一种大豆改良胚尖转化方法

摘要

本发明涉及一种大豆改良胚尖转化方法。利用农杆菌介导，真空渗透辅助外源基因导入，带一片子叶的胚尖转化方法。包括如下步骤：获得大豆带一片子叶的外植体，利用农杆菌真空渗透辅助侵染与共培养，转化得到转基因大豆。所述大豆的外植体为无菌水浸泡萌发后去掉种皮，一片子叶和原叶的胚尖；所述的侵染方法为真空渗透辅助侵染，0.05MPa压力5-8分钟，28℃黑暗环境下150r/min振荡侵染1h。本发明提供了利用带一片子叶的胚尖为受体建立大豆遗传转化体系的方法，不经过组织培养阶段，可在较短时间内获得再生植株，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和实践意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用农杆菌介导的大豆改良胚尖转化方法。 

背景技术

大豆「Glycine  max (L.)Merr.」原产我国，是重要的经济作物之一，其营养价值极高，蛋白质含量可达40％，而且品质好，易溶于水，最易被人体吸收利用，属全价蛋白，是唯一能代替动物性食品的植物产品。但是大豆产量和品质却容易受到病、虫、草害的影响。人们试图基因工程手段改良大豆，使其抗逆能力增强。但是用于转基因大豆的再生系统一直是此领域的难点之一。人们对大豆组织培养再生体系的研究可以追朔到20世纪60年代，到80年代才有突破性进展。其再生体系一般可分为两种，一种是器官发生途径，另一途径是体细胞胚的发生。到目前为止，大豆再生体系仍普遍存在再生率低、重复性差、基因型依赖强、培养条件烦琐等问题，在很大程度上限制了利用基因工程手段对大豆的遗传改良。因此，建立高效、简便的再生体系，对大豆生物技术育种取得突破性进展具有重要意义。 

在大豆植物组织培养研究与再生体系的研究中，先后有人选用胚轴、子叶节、胚尖、幼嫩子叶、原生质、花粉等不同的外植体进行了大豆再生研究，它们均有各自的优缺点。胚轴、子叶节、胚尖再生系统用时短，再生频率高，操作简单，不过易形成嵌合体，后期的检测、鉴定、筛选工作量大。幼嫩子叶、原生质、花粉再生体系，用时长，再生频率低，转化困难。 

2004年Liu等首次报道了利用胚尖再生系统进行农杆菌介导的遗传转化，其再生效率高达87.7％，远高于子叶节再生体系的40.3％和下胚轴再生体系的56.4％。 

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆改良胚尖转化方法。利用农杆菌介导，真空渗透辅助外源基因导入，带一片子叶的胚尖转化方法。本方法中带一片子叶的胚尖经过6-BA预培养诱导后，利用农杆菌真空渗透辅助侵染，共培养后直接转到营养土中培养即可获得高频的再生植株，该方法取材方便，不需要经过组织培养阶段，无严格的灭菌要求，再生率高、操作简单、生长周期短，是良好的遗传转化受体系统。 

本发明提供一种大豆改良胚尖转化方法包括的步骤：大豆外植体的获得；农杆菌菌液制备；真空渗透辅助侵染与共培养；转化外植体再生；移栽、筛选；具体为 

（1）    大豆外植体的获得

    挑取种皮完整、无病斑且干燥的成熟大豆种子，用氯酸钠：浓盐酸=10：1在乐扣杯中制造氯气，灭菌4-6h，超净工作台中通风使氯气散尽后加适量无菌水，25-28℃黑暗环境中浸泡萌发12-15 h 。

取吸胀萌动的大豆种子，在无菌滤纸上吸取多余水分，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，去掉一片子叶和原叶，保留完整胚和另一片子叶， 获得带一片子叶的胚尖外植体，将外植体胚尖向上竖直插入预培养基中预培养24 -28h。预培养基: MS + 30g/L 蔗糖 + 1 mg/L 6- BA + 7 g/L琼脂， pH 5. 8。 

（2）    农杆菌菌液制备 

    在超净工作台中，用无菌移液器从 LB 培养平板(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)上吸取含有质粒 pSOY12 的农杆菌单菌落接种于 LB 液体培养基中(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)，28℃，200 r/min振荡培养过夜，然后以1：10-20进行2次活化，培养至 OD600 = 1. 0左右，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25℃离心10min收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，调整OD600 = 0. 5 左右作为工程菌液备用。LB 培养基: 10 g/L胰蛋白胨 + 5 g/L酵母提取物 + 10g/LNaCl， pH7. 0， 固体LB培养基另加15 g/L。   

（3）    真空渗透辅助侵染与共培养

将预培养 24 h 已转绿的外植体从培养基中取出，加入预先制备好的工程菌液，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟，28℃黑暗环境下150 r/min振荡侵染1 h ，弃去菌液，将外植体近轴面朝下置于固体共培养培养基中， 26-28℃黑暗环境下共培养3 d。16 h /8 h( L/D) 的光照条件下培养1-3d。共培养培养基: MS+ 30 g/L蔗糖 + 1 mg/L6- BA + 200 mol·L^－1 乙酰丁香酮， pH 5. 8，固体共培养培养基另加7 g/L琼脂。

（4）    转化外植体再生 

将外植体从培养基中取出， 用无菌水彻底冲洗干净后种植于穴盘中，营养土：蛭石：珍珠岩=2：2：1，光照培养箱中培养，待长出4-6 片叶片后移栽至温室中生长。

（5）    筛选，PCR检测 

当小苗在土壤中长出4-7片新叶，用除草剂150mg/L草甘膦涂抹叶片，筛选出有抗性的植株。采用CTAB法提取筛选为阳性的植株的基因组DNA，进行目的基因的PCR检测，目的基因检测的上下游引物序列分别为：上游：GCTGGCCATCGACGAGTTC，下游：GGCCAGGAAGTTCGGGAAG，序列长328bp（见序列表）。PCR反应体系为1μL基因组DNA，2.5μL 10×PCR buffer，2μL dNTPs ( 2.5μM ) ，1.25U LA Taq 酶， 加水至25μL。PCR 反应程序：94℃：3 min：94℃ 30s，55℃30 s，72℃30s，30个循环；72℃10 min。

本发明提供的大豆改良胚尖转化方法是利用带一片子叶的胚尖为受体建立大豆遗传转化体系的方法，不经过组织培养阶段，可直接转到营养土中培养即可获得高频的再生植株，该方法取材方便，不需要经过组织培养阶段，无严格的灭菌要求，再生率高、操作简单、生长周期短，是良好的遗传转化受体系统，用于大豆基因工程的基本操作系统，对于大豆品质改良具有重要的理论和实践意义。 

  

附图说明

图1为大豆种子氯气灭菌。 

图2为大豆外植体预培养示意图。 

图3为农杆菌侵染大豆外植体。 

图4为大豆外植体与农杆菌共培养。 

图5为穴盘中再生的大豆植株。 

图6为移栽的大豆植株。 

图7为成活的大豆植株。 

图8为除草剂150mg/L草甘膦涂抹叶片筛选，a为野生型对照，b可恢复病斑判断为阳性。 

图9为含目的基因EPSPS 的pSOY12质粒图谱。 

图10 为吉育91转EPSPS基因PCR检测电泳图。 

具体实施方式

实施例

菌株、质粒：实验中所用的农杆菌为C58菌株，重组质粒载体为pSOY12，由浙江大学生命科学学院植物科学研究所寿惠霞教授实验构建并提供（见中国优秀硕士学位论文全文数据库，周正剑，抗草甘膦转基因大豆体系的优化[D]. 浙江大学，2011；CN201110303049.0），质粒上构建有目的基因EPSPS和标记基因Bar。将保存的C58农杆菌感受态从-80℃冰箱拿出，置于冰上，取出2μL pSOY12质粒与农杆菌200μL混匀，冰浴5min，放入预冷的电击杯中，1500V，电击转化。将菌液吸入1.5mL EP管中，加入500μL YEP培养基，于27℃振荡暗培养4h，4000r/min，28℃，离心收集菌体，弃500μL上清，重悬菌体，涂板于27℃培养2天，筛选出已转化的农杆菌菌株。 

（1）大豆外植体的获得 

     以吉育91为受体材料，挑取种皮完整、无病斑且干燥的成熟大豆种子，用氯酸钠：浓盐酸=10：1在乐扣杯中制造氯气，灭菌4-6h，超净工作台中通风使氯气散尽后加适量无菌水，25-28℃黑暗环境中浸泡萌发12-15 h 。

取吸胀萌动的大豆种子，在无菌滤纸上吸取多余水分，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，去掉一片子叶和原叶，保留完整胚和另一片子叶， 获得带一片子叶的胚尖外植体，将外植体胚尖向上竖直插入预培养基中预培养24 h。预培养基: MS + 30g/L 蔗糖 + 1 mg/L 6- BA + 7 g/L琼脂， pH 5. 8。 

（2）农杆菌菌液制备 

    在超净工作台中，用无菌移液器从 LB 培养平板(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)上吸取含有质粒 pSOY12 的C58农杆菌一个菌落，接种于 LB 液体培养基中(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)， 28℃， 200 r/min振荡培养过夜，然后以1：10-20进行2次活化，培养至 OD600 = 1. 0左右，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25℃离心10min收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，调整OD600 = 0. 5 左右作为工程菌液备用。LB 培养基: 10 g/L胰蛋白胨 + 5 g/L酵母提取物 + 10g/LNaCl， pH7. 0， 固体LB培养基另加15 g/L。   

（3）真空渗透辅助侵染与共培养

将预培养 24 -28h 已转绿的外植体从培养基中取出，加入步骤（2）制备的工程菌液，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟，25-28℃黑暗环境下150 r/min振荡侵染1-3 h ，取出大豆外植体，将外植体近轴面朝下置于固体共培养培养基中， 26-28℃黑暗环境下共培养3 d。16 h /8 h( L/D) 的光照条件下培养1d。共培养培养基: MS+ 30 g/L蔗糖 + 1 mg/L6- BA + 200 mol·L^－1 乙酰丁香酮， pH 5. 8，固体共培养培养基另加7 g/L琼脂。

（4）转化外植体再生 

将外植体从培养基中取出， 用无菌水彻底冲洗干净后种植于穴盘中，营养土：蛭石：珍珠岩=2：2：1，光照培养箱中培养，待长出4-6 片叶片后移栽至温室中生长。

（5）筛选，PCR检测 

当小苗在土壤中长出4-7片新叶，用除草剂150mg/L草甘膦涂抹叶片，筛选出有抗性的植株。采用CTAB法提取筛选为阳性的植株的基因组DNA，进行目的基因的PCR检测，目的基因检测的上下游引物序列分别为：上游：GCTGGCCATCGACGAGTTC，下游：GGCCAGGAAGTTCGGGAAG，序列长328bp，见序列表。PCR反应体系为1μL基因组DNA，2.5μL 10×PCR buffer，2μL dNTPs ( 2.5μM ) ，1.25U LA Taq 酶， 加水至25μL。PCR 反应程序：94℃：3 min：94℃ 30s，55℃30 s，72℃30s，30个循环；72℃10 min。

图10 吉育91转EPSPS基因PCR检测电泳图:泳道1为质粒pSOY12阳性对照，泳道2为水阴性对照，泳道3为野生型对照，4-24为转基因植株，其中泳道17有约300bp亮带，为PCR阳性。泳道25为Marker Ⅲ。 

  

表1 吉育91转pSOY12基因实验数据

实验重复侵染数再生植株除草剂筛选阳性PCR阳性Ⅰ200173662Ⅱ200154571Ⅲ200184873

结果：利用大豆改良胚尖真空渗透辅助的外源基因转化方法，对吉育91进行了农杆菌转化。三次生物学重复(共600颗种子)获得511再生植株，除草剂筛选出具有抗性植株210株。转基因阳性植株经PCR检测，证明6株为阳性植株，转化率为2.8%。

序列表

<110>  天津大学

 

<120>  一种大豆改良胚尖转化方法

 

<130>  20120725

 

<160>  3

   

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

 

<211>  328

 

<212>  DNA

 

<213>  人工序列

<220>

<221>  gene

 

<222>  (1)..(328)

 

<400>  1

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<210>  2

 

<211>  19

 

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220>

<221>  gene

 

<222>  (1)..(19)

 

<400>  2

 

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<210>  3

 

<211>  19

 

<212>  DNA

 

<213>  人工序列

<220>

 

<221>  gene

 

<222>  (1)..(19)

 

<400>  3

 

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