作为递送金属的抗癌和抗炎剂的硫脲的金属配合物及其衍生物

摘要

本发明公开了包含

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2010年4月28日提交的美国临时专利申请第61/328,829号的权益。上述临时申请整体内容并入本文中作为参考。

技术领域

本发明涉及铸币金属配合物（coinage metal complexes），特别地，涉及N,N'-二取代的环状硫脲的铸币金属配合物，其可以用作用于治疗癌症和炎性疾病的治疗剂。

背景技术

铸币金属(Au、Ag、Cu)离子显示出独特的生物学活性，其可以被利用从而得到用于抗关节炎（anti-arithric）、抗微生物和抗癌治疗的有效治疗剂。^1-6然而，裸M⁺离子在生理条件下是不稳定的，并且它们的不稳定性（诸如由沉淀、需氧氧化和还原引起的）可以通过使用合适的辅助配位体来克服。在文献中，膦配位体用于开发具有生物活性的d¹⁰金属化合物，尽管它们也是具有细胞毒性的。^7-9最近的工作也已经见证了新的配位体系统，诸如N-杂环聚炔（carbenes）。^10-13

硫脲配位体在配位化学中被广泛地引证，并且近来在新的金属催化剂领域已经受到了强烈的关注。然而，对金属-硫脲配合物的生物学研究却少见。本发明涉及N, N’-二取代的环状硫脲的铸币金属配合物，其对癌细胞递送了显著的细胞毒性，并且特别地，金(I)硫脲配合物显示出对抗癌药物靶标硫氧还蛋白还原酶的有力的紧密结合抑制。

发明内容

在一个方面，本发明提供了具有式Ia或Ib的金属硫脲配合物

其中R₁可以是H、取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基或杂环基；R₂可以是H、取代的或未取代的烷基、烯基、炔基或芳基；n = 1-4；X^-是药学上可接受的阴离子；并且M是铸币金属。

在另一个方面，本发明提供了具有式IIa或IIb的金属硫脲配合物:

其中R₁可以是H、取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基或杂环基；R₂可以是H、取代的或未取代的烷基、烯基、炔基或芳基；n = 1-4；X^-是药学上可接受的阴离子；M是铸币金属；L可以是卤代、烃硫基（thiolate）、硫脲、亚胺、胺、咪唑、膦或聚炔；并且m是金属硫脲配合物的正电荷的数目。

在另外的方面中，本发明提供了包含上面提及的配合物和药学上可接受的赋形物的药物组合物。

仍在另一个方面中，本发明提供了用于通过施用有效量的包含在药学上有效的赋形物中的上面提及的配合物的组合物治疗癌症或炎性病症患者的方法。

仍在另一个方面中，本发明提供了上面提及的金属硫脲配合物在制备用于治疗癌症或炎性病症患者的药物中的用途。

附图说明

图1展示了根据本发明的优选方面的1,3-双(4-甲氧基苯基)咪唑烷-2-硫酮的金属配合物（M(TU)₂Y）的结构，其中M代表Au、Ag或Cu；并且Y^-代表Cl^-、OTf^-或PF₆^-。

图2展示了根据本发明的一个方面的硫脲配位体的一种合成途径。

图3展示了配合物1（[Au(TU)₂]Cl）的ORTEP图，其中为了清楚的目的而省略了Cl^-离子。

图4展示了配合物2（[Ag(TU)₂]OTf）的ORTEP图，其中为了清楚的目的而省略了三氟甲磺酸根离子（Triflate ion）。

图5展示了根据本发明的实验用配合物2（[Ag(TU)₂]OTf）和AgNO₃处理的细胞的Ag摄取的结果。

图6展示了用配合物1或2处理1小时的HeLa细胞的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、谷胱甘肽还原酶(GR)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性，其中配合物1和2分别代表[Au(TU)₂]Cl和[Ag(TU)₂]OTf。

图7展示了抑制用1（[Au(TU)₂]Cl）预孵育的TrxR的动力学分析。A展示了相对稳态速度对1（[Au(TU)₂]Cl）的浓度所作的图；并且B展示了K_i’对DNTB底物的浓度所作的图。

图8展示了通过1（[Au(TU)₂]Cl）抑制TrxR的时间依赖性。A展示了大鼠TrxR在不存在或存在1（[Au(TU)₂]Cl）的情况下的发展曲线（Progress curve）；并且B展示了k_app对1（[Au(TU)₂]Cl）的浓度所作的图。

图9展示了通过NADPH的TrxR的预还原对通过根据本发明的一个方面的金属硫脲配合物的酶抑制的作用。

图10展示了通过BIAM标记探通（Probing）用或不用1（[Au(TU)₂]Cl）处理的TrxR的游离-SH和Se-H的结果。

具体实施方式

定义

如本文所用，“烷基”意图包括具有1-14个碳原子，优选1-10个碳原子，更优选1-6个碳原子，并且最优选1-4个碳原子的支链和直链的饱和脂肪族烃基。例如，“C₁-C₁₀烷基”中的C₁-C₁₀定义为包括直链或支链排列的具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳的基团。例如，“C₁-C₁₀烷基”具体包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等等。

如本文所用，术语“烯基”是指直链的、支链的或环状的非芳族烃基，其含有2-10个碳原子，优选2-6个碳原子，并且更优选2-4个碳原子，以及至少一个碳碳双键。优选存在一个碳碳双键，并且可以存在至多四个非芳族碳-碳双链。因此，“C₂-C₆烯基”表示具有2-6个碳原子的烯基。烯基包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、2-甲基丁烯基和环己烯基。烯基的直链的、支链的或环状的部分可以包含双键并且可以是取代的（如果表明是取代的烯基）。

如本文所用，术语“炔基”是指直链的、支链的或环状的烃基，其含有2-10个碳原子，优选2-6个碳原子，并且更优选2-4个碳原子，以及至少一个碳碳三键。可以存在至多三个碳碳三键。因此，“C₂-C₆炔基”表示具有2- 6个碳原子的炔基。炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、3-甲基丁炔基等等。炔基的直链的、支链的或环状的部分可以包含三键并且可以是取代的（如果表明是取代的炔基）。

如本文所用，“芳基”意图表示4-14个，优选4-10个，更优选4-6个原子的任何稳定的单环或双环碳环，其中至少一个环为芳族的。这样的芳基元素的实例包括苯基、萘基、四氢萘基、茚满基和联苯（biphenyl）。如果芳基取代基为双环的并且一个环是非芳族的，其应被理解为是通过芳环连接的。

如本文所用，术语“杂环”或“杂环基”意图表示3-14元，优选3-10元，更优选3-6元非芳族的杂环，其含有选自O、N和S的1-4个杂原子，并且包括双环基团。为了本发明的目的，术语“杂环的”也被认为是与术语“杂环”和“杂环基”的意义是一样的，并且其被理解为具有在本文中所列举的定义。

上述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基取代基可以是取代的或未取代的，除非另有具体定义。所述取代基可以例如选自OH、氧代、卤素、C_1-6烷氧基、二(C_1-6)烷基氨基或C_3-10杂环基。

如本领域技术人员所理解的那样，本文所用的“卤代”或“卤素”意图包括氯、氟、溴和碘。

如本文所用，术语“药学上可接受的阴离子”意图包括卤离子（halide），例如氯离子（chloride）、溴离子（bromide）和碘离子（iodide）；磷酸根（phosphate），例如六氟磷酸根（hexafluorophosphate）；以及硫酸根（sulphate），例如三氟甲磺酸盐（triflate）。

如本文所用，术语“铸币金属”意图包括Au、Ag和Cu等等。

金属硫脲配合物

在一个方面，本发明提供了具有式Ia或Ib的金属硫脲配合物：

其中R₁可以是H、取代的或未取代的烷基、烯基、炔基、芳基或杂环基；R₂可以是H、取代的或未取代的烷基、烯基、炔基或芳基；n = 1-4；X^-是药学上可接受的阴离子；并且M是铸币金属。

本文描述的是由N,N’-二取代的环状硫脲配位体支持的一组Au(I)、Ag(I)和Cu(I)配合物的生物学活性，所述配位体的一个实例为1,3-双(4-甲氧基苯基)咪唑烷-2-硫酮(TU) (图1)。

其中M表示Au⁺、Ag⁺或Cu⁺；并且Y表示Cl^-、OTf^-或PF₆^-。

这些为通式[M(TU)₂]Y的均配配合物（homoleptic complexes），其中M为Au(I)、Ag(I)或Cu(I)离子。[Au(TU)₂]Cl (在下文中缩写为配合物1或仅缩写为1)和[Ag(TU)₂]OTf (在下文中缩写为配合物2或仅缩写为2)的分子结构已经由X射线衍射晶体分析法（X-ray crystallography）确定。图3和4展示了这两种配合物的ORTEP图；并且同时，下表1和2给出了其所选择的键长和键角。

在线性配位几何中，在每种情况下的M⁺离子经由硫孤对（sulfur lone pair）被两个硫脲配位体配位。S-M-S键角(1，175.1°；2，172.7°)和M-S键长(1，2.236?；2，2.407?)类似于在相关的具有其它硫脲配位体的Au(I)和Ag(I)配合物(分别为：1，2.278-2.406?；2，166.7-180°)中发现的那些。^14, 15 没有在1 (>3.32 ?)和2 (3.29 ?)中发现近的分子间M···M距离，这暗示分子间金属-金属相互作用是弱的。

所有固态的金属硫脲配合物在空气中是稳定的、可溶的（作为10 mM 于DMSO中的溶液）并保持稳定性，在72 h时间期间内具有可忽略的光谱变化。当将这些配合物以至多30 μM加入到补充血清的细胞培养基中时没有发生沉淀。

研究了金属硫脲配合物对一组癌细胞系的生长的作用并且结果可以例如在表3（其将会在随后进行讨论）中看出。

长期以来Au(I)的治疗潜力已经吸引了大量的关注。例如，Au(I)-硫醇盐（金硫基丁二酸盐（aurothiomalate））或Au(I)-膦（金诺芬）是缓和疾病的抗关节炎药，并且最近已经对其抗癌性质进行了研究。^16, 17 本发明的发明人已经检查了1在接种有NCI-H460非小细胞肺癌细胞的小鼠中的体内抗癌活性，并且结果可以例如在表4（其将会在随后进行讨论）中看出。

Au(I)化合物的作用的精确的分子机理仍尚需阐明，但并不限于与巯基（特别是具有低的pK_a值的那些）之间的容易进行的配体交换（facile ligand exchange）。^18, 19 在这点上，硫氧还蛋白还原酶(TrxR)是Au(I)的令人瞩目的（compelling）分子靶标。^20, 21哺乳动物TrxR为NADPH依赖性的、包含硒代半胱氨酸的，其在癌症进展和炎性疾病中发挥关键作用，并且该酶的抑制剂被认为是有希望的治疗剂。^22, 23。

发明人进行了初步的体外酶测定，其显示使用大约等摩尔浓度的1获得了对TrxR(1 nM)的半数最大抑制，这暗示了抑制的紧密结合模式。通过发展曲线分析(图8)对此进行了进一步的研究。^24, 25 向含有在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的0.2 mM NADPH、1 nM TrxR和3 mM 二硫化物（disulfide）底物5,5’-联硫基双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)的反应混合物中加入过量(3-100 nM)的1。产物浓度的变化的时间过程（在各种浓度的1的情况下）展示于图8A中。发展曲线是非线性的，这揭示了对于缓慢发生的紧密结合抑制而言典型的两相平衡。这一点使用方程式1(实施例6)来分析，其中P为产物浓度，v_i和v_f分别为起始的和最终的稳态速度，并且k_app为用于确定最终的稳态抑制的视在一级比率常数（apparent first-order rate constant）。将k_app对抑制剂浓度作图，得到双曲函数(图8B)。这表明了两步的、紧密结合抑制的机理：

其中EI为初始碰撞复合物，k₃为正向异构化速率（forward isomerization rate），并且k₄为反向异构化速率（reverse isomerization rate）。在该图示中，结合包含了初始碰撞复合物(EI)的快速形成，所述初始碰撞复合物(EI)随后经历异构化形成最终的缓慢解离的酶-抑制剂复合物(EI*)。初始碰撞复合物EI (Ki`)的k₃、k₄和解离常数可以通过将数据拟合至方程式2来获得。相应地，k₃ = 0.011 s^-1、k₄ = 0.00014 s^-1且K_i = 1.39 nM。因此，紧密结合抑制基本上是不可逆的，并且事实上在通过超滤除去游离的抑制剂之后酶活性不能被恢复。总的抑制常数K_i*被确定为18 pM（使用方程式3）。这些抑制常数也与从在当EI*是用K_i =0.67 nM和K_i*= 36 pM (图7)完成的条件下建立的稳态速率定律确定的相应的值合理地相近。因此，1 为所报道的那些中最有效的TrxR抑制剂。^20, 23。

还原的（reduced）TrxR在C-末端活性位点具有游离的-SH (Cys496)和-SeH (Sec497)基团，使其容易受到Au(I)的进攻。^20, 22, 23 这些氧化还原反应活性位点可以用生物素化的碘乙酰胺(BIAM)来探测，所述碘乙酰胺(BIAM)将游离-SH和-SeH基团烷基化；并且所得加成物可以通过蛋白质印迹(western blot)实验使用连接抗生蛋白链菌素的辣根过氧化物酶来检测(图10)。^26, 27 已经证实通过调节pH这些残基可以选择性地被BIAM烷基化。在pH 8.5时，-SH和-SeH均被烷基化。在pH 6.5时，由于硒代半胱氨酸的低的pKa值，仅有-SeH被烷基化，并且因此在该情况下获得更弱的抗生蛋白链菌素信号。当用1 (4 μM)预孵育NADPH还原的TrxR (0.1 μM)时，在pH 8.5和pH 6.5 (用0.1 M Tris.HCl缓冲)时的BIAM标记均被抑制，这暗示硒代半胱氨酸或者还有在活性位点处的半胱氨酸残基与酶的失活有关。这与以下观察相一致：与具有-S-Se-基团的氧化的TrxR相比，NADPH还原的TrxR（其暴露游离的-SH和-SeH基团）受到了1的有效得多的抑制(图9)。很有可能紧密的酶-抑制剂复合物(EI*)的形成包含了氧化还原反应活性硒代半胱氨酸和半胱氨酸残基的共价修饰（通过Au(I)配合物）。²⁸。

总之，硫脲配位体支持的d¹⁰ 金属配合物在具有生物学活性的基于金属的配合物的开发中代表了新的范例。特别地，本发明的发明人已经证实了Au(I)硫脲配合物提供了对硫氧还蛋白还原酶（具有在所报道的之中最低的效力）的特异性的紧密结合抑制，²³并且显示出对细胞TrxR活性的有效的抑制。通过改变硫脲配位体，金属硫脲配合物具有成为新的一类基于金属的药物前导物（drugs leads）的前景。

本发明进一步提供了包含本发明的配合物和药学上可接受的赋形物的药物组合物。仍在另一个方面中，本发明提供了用于通过施用有效量的包含在药学上有效的赋形物中的本发明的配合物的组合物治疗癌症或炎性病症患者的方法。仍在另一个方面中，本发明提供了本发明的金属硫脲配合物在制备用于治疗癌症或炎性病症患者的药物中的用途。

实施例

提供的实施例意图帮助进一步理解本发明。采用的具体材料、种类（species）和条件意图说明本发明并且并不对其合理的范围构成限制。

实施例1

金属硫脲配合物的合成

图2展示了硫脲配位体1,3-双(4-甲氧基苯基)咪唑烷-2-硫酮的合成途径的方案。

材料

根据文献方法^29, 30制备Au(THT)Cl和[Cu(CH₃CN)₄]PF₆。

硫脲配位体

乙二醛-双-(4-甲氧基苯基)亚胺³¹

在25℃向对甲氧基苯胺(12.3g，0.1 mol)于EtOH(50 mL)中的溶液中加入40%乙二醛的水溶液(7.3g，0.05 mol)、EtOH (10 mL)和水(10 mL)的混合物。将混合物在搅拌过夜25℃。加入水(30 mL)之后立即沉淀出黄色固体，将其通过过滤收集并在真空中干燥。收率：5.5 g (82%)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.42(s, 2H), 7.32(d, J = 9.0, 4H), 6.96(d, J = 9.0, 4H), 3.84 (s, 6H)。¹³C NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 160.2, 158.0, 143.4, 123.4, 115.0, 55.9。

N,N’-双-(4-甲氧基苯基氨基)乙烷³¹

在0℃将乙二醛-双-(4-甲氧基苯基)亚胺(1.34g，5 mmol)于THF(30 mL)和MeOH(5 mL)的混合物中的混悬液用硼氢化钠(0.76 g，20 mmol)处理。将混合物在25℃搅拌过夜，随后在回流状态下加热2 h。加入冰-水(30 mL)和3M HCl (30 mL)之后立即沉淀出白色固体，将其通过过滤收集并在真空中干燥。收率：1.2 g (88%)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.79(d, J = 8.92, 4H), 6.62(d, J = 8.92, 4H), 3.75(s, 6H), 3.34 (s, 4H)。¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 152.8, 142.7, 115.4, 114.9, 56.2, 44.9。

硫脲1,3-双(4-甲氧基苯基)咪唑烷-2-硫酮(TU)³²

在25℃向N,N’-双-(4-甲氧基苯基氨基)乙烷(1.4 g，5 mmol)在干THF (40 mL)中的溶液中加入1,1’-硫代羰基二咪唑(1.1 g，6 mmol)。将混合物搅拌过夜并且随后在回流状态下加热2 h。在加入水和乙酸乙酯之后，将有机层用烯HCl和盐水洗涤，干燥并浓缩。通过从95% EtOH中重结晶获得纯净的产物。收率：1.1 g (70%)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.42(d, J = 8.96, 4H), 6.95(d, J = 8.96, 4H), 4.10(s, 4H), 3.82 (s, 6H)。¹³C NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 182.6, 158.6, 134.3, 127.6, 114.6, 55.9, 50.3. FAB-MS: 315 [M+H]⁺。

与硫脲配位体的金属配合物

(1) [Au(TU)₂]Cl

在氩气气氛下向TU (0.31 g，1 mmol)的CH₂Cl₂ (5 mL)溶液中加入于蒸馏过的MeOH (5 mL)中的Au(THT)Cl (0.16 g，0.5 mmol)。将混合物在室温搅拌过夜并且随后过滤。将滤液放置过夜。收集无色晶体并在真空中干燥。收率：76%。FAB-MS: m/z = 826 [M]⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.38(d, J = 8.33, 4H), 7.42(d, J = 8.35, 4H), 4.21(s, 4H), 3.77(s, 6H)。IR (KBr, cm^-1): 2960(w), 2929(w), 2835(w), 1606(m), 1515(s), 1283(m), 1252(s), 1162(m), 1029(m), 836(s), 554(m)。AuC₃₄H₃₆N₄O₄S₂Cl的分析计算值：C, 47.42；H, 4.21；N, 6.51；实测值：C, 47.12；H, 4.00；N, 6.53。

(2) [Ag(TU)₂]OTf

在氩气气氛下将硫脲TU(0.31 g，1 mmol)溶解于EtOH (10 mL)中并加入三氟甲磺酸银(0.13 g，0.5 mmol)。将混合物在室温搅拌3 h，并且随后过滤以除去未反应的AgOTf。将滤液放置过夜。收集无色晶体并在真空中干燥。收率：82%。FAB-MS: 736 [M]⁺。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.33(d, J = 8.94, 4H), 6.93(d, J = 8.91, 4H), 4.21(s, 4H), 3.71(s, 6H)。IR (KBr, cm^-1): 2961(w), 2930(w), 2839(w), 1605(w), 1512(s), 1275(s), 1250(s), 1165(m), 1032(m), 831(s), 555(m)。AgC₃₅H₃₆N₄O₇S₃F₃的分析计算值：C, 47.46；H, 4.10；N, 6.33；实测值：C, 47.41；H, 4.15；N, 6.36。

(3) [Cu(TU)₂]PF₆

在氩气气氛下将硫脲 TU (0.31 g，1 mmol)溶解于CH₂Cl₂ (10 mL)中并加入于蒸馏过的MeOH (10 mL)中的[Cu(CH₃CN)₄]PF₆ (0.19 g，0.5 mmol)。将混合物在室温搅拌2h。将所得白色固体过滤并用MeOH、Et₂O洗涤并在真空中干燥。收率：80%. FAB-MS: 692 [M]⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.46(d, J = 8.97, 4H), 6.96(d, J = 8.90, 4H), 4.10(s, 4H), 3.76(s, 6H)。IR (KBr, cm^-1): 2969(w), 2934(w), 2838(w), 1606(m), 1514(s), 1287(m), 1252(s), 1166(m), 1030(m), 838(s), 556(m)。CuC₃₄H₃₆N₄O₄S₂PF₆的分析计算值：C, 48.77；H, 4.33；N, 6.69；实测值：C, 48.12；H, 4.00；N, 6.32。

实施例3

细胞毒性测定

将细胞以20,000细胞/孔（在150 μL生长培养基溶液中）接种于96-孔平底微量培养板中。将化合物溶解于二甲亚砜中。将每种配合物的连续稀释液加入到每个孔中，并且DMSO的终浓度≤1%。将微量培养板在增湿培养箱中在37℃，5% CO₂，95%空气条件下孵育72 h。孵育之后，将10 μL MTT试剂(5 mg/mL)加入到每个孔中。将微量培养板在37℃在5% CO₂中再孵育4 h。将增溶溶液(10% SDS，于0.01 M HCl中) (100 μL)加入到每个孔中。将微量培养板在培养箱中放置24 h。在550 nm的吸光度用酶标仪（microplate reader）测量。确定了IC₅₀值(与对照相比将吸光度降低50%所需的浓度)。

正如可以从上表中看出的那样，所有的金属配合物在低的微摩尔浓度时发挥出细胞毒性，具有与基准抗癌药物顺铂可比的或更低的半数最大抑制浓度(IC₅₀)。无金属的硫脲配位体的IC₅₀超过100 μM，这暗示金属配合物的生物学活性主要是由金属介导的，并且亲脂性硫脲配位体起金属离子到细胞中的无毒载体的作用。为了验证该观点，还进行了下述的实施例。

实施例4

金属被细胞的摄取

将HeLa细胞(2×10⁵细胞/孔)用培养基(2 mL/孔)接种于12-孔板中并在5% CO₂/95%空气的气氛下在37℃孵育24 h。然后除去培养基并用含有2和AgNO₃ (10 μM)的新鲜培养基替换。暴露2 h后，除去培养基并将细胞单层用PBS洗涤三次。将细胞用水溶胞（lysed）并在80℃在70% HNO₃中消化2 h。将消化液用水稀释至10 mL以用于电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)分析。

正如可以从图5中看出的那样，数据揭示了2处理的HeLa细胞中的Ag含量为用AgNO₃处理的5倍高。此外，就HeLa细胞而言，2的细胞毒效力也是AgNO₃(IC₅₀ = 32.1 ± 1.2 μM)的几乎5倍高。

实施例5

硫醇（thiol）依赖性氧化还原酶的细胞活性(图6)

细胞提取物的制备

将细胞以2 x 10⁵/孔接种于6孔板中并孵育24 小时。将金属硫脲化合物(10^-9至10^-4 M)连续稀释并加入到细胞(最终的DMSO浓度≤1%)中。在1小时的孵育后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤三次并将100 μL冰冷的溶胞缓冲液(50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4），1 mM EDTA，0.1% Triton-X 100)加入到细胞层中。在冰上进行5分钟的细胞溶胞并将细胞溶胞产物收集并储存在-80℃或立即进行测定。

硫氧还蛋白还原酶 (TrxR)

将细胞溶胞产物(10 μg蛋白)加入到含有100 mM磷酸盐（pH 7.4）、1 mM EDTA和0.2 mM NADPH的混合物(100 μL)中。通过加入5,5’-联硫基双(2-硝基苯甲酸) (DTNB，最终3 mM)启动反应并且将TrxR活性确定为10 min内O.D._412 nM的增加。

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)

将细胞溶胞产物(10 μg蛋白)加入到含有100 mM磷酸盐（pH 7.4）、2 mM GSH、1 U 谷胱甘肽还原酶和0.2 mM NADPH的混合物中。通过加入叔丁基氢过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide）(300 μM) 启动反应并将NADPH氧化测量为10 min内O.D._340 nm的降低。通过减去在不存在叔丁基氢过氧化氢的情况下自发的NADPH氧化确定GPx活性(ΔO.D._340nm/min)。

谷胱甘肽还原酶(GR)

将细胞溶胞产物(10 μg蛋白)将加入到含有100 mM磷酸盐（pH 7.4 ）、1 mM EDTA、1 mM GSSG和0.2 mM NADPH的混合物中。通过加入DTNB (最终3 mM)启动反应并测量O.D._412 nm的增加10 min。通过减去在不存在GSSG的情况下O.D._412 nm的增加确定GR活性。

结果可以在图6中看到。如图6所示，用1处理HeLa癌细胞1小时导致细胞TrxR活性的抑制，具有50 nM 的IC₅₀值。另一种含有硒代半胱氨酸的硫醇酶（thiol enzyme）（即谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)）也被1抑制（尽管是在更高的浓度(IC₅₀ =1 μM)）。谷胱甘肽还原酶(GR)活性未受到1的影响。为了比较，Ag(I)硫脲配合物2抑制TrxR和GPx（分别具有100 nM和1 μM 的IC₅₀），其与配合物1具有几乎类似的效力，并且当以50 μM加入时同样显著地抑制GR活性。所有的酶活性都未受到Cu(I)配合物3或以至多100 μM加入的无金属的硫脲配位体的影响。这些数据表明在铸币M⁺离子中，Au(I)优先地靶向含有硒代半胱氨酸的酶。

实施例6

硫氧还蛋白还原酶被Au-TU的紧密结合抑制的动力学分析

得自形成的酶-抑制剂复合物的残余活性的抑制常数(K_i)的确定^33,34 (图7)

将1 nM重组大鼠TrxR1 (ICMO Corp, Sweden)用0.2 mM NADPH还原，然后在缓冲液（100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和1 mM EDTA）中与0.3-10 nM的1孵育30 min。使用0.75、1.5或3 mM DTNB测量残余活性(图7A)。使用GraphPad Prism 3.0软件将数据拟合至方程式1中。

(1) v_s/v_o = (E_t-K_i-I_t + ((I_t+ K_i’-E_t)²+ (4K_i E_t))^1/2)/(2E_t)

方程式1描述了在抑制剂浓度由于酶-抑制剂复合物的形成而被基本上耗尽的情况下紧密结合抑制的速率定律。在该方程式中，v_o为在不存在抑制剂的情况下观察到的速度，v_s为在抑制剂的存在下的稳态速度，E_t为总酶浓度，并且I为抑制剂浓度。由此得到的表观抑制常数（apparent inhibitory constant）(K_i)为0.67 nM。使用方程式2，计算得出平均抑制常数(K_i^*)为36 pM (图7B)（考虑了酶与底物的竞争性抑制以及预先确定的0.2 mM 的K_m）。

(2) K_i = K_i^*(1+S/K_m)。

通过发展曲线分析确定K_i^35, 36 (图8)

向含有0.2 mM NADPH、1 nM TrxR1、3 mM二硫化物底物5,5’-联硫基双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)、100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和1 mM EDTA的反应混合物中加入过量 (3-100 nM) 的1。产物浓度的变化的时间过程展示于图8A中。发展曲线是非线性的，显示出对于缓慢发生的紧密结合抑制而言典型的两相平衡。使用GraphPad Prism 3.0 软件将数据拟合至方程式1中，

(1) P = v_ft + ((v_i -v_f)/k_app)(1-e^-kappt)

其中P为产物浓度，v_i和v_f分别为起始的和最终的稳态速度，并且k_app为用于确定最终的稳态抑制的视在一级比率常数。将k_app对抑制剂浓度作图，得到双曲函数(图8B)。这表明了两步的、紧密结合抑制的机理：

其中EI为初始碰撞复合物，k₃为正向异构化速率，并且k₄为反向异构化速率。在该图示中，结合包含了初始碰撞复合物(EI)的快速形成，所述初始碰撞复合物(EI)随后经历异构化形成最终的缓慢解离的酶-抑制剂复合物(EI*)。初始碰撞复合物EI (Ki`)的k₃、k₄和解离常数可以通过将数据拟合至方程式2来获得。

(2) k_app= k₄ + k₃I_t(I_t + K_i`(1+S/K_m))

其中I_t为抑制剂浓度，S为底物(DTNB)浓度并且K_m为通过TrxR还原DTNB 的米-曼二氏常数。

相应地，k₃ = 0.011 s^-1，k₄ = 0.00014 s^-1且K_i`= 1.39 nM。总的抑制常数K_i*被确定为18 pM（使用方程式3）。

(3) K_i* = K_i`(k₄/(k₃ + k₄))。

NADPH还原对TrxR1的抑制（通过金属硫脲配合物）的作用(图9)

将1 nM的TrxR1与或不与0.2 mM NADPH在反应缓冲液(100 mM磷酸盐（pH 7.4），1 mM EDTA)中孵育5 min。加入金属硫脲配合物(1-100 nM)并将其孵育30 min。然后加入DTNB (3 mM)和NADPH (0.2 mM) 。TrxR1活性被确定为10 min内O.D._412 nm的增加。

实施例7

探通TrxR1的半胱氨酸和硒代半胱氨酸残基^10-12 (图10)

将NADPH还原的TrxR1 (0.1 μM)和1 (4 μM) 在反应缓冲液(100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4），1 mM EDTA)中在室温孵育1 h。取出1 μL的反应混合物并加入到含有19 μL的100 μM BIAM (分别在pH 6.5和8.5用200 mM Tris-HCl缓冲)的新的试管中。孵育在37℃进行30 min以烷基化酶的残余的游离-SeH和-SH基团。将20 μL的反应混合物与加样缓冲液混合并进行SDS-PAGE（在7.5%凝胶上）。将分离的蛋白转移到硝化纤维素膜上并用连接有抗生蛋白链菌素的辣根过氧化物酶和增强化学发光检测法检测BIAM标记的蛋白。

实施例8

裸小鼠中的肿瘤移植和体内药物治疗(表4)

体内实验在Pearl Materia Medica Development (Shenzhen) Limited 中进行并在得到Committee on the Use of Live Animals for Teaching and Research 的许可的情况下实施。购买了SPF级四周龄雌性BALB/c AnN-nu小鼠(裸小鼠，16 - 18 g)。将再悬浮于RPMI培养基中的肿瘤细胞(5×10⁶)通过皮下注射移植到小鼠的右侧胁腹（right flank）。当肿瘤为大约50 mm³大小时，将动物随机分成3组以接受一周两次的腹膜内注射10% PET赋形物对照(其中10% PET = 6% 聚乙二醇400、3%乙醇、1%吐温80和90% PBS)、配合物1 (100 mg/kg)或环磷酰胺(30 mg/kg)的治疗达8次。28天后，将小鼠处死并将肿瘤分离和称重。

正如可以从表4中看出的那样，在28天治疗后与赋形物对照相比，以100 mg/kg体重一周两次地腹膜内注射配合物1导致肿瘤大小减少了(38% ± 11，n = 5)。

尽管上述说明书教导了本发明的原理，并且为了说明的目的而提供了实施例，但应理解本发明的实践涵盖了在所附权利要求及其等价物的范围之内的所有通常的变化、调整和/或修饰。

参考文献

下述参考文献并入本文中作为参考：

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