用甲醇为有机相，水（含0.1%甲 酸）为水相，采用梯度：有机相浓度由5%经30分钟提高到60%，采用DAD紫 外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为25℃，进样量为2000μL/针，流动 相流速为80mL/min，收集15－18分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一 维制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品。用80%的甲醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-芸香 糖苷粗品，浓度为50mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱 柱为TECys，流动相选择甲醇为有机相，水为水相，采用5%有机相浓度洗脱。 采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为303和287， 制备温度为40℃，进样量为200μL/针，流动相流速为60mL/min，收集m/z为 287的馏分，旋转蒸发至干，得到山奈酚-3-O-芸香糖苷化合物，经液相色谱分 析，纯度为92%，一维制备山奈酚-3-O-芸香糖苷粗品中山奈酚-3-O-芸香糖苷的 含量为15%。

所属技术领域的技术人员应该悉知，本发明的技术方法不仅仅限于从银杏 叶提取物中制备山奈酚-3-O-芸香糖苷，还可以应用于其它药材山奈酚-3-O-芸香 糖苷的提取。

三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂作为应用时间久、疗效明确、使用安全 的中药注射剂，有着广泛的应用，而本发明制得的山奈酚-3-O-芸香糖苷是三九 牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂中一种重要的原料。而本发明提供的制备方法， 过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生 产的要求，可用于舒血宁注射液、银杏叶酊剂原料山奈酚-3-O-芸香糖苷的制备。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，单本 发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺 流程才能实施。对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助 成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。