山柰酚-3-O-芸香糖苷对血管平滑肌细胞增殖、迁移及TGFBR1信号通路激活的影响

摘要

血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)位于血管壁中膜,是构成血管壁的主要细胞之一。VSMC向内膜下迁移和增殖是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的重要发病机制之一。VSMC向内膜下迁移和增殖促进粥样斑块的形成和发展,动脉粥样硬化斑块的稳定与VSMC的增殖和迁移密切相关。抑制VSMC增殖和迁移延缓动脉粥样硬化进展。
　　转化生长因子β受体1(Transforming growth factor beta receptor1,TGFBRl)是转化生长因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)的特异性受体,参与TGF-β的生理病理过程。TGF-β是一种多功能细胞因子,通过TGFBR1信号通路调节细胞增殖,细胞迁移,基质合成,钙化和免疫应答,参与动脉粥样硬化的发生发展。动脉粥样硬化患者中TGFBR1表达上调,部分学者提出了把TGFBR1作为动脉粥样硬化早期诊断的生物学标志物。
　　山柰酚-3-O-芸香糖苷(Kaempferol-3-O-rutinoside,KR)是红花的提取成分之一。红花是常用的活血化瘀药之一,具有活血祛瘀、通经止痛的功效,临床常用于血瘀相关性心血管系统疾病的治疗。现代药理研究发现,红花及其多个成分具有抗动脉粥样硬化作用,如红花黄色素、红花酚苷等。研究发现,KR具有降压、减慢心率和抑制脂肪合成的作用。目前国内外尚未见KR对VSMC增殖和迁移的作用和机制的报道。
　　目的：
　　探讨山柰酚-3-O-芸香糖苷对血管平滑肌细胞增殖、迁移及TGFBR1信号通路激活的影响
　　方法：
　　1.A7R5细胞培养
　　A7R5细胞培养在含10％胎牛血清、青霉素50U/mL、链霉素50U/mL的DMEM高糖培养基中,在37℃5％CO2的恒温培养箱中培养,每2d换液1次,待细胞长满至60％-70％左右单层时传代。
　　2.MTT法检测细胞活力
　　取对数生长期的A7R5细胞,以每孔5,000个细胞接种于96孔板,每组设置5个复孔,不同浓度KR刺激24h后,每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT液,继续孵育4h。弃上清,每孔加入200μL DMSO,脱色摇床震荡10min,结晶溶解后用酶标仪于570nm测定吸光度。
　　3.EdU染色检测细胞增殖
　　取对数生长期的A7R5细胞,以每孔5,000个细胞接种于96孔板,不同浓度KR刺激24h后。每孔加入50μL4％多聚甲醛室温固定细胞30min;弃上清,每孔加入100μL1×Apollo染色30min;弃上清,每孔加入100μL1×Hoechst33342反应液,避光、室温、脱色摇床孵育30min;每孔每次加入100μLPBS清洗1-3次;荧光显微镜观察,每孔随机选择3个视野,计算EdU染色阳性细胞的比例。
　　4.Transwell细胞迁移实验
　　取对数生长期的A7R5细胞,以每孔105个细胞接种于Transwell上室,上室每孔加入200μL纯DMEM培养基,下室加500μL含10％胎牛血清的DMEM培养液,不同浓度KR刺激24h后,用棉球抹去上室细胞,用4％多聚甲醛固定5min,PBS洗2次,结晶紫染色10min,PBS洗2次,每次5min,光镜下观察迁移到滤膜下室面的A7R5细胞并计数。
　　5.分子对接
　　从PDB蛋白结构数据库获得TGFBR1(PDB ID：1PY5)的模拟分子结构。从PubChem Compound数据库取得KR(CID：5318767)的3D分子结构。采用Autodock VINA软件进行分子对接模拟,在分子对接前去除原始空间结构中的水和配体。采用软件YASARA进行能量最小化。用已知的TGFBR1抑制剂的结合位点预测TGFBR1与KR之间的关系。将TGFBR1与KR进行分子对接,采用结合力评估结合能力的大小。采用Pymol2.7和Chimera1.8.1软件进行3D作图。
　　6.Western Blot检测
　　不同浓度KR刺激24h后,各组细胞经预冷的PBS洗涤后加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液提取蛋白。各组蛋白样品定量后经10％的SDS-PAGE凝胶电泳分离后,转移至硝酸纤维素膜上。5％BSA室温下封闭2h,加入Ⅰ抗,4℃下孵育过夜,第二日Ⅱ抗室温孵育1h,TBST洗涤3次,每次5min。加入ECL发光液100μL,在MiniGel成像系统进行显影,用ImageJ软件进行半定量分析。
　　7.统计方法
　　所有实验数据均采用SPSS19.0统计软件进行处理,以均数加减标准差(mean±SD)表示,多个样本均数间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,以P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.KR剂量及时间依赖性的抑制平滑肌细胞增殖
　　将不同浓度的KR(10、20、40μM)刺激A7R5细胞24h后,MTT观察KR对A7R5细胞增殖的影响。
　　结果显示,KR剂量依赖性抑制A7R5细胞活力,与Control组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。同时,将KR(40μM)与A7R5细胞孵育24、48和72h,MTT观察KR对A7R5增殖的影响。
　　结果显示,KR时间依赖性的抑制A7R5细胞数量的增加,与0h组相比差异有统计学意义(P＜0.05）。EdU染色结果显示,KR剂量依赖性的降低EdU阳性细胞数目,与Control组比差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2.KR剂量依赖性的抑制A7R5细胞迁移
　　用不同浓度的KR(10、20、40μM)刺激A7R5细胞24h后,Transwell迁移实验观察KR对平滑肌细胞迁移能力的影响。
　　结果显示,KR剂量依赖性降低A7R5迁移细胞数量,与Control组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3.KR抑制迁移相关蛋白的表达
　　用不同浓度的KR(10、20、40μM)刺激A7R5细胞24h后,Western Blot法检测A7R5迁移相关蛋白MMP2和MMP9表达,结果显示,KR剂量依赖性的降低MMP2的表达,20μM和40μM的KR显著降低MMP9的表达,与Control相比,差异具有统计学意义(P＜0.05）。
　　4.KR与TGFBR1的分子对接模拟
　　采用Autodock vina分子对接方法评价TGFBR1与KR之间的关系。TGFBR1与KR的结合力为-9.804kcal/mol。KR位于TGFBR1抑制剂结合位点之中,KR分别与TGBFR1的SER-280、ARG-215、LYS-335氨基酸残基形成1个氢键,氢键长度分为2.7、2.6、2.5(A),与ASP-290形成3个氢键连接,氢键长度为2.3、2.4、2.6(A)。
　　5.KR对TGFBR1信号通路激活的影响
　　用不同浓度的KR(10、20、40μM)刺激A7R5细胞24h后,Western Blot法检测TGFBR1及其下游Smad2和Smad3的激活水平,结果显示,KR剂量依赖性抑制TGFBR1、Smad2和Smad3的激活,与Control组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05）。
　　结论：
　　KR能抑制VSMC的增殖和迁移,其机制可能与TGFBR1信号通路相关。

目录

摘要

引言

参考文献

第一章 山柰酚-3-O-芸香糖苷对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

第二章 山柰酚-3-O-芸香糖苷对血管平滑肌细胞TGFBR1信号通路激活的影响

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文小结

综述

附录

攻读学位期间成果

致谢

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