一种基于纳米粒子的肿瘤细胞主动靶向给药体系及其构建方法

摘要

本发明涉及一种基于纳米粒子的肿瘤细胞主动靶向给药体系及其构建方法，其特征在于该肿瘤细胞主动靶向给药体系是以具有光催化性能的纳米粒子为载体，经物理吸附或化学键合的方式而得到的靶向分子/纳米粒子/化疗药物复合物，其中纳米粒子和靶向分子的摩尔比为50∶1～20∶1，纳米粒子和化疗药物的摩尔比为50∶1～10∶1。本发明将化疗药物、靶向分子、光催化性能纳米粒子结合在一起，赋予纳米粒子载药体系对肿瘤细胞的主动靶向能力，有效降低化疗药物的副作用，应用该体系可以实现化疗药物的可控释放与逆转肿瘤细胞多药耐药性，并且构建方法简单易行，成本低廉，利于工业化生产和市场推广。

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料与生物医药科学交叉领域，涉及一种基于纳米粒子的肿瘤细胞 主动靶向给药体系及其构建方法，应用该体系实现化疗药物的可控释放与逆转肿瘤细胞 多药耐药性。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病。目前临床主要通过手术、放疗、化疗以及 中医药等几种方法来治疗恶性肿瘤。其中，化疗作为一种全身性治疗手段，对杀灭肿瘤 细胞、抑制肿瘤扩散具有积极作用。但传统的化疗药物为细胞毒药物，在杀死肿瘤细胞 的同时，对正常细胞也有不同程度的伤害，尤其是伤害人体内生长旺盛的血液、淋巴细 胞等，破坏人体的免疫系统，影响患者的生存质量。严重的化疗副作用往往导致癌症患 者心、肝、肺、肾脏等多脏器受损、抑制骨髓细胞的生长，导致患者免疫力低下、身体 衰弱、肿瘤复发甚至引起其他疾病，威胁患者的生命，是导致肿瘤化疗失败的主要原因 之一。因此，构建特异性靶向于肿瘤细胞的给药控释系统是解决化疗副作用的最有效途 径之一。此外，困扰恶性肿瘤治疗的另一难题是肿瘤细胞的耐药性。根据耐药谱的不同， 肿瘤细胞的耐药性可分为原药耐药和多药耐药。原药耐药是指肿瘤细胞对一种药物产生 耐药性后，对其他非同一类型的药物仍然敏感；多药耐药是指肿瘤细胞对一种药物产生 耐药性后，对其他非同一类型药物也产生耐药性。肿瘤细胞耐药性的机制非常复杂，涉 及多种酶、蛋白的参与及DNA修复性能的改变。p糖蛋白是多药耐药性肿瘤细胞表达 的一种蛋白，在药物敏感肿瘤细胞内则不表达，是一种能量依赖性药物排出泵。该蛋白 为跨膜蛋白，在ATP供能的情况下，将药物分子从肿瘤细胞内泵到细胞外，使细胞内药 物分子的浓度不断下降直至消除。因此，多药耐药是肿瘤化疗失败的另一主要原因。

纳米TiO₂是一种宽禁带n型半导体材料，其锐态矿型带隙能为3.2eV，相当于波 长为387nm的光子能量(T.Rajh，et al，J.Phys.Chem.B，2002，106：10543-10552.)。当纳 米TiO₂受到能量大于或等于带隙能的光线或射线照射后，会在价带和导带上分别产生 强氧化性的光生空穴(h⁺)和强还原性的光生电子(e^-)。当处于水溶液中的纳米TiO₂受到激发后，会产生反应活性很高的氢氧自由基和活性氧类分子等光生自由基(黄金樵， 山东大学耳鼻喉眼学报，2008，22(5)：416-420.)。生物组织处于水溶液环境中，上述 自由基和活性氧能够破坏生物组织，导致细胞的死亡，因此，纳米TiO₂已被广泛地用 于肿瘤细胞的光动力治疗研究中。广义上讲，纳米TiO₂对肿瘤细胞的光动力治疗也是 一种细胞毒治疗，因此，构建靶向于肿瘤细胞的纳米TiO₂光动力治疗系统可有效避免 对正常组织的损伤。缪文良等将肿瘤细胞特异性抗体组装到纳米TiO₂上，形成肿瘤细 胞的靶向性抗体复合物，通过电穿孔技术将该复合物导入到肿瘤细胞内，通过紫外光激 发，发现该复合物可大幅地提高纳米TiO₂对肿瘤细胞的杀伤效率和选择性(授权国家： 中国，公布日期：2006年9月27日，专利号：CN200610050483.1，名称：用于杀伤肿 瘤细胞的靶向性抗体复合物及其制备方法)。Tzu-Ying Lai等将叶酸分子(一种肿瘤细胞 靶向分子)吸附到纳米TiO₂上，形成叶酸-TiO₂复合物，通过紫外光激发，发现与单纯的 纳米TiO₂相比，该复合物可提高肿瘤细胞的死亡效率(Tzu-Ying Lai et al，Journal of  Photochemistry and Photobiology A：Chemistry，2009，(204)：148-153.)。Elena A. Rozhkova等将胶质母细胞瘤的特异性抗体通过共价键结合于纳米TiO₂表面，形成纳米 共聚物，通过可见光激发，发现该纳米共聚物对肿瘤细胞的毒性明显高于单纯的纳米 TiO₂(Elena A.Rozhkova，NANO LETTERS，2009，9(9)：3337-3342)。上述关于纳米TiO₂对肿瘤细胞治疗的研究均属于光动力治疗范畴，而传统的化疗药物仍然是临床治疗恶性 肿瘤的主要方法，因此，将纳米TiO₂作为化疗药物缓释载体的研究也引起了人们的兴 趣。H.Arora等报道，将表柔比星通过共价结合方式搭载到Fe₃O₄TiO₂纳米复合物上， 可以提高耐药性肿瘤细胞对化疗药物的摄入量(H.Arora，International Journal of  Radiation Oncology，Biology Physics，2009，75(3)：S564-S565.)。Kevin C.-W.Wu等人将 TiO₂纳米介孔材料作为表柔比星的载体，并研究了表柔比星的缓释动力学和抗肿瘤效 果，发现以TiO₂纳米介孔材料作为载体的药物具有良好的缓释效果，并且抗肿瘤效果 明显高于单独给药对照组(Kevin C.-W.Wu，Chem.Commun.，2011，47：5232-5234.)。 Ying Qin等比较了表柔比星通过不同方式(共价结合或物理吸附)搭载到TiO₂纳米粒子 上对肿瘤细胞的毒性，结果显示，药物与TiO₂纳米粒子共价结合后，其对肿瘤细胞的 毒性明显降低，而药物通过物理吸附搭载到TiO₂纳米粒子后，对肿瘤细胞的毒性高于 单独的给药对照组。(Ying Qin，et al，Journal of Materials Chemistry，First published on  the web 13 Oct 2011.)。然而，目前将TiO₂纳米粒子作为化疗药物载体的研究并不多。

综上所述，由于化疗是目前临床治疗恶性肿瘤的重要方法，因此，以TiO₂纳米粒 子作为化疗药物载体的研究正在开展中。值得注意的是，化疗药物毕竟是细胞毒药物， 化疗副作用必然会制约基于TiO₂纳米粒子载药体系的研究与应用。因此，构建特异性 主动靶向于肿瘤细胞的TiO₂纳米载药系统是解决该问题的必然出路。然而到目前为止， 并没有相关研究的报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种基于纳米粒子的肿瘤细胞主动靶向 给药体系，该体系可以实现化疗药物的可控释放与逆转肿瘤细胞多药耐药性。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种基于纳米粒子的肿瘤细胞主动靶向 给药体系的构建方法，该方法以纳米粒子为基体，将化疗药物、靶向分子与纳米粒子结 合为一体，具有简单易行，成本低廉的特点。

本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种基于纳米粒子的肿瘤细 胞主动靶向给药体系，其特征在于该肿瘤细胞主动靶向给药体系是以具有光催化性能的 纳米粒子为载体，经物理吸附或化学键合的方式而得到的靶向分子/纳米粒子/化疗药物 复合物，其中纳米粒子和靶向分子的摩尔比为50∶1～20∶1，纳米粒子和化疗药物的摩 尔比为50∶1～10∶1。

所述纳米粒子为氧化钛基纳米粒子、氧化锆基纳米粒子或者前述两者复合纳米粒 子，其形貌为球形、棒状、核壳或非核壳复合结构，粒径为1～100nm。

所述靶向分子为肿瘤细胞特异性靶向分子叶酸、叶酸类似物氨甲喋呤、氨基蝶呤或 者肿瘤细胞膜表面特异性抗体。

所述化疗药物为表柔比星、多柔比星、伊达比星或吡柔比星。

本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种前述基于纳米粒子的肿 瘤细胞主动靶向给药体系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将纳米粒子分散到超纯水中，通氮气搅拌0.5小时～12小时，得到浓度为0.1～ 1000mM纳米粒子水溶液；

2)将浓度为0.1～50mM的靶向分子溶液逐滴加入到纳米粒子水溶液中，避光，通 氮气搅拌2～72小时；然后采用离心的方法，去除未吸附到纳米粒子上的靶向分子，得 到靶向分子/纳米粒子复合物；

3)将靶向分子/纳米粒子复合物重新分散到超纯水中并搅拌均匀；将浓度为0.1～ 10mM的化疗药物溶液逐滴加入到靶向分子/纳米粒子复合物水溶液中，避光，搅拌1～ 24小时；然后采用离心的方法，去除未吸附到纳米粒子上的化疗药物分子，获得靶向分 子/纳米粒子/化疗药物复合物，即基于纳米粒子的肿瘤细胞主动靶向给药体系；

或者步骤为：

1)将纳米粒子分散到超纯水中，通氮气搅拌0.5小时～12小时，得到浓度为0.1～ 1000mM纳米粒子水溶液；

2)将浓度为0.1～10mM的化疗药物溶液逐滴加入到纳米粒子水溶液中，避光，通 氮气搅拌1～24小时，然后采用离心的方法，去除未吸附到纳米粒子上的化疗药物，得 到化疗药物/纳米粒子复合物；

3)将化疗药物/纳米粒子复合物重新分散到超纯水中并搅拌均匀；将浓度为0.1～ 50mM的靶向分子溶液逐滴加入到化疗药物/纳米粒子复合物水溶液中，避光，搅拌2～ 72小时；然后采用离心的方法，去除未吸附到纳米粒子上的靶向分子，获得靶向分子/纳 米粒子/化疗药物复合物，即基于纳米粒子的肿瘤细胞主动靶向给药体系；

或者步骤为：

1)将纳米粒子分散到超纯水中，通氮气搅拌0.5小时～12小时，得到浓度为0.1～ 1000mM纳米粒子水溶液；

2)将浓度为0.1～50mM的靶向分子溶液、浓度为0.1～10mM的化疗药物溶液分 别逐滴加入到纳米粒子水溶液中，避光，通氮气搅拌，搅拌2～72小时，然后采用离心 的方法，去除未吸附到纳米粒子上的化疗药物和靶向分子，得到靶向分子/纳米粒子/ 化疗药物复合物。

作为改进，所述离心的具体过程为：转速为6000-20000转/分钟，离心时间为3-30 分钟，去除上清液中未被吸附的靶向分子或药物分子，再加入与上清液等量的超纯水， 将沉淀重悬，反复此操作三次以上。

本发明中使用的靶向分子叶酸是一种水溶性B族维生素，与其他肿瘤细胞靶向分 子，如蛋白质类、核酸类靶向分子相比，叶酸的分子量小、无免疫原性、稳定性好、廉 价易得；叶酸受体在多数肿瘤细胞膜表面过度表达，通常比正常细胞表达高出20～200 倍；叶酸受体对叶酸具有很高的特异性与亲合力，可以介导叶酸内陷进入细胞。本发明 利用叶酸与肿瘤细胞表面叶酸受体特异性结合，通过配体-受体相互作用，以细胞膜内 陷的形式将靶向分子/纳米粒子/化疗药物纳米复合物主动摄入到肿瘤细胞内，实现肿瘤 细胞的靶向给药，降低化疗药物对正常细胞和组织的毒性。本发明使用的靶向分子也可 以是叶酸类似物氨甲蝶呤或氨基蝶呤，氨甲蝶呤与氨基蝶呤均为抗肿瘤药物，在介导靶 向分子/纳米粒子/化疗药物纳米复合物内陷进入细胞的同时，还可以提供抗肿瘤药物组 分。本发明使用的靶向分子还可以是针对不同肿瘤表面抗原的特异性抗体分子，抗体与 受体结合后，通过受体介导的内吞作用，将靶向分子/纳米粒子/化疗药物纳米复合物摄 入肿瘤细胞内。

本发明中使用的化疗药物载体为具有光催化能力的氧化钛基纳米粒子、氧化锆基纳 米粒子或其复合纳米粒子，当其在水中受到能量大于或等于带隙能的光线照射后，会产 生光生自由基。由于人体内为水环境，当靶向分子/纳米粒子/化疗药物复合物被耐药性 肿瘤细胞摄入后，通过紫外线或者其他短波长射线照射肿瘤部位，激发纳米粒子产生光 生自由基，切断药物分子与纳米粒子表面的结合位点，将药物释放到肿瘤细胞内；当药 物分子被释放后，多余的光生自由基会破坏包括p糖蛋白等细胞内部结构，使多药耐药 肿瘤细胞失去耐药能力，从而逆转其耐药性。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)将化疗药物、靶向分子、光催化性能纳米粒子结合在一起，赋予纳米粒子载药 体系对肿瘤细胞的主动靶向能力，有效降低化疗药物的副作用；

(2)本发明使用的靶向分子叶酸，其分子量小、无免疫原性、稳定性好、廉价易 得；

(3)本发明中，化疗药物、靶向分子与纳米粒子通过物理吸附或化学键合的方式 结合在一起；

(4)本发明提供一种构建肿瘤细胞主动靶向给药体系的方法，该方法简单易行， 成本低廉，利于工业化生产和市场推广。

附图说明

图1是合成叶酸/TiO₂/表柔比星纳米复合物的示意图；

图2是纳米复合物实物溶液样品图；

图3a、3b是纳米复合物、叶酸及表柔比星溶液的紫外-可见光吸收谱；

图4a、4b、4c是实施例15中，多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM摄入化疗药 物的荧光显微照片；

图5是实施例18中，纳米复合物对多药耐药性乳腺癌细胞MCF-7/ADM的杀伤作 用(MTT法)。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

基于氧化钛基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

(1)合成叶酸/TiO₂纳米复合物：取TiO₂纳米粒子水溶液2mL(TiO₂为球形羟基 氧化钛前驱体，粒径1～2nm，Ti摩尔浓度0.1mM)，通氮气搅拌0.5小时；在搅拌状态 下，逐滴加入0.1mM叶酸溶液0.1mL，避光，搅拌24小时，使叶酸分子充分吸附到TiO₂纳米粒子表面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为10000转 /分钟，离心时间为10分钟，离心后收集上清液中未被吸附的叶酸，再加入与上清液等 量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得叶酸/TiO₂复合物。

(2)合成叶酸/TiO₂/表柔比星纳米复合物：将步骤(1)中获得的叶酸/TiO₂纳米 复合物沉淀中加入2mL超纯水，避光，通氮气搅拌均匀；将0.2mL表柔比星溶液(0.1mM) 逐滴加入到叶酸/TiO₂纳米复合物水溶液，避光，搅拌6小时；搅拌结束后，将混合物 溶液转移到离心管中离心，离心转速为20000转/分钟，离心时间为3分钟，离心后收集 上清液中未被吸附的表柔比星，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心 操作三次，获得叶酸/TiO₂/表柔比星纳米复合物。

实施例2

基于氧化钛基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

(1)合成TiO₂/表柔比星纳米复合物：取TiO₂纳米粒子水溶液1mL(TiO₂为棒状， 粒径100nm，Ti摩尔浓度1000mM)，通氮气搅拌12小时；在搅拌状态下，将2mL表 柔比星溶液(10mM)逐滴加入到TiO₂纳米粒子水溶液，避光，搅拌24小时；搅拌结 束后，混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为15000转/分钟，离心时间为30分 钟，离心后收集上清液中未被吸附的表柔比星，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀 重悬，反复离心操作三次，获得TiO₂/表柔比星纳米复合物。

(2)合成叶酸/TiO₂/表柔比星纳米复合物：将步骤(1)中获得的TiO₂/表柔比星 纳米复合物沉淀中加入4mL超纯水，避光，通氮气搅拌均匀；滴加入2mM叶酸溶液 10mL，避光，搅拌48小时，使叶酸分子充分吸附到TiO₂纳米粒子表面；搅拌结束后， 将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为6000转/分钟，离心时间为20分钟，离 心后收集上清液中未被吸附的叶酸，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复 离心操作三次，获得叶酸/TiO₂/表柔比星纳米复合物。

实施例3

基于氧化钛基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

(1)合成氨基蝶呤/TiO₂纳米复合物：取TiO₂纳米粒子水溶液1mL(TiO₂为球形锐 钛矿，粒径10nm，Ti摩尔浓度500mM)，通氮气搅拌1小时；在搅拌状态下，逐步滴 加入50mM氨基蝶呤溶液0.5mL，避光，搅拌72小时，使氨基蝶呤分子充分吸附到TiO₂纳米粒子表面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为10000转 /分钟，离心时间为20分钟，离心后收集上清液中未被吸附的氨基蝶呤，再加入与上清 液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得氨基蝶呤/TiO₂复合物。

(2)合成氨基蝶呤/TiO₂/表柔比星纳米复合物：将步骤(1)中获得的氨基蝶呤/TiO₂纳米复合物沉淀中加入2mL超纯水，避光，通氮气搅拌均匀；将2mL表柔比星溶液 (10mM)逐滴加入到氨基蝶呤/TiO₂纳米复合物水溶液，避光，搅拌16小时；搅拌结 束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为15000转/分钟，离心时间为10 分钟，离心后收集上清液中未被吸附的表柔比星，再加入与上清液等量的超纯水，将沉 淀重悬，反复离心操作三次，获得氨基蝶呤/TiO₂/表柔比星纳米复合物。

实施例4

基于氧化钛基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

(1)合成TiO₂/表柔比星纳米复合物：取TiO₂纳米粒子水溶液1mL(TiO₂为棒状， 粒径8nm*2nm，Ti摩尔浓度100mM)，通氮气搅拌6小时；在搅拌状态下，将2.5mL 表柔比星溶液(4mM)逐滴加入到TiO₂纳米粒子水溶液，避光，搅拌12小时；搅拌结 束后，混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为10分 钟，离心后收集上清液中未被吸附的表柔比星，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀 重悬，反复离心操作三次，获得TiO₂/表柔比星纳米复合物。

(2)合成氨甲蝶呤/TiO₂/表柔比星纳米复合物：将步骤(1)中获得的TiO₂/表柔比 星纳米复合物沉淀中加入4mL超纯水，避光，通氮气搅拌均匀；滴加入2mM氨甲蝶呤 溶液1mL，避光，搅拌36小时，使氨甲蝶呤分子充分吸附到TiO₂纳米粒子表面；搅拌 结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为18000转/分钟，离心时间为 10分钟，离心后收集上清液中未被吸附的氨甲蝶呤，再加入与上清液等量的超纯水，将 沉淀重悬，反复离心操作三次，获得氨甲蝶呤/TiO₂/表柔比星纳米复合物。

实施例5

基于氧化钛基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

(1)合成抗体/TiO₂纳米复合物：取TiO₂纳米粒子水溶液5mL(TiO₂为球形锐钛 矿晶型，粒径20nm，Ti摩尔浓度0.1mM)，通氮气搅拌12小时；在搅拌状态下，逐滴 加入0.1mM抗体溶液0.1mL，避光，搅拌72小时，使抗体充分吸附到TiO₂纳米粒子表 面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为20000转/分钟，离 心时间为15分钟，离心后收集上清液中未被吸附的抗体，再加入与上清液等量的超纯 水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得抗体/TiO₂复合物。

(2)合成抗体/TiO₂/表柔比星纳米复合物：将步骤(1)中获得的抗体/TiO₂纳米复 合物沉淀中加入2mL超纯水，避光，通氮气搅拌均匀；将0.1mL表柔比星溶液(0.5mM) 逐滴加入到抗体/TiO₂纳米复合物水溶液，避光，搅拌72小时；搅拌结束后，将混合物 溶液转移到离心管中离心，离心转速为20000转/分钟，离心时间为5分钟，离心后收集 上清液中未被吸附的表柔比星，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心 操作三次，获得抗体/TiO₂/表柔比星纳米复合物。

实施例6

基于氧化钛基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

合成氨基蝶呤/TiO₂/表柔比星纳米复合物：取TiO₂纳米粒子水溶液8mL(TiO₂为球 形，粒径5nm，Ti摩尔浓度100mM)，通氮气搅拌2小时；在搅拌状态下，将10mL表 柔比星溶液(5mM)逐滴加入到TiO₂纳米粒子水溶液，之后再滴加入5mM氨基蝶呤溶 液5mL，避光，搅拌36小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心 转速为12000转/分钟，离心时间为20分钟，离心后收集上清液中未被吸附的表柔比星 和氨基蝶呤，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得氨 基蝶呤/TiO₂/表柔比星纳米复合物。

实施例7

基于氧化钛基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

合成叶酸/TiO₂/表柔比星纳米复合物：取TiO₂纳米粒子水溶液5mL(TiO₂为球形锐 钛矿结构，粒径50nm，Ti摩尔浓度70mM)，通氮气搅拌12小时；在搅拌状态下，将 10mL表柔比星溶液(3.5mM)逐滴加入到TiO₂纳米粒子水溶液，之后再滴加入1mM 叶酸溶液7mL，避光，搅拌24小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心， 离心转速为18000转/分钟，离心时间为28分钟，离心后收集上清液中未被吸附的表柔 比星和叶酸，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得叶 酸/TiO₂/表柔比星纳米复合物。

实施例8

基于二氧化钛-氧化锆复合基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

合成氨甲蝶呤/TiO₂/多柔比星纳米复合物：取TiO₂-ZrO₂纳米粒子水溶液2.5mL (TiO₂-ZrO₂为核壳复合结构，粒径30nm，Ti摩尔浓度500mM，Zr摩尔浓度500mM)， 通氮气搅拌3小时；在搅拌状态下，将5mL多柔比星溶液(40mM)逐滴加入到TiO₂纳米粒子水溶液，之后再滴加入40mM氨甲蝶呤溶液2.5mL，避光，搅拌24小时；搅 拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为16000转/分钟，离心时间为 30分钟，离心后收集上清液中未被吸附的多柔比星和氨甲蝶呤，再加入与上清液等量的 超纯水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得氨甲蝶呤/TiO₂/多柔比星纳米复合物。

实施例9

基于氧化锆基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

(1)合成叶酸/ZrO₂纳米复合物：取ZrO₂纳米粒子水溶液1ml(ZrO₂为球形，粒径 20nm，锆摩尔浓度50mM)，通氮气搅拌2小时；在搅拌状态下，逐滴加入叶酸溶液(1mM) 2.5ml，避光，搅拌2小时，使叶酸分子充分吸附结合到ZrO₂纳米粒子表面；搅拌结束 后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为6000转/分钟，离心时间为3分钟， 离心后收集上清液中未被吸附的叶酸，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反 复离心操作三次，获得叶酸/ZrO₂复合物。

(2)合成叶酸/ZrO₂/多柔比星纳米复合物：将步骤(1)中得到的叶酸/ZrO₂纳米 复合物沉淀中加入2mL超纯水，避光，通氮气搅拌均匀；将1mL多柔比星溶液(1mM) 逐滴加入到叶酸/ZrO₂纳米复合物水溶液，避光，搅拌1小时；搅拌结束后，将混合物 溶液转移到离心管中离心，离心转速为10000转/分钟，离心时间为3分钟，离心后收集 上清液中未被吸附的多柔比星，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心 操作三次，获得叶酸/ZrO₂/多柔比星纳米复合物。

实施例10

基于氧化锆基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

(1)合成ZrO₂/伊达比星纳米复合物：取ZrO₂纳米粒子水溶液1mL(ZrO₂为棒状， 粒径20nm*5nm，Zr摩尔浓度100mM)，通氮气搅拌2小时；在搅拌状态下，将4mL 伊达比星溶液(0.5mM)逐滴加入到ZrO₂纳米粒子水溶液，避光，搅拌16小时；搅拌 结束后，混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为10000转/分钟，离心时间为30 分钟，离心后收集上清液中未被吸附的伊达比星，再加入与上清液等量的超纯水，将沉 淀重悬，反复离心操作三次，获得ZrO₂伊达比星纳米复合物。

(2)合成叶酸/ZrO₂/伊达比星纳米复合物：将步骤(1)中获得的ZrO₂伊达比星纳 米复合物沉淀中加入4mL超纯水，避光，通氮气搅拌均匀；滴加入1mM叶酸溶液5mL， 避光，搅拌24小时，使叶酸分子充分吸附到ZrO₂纳米粒子表面；搅拌结束后，将混合 物溶液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为20分钟，离心后 收集上清液中未被吸附的叶酸，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心 操作三次，获得叶酸/ZrO₂/伊达比星纳米复合物。

实施例11

基于氧化锆基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

合成氨基蝶呤/ZrO₂/吡柔比星纳米复合物：取ZrO₂纳米粒子水溶液2mL(ZrO₂为 球形，粒径10nm，Zr摩尔浓度10mM)，通氮气搅拌2小时；在搅拌状态下，将2mL 吡柔比星溶液(1mM)逐滴加入到ZrO₂纳米粒子水溶液，之后再滴加入0.5mM氨基蝶 呤溶液1mL，避光，搅拌36小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心， 离心转速为18000转/分钟，离心时间为8分钟，离心后收集上清液中未被吸附的吡柔比 星和氨基蝶呤，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得 氨基蝶呤/ZrO₂/吡柔比星纳米复合物。

实施例12

基于氧化锆基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

合成抗体/ZrO₂/伊达比星纳米复合物：取ZrO₂纳米粒子水溶液0.2mL(ZrO₂为球形， 粒径30nm，Zr摩尔浓度0.5mM)，通氮气搅拌8小时；在搅拌状态下，将0.1mL伊达 比星溶液(0.1mM)逐滴加入到ZrO₂纳米粒子水溶液，之后再滴加入0.1mM抗体溶液 0.05mL，避光，搅拌24小时；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心 转速为10000转/分钟，离心时间为10分钟，离心后收集上清液中未被吸附的伊达比星 和抗体，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得抗体/ ZrO₂/伊达比星纳米复合物。

实施例13

基于二氧化钛-氧化锆复合基纳米粒子的肿瘤细胞靶向给药体系构建方法

(1)合成TiO₂-ZrO₂/多柔比星纳米复合物：取TiO₂-ZrO₂基纳米粒子水溶液3mL (TiO₂-ZrO₂为锆钛非核壳哑铃型复合结构，粒径30nm*15nm，Zr摩尔浓度10mM、Ti 摩尔浓度10mM)，通氮气搅拌1小时；在搅拌状态下，将5mL多柔比星溶液(1mM) 逐滴加入到TiO₂-ZrO₂基纳米粒子水溶液，避光，搅拌8小时；搅拌结束后，混合物溶 液转移到离心管中离心，离心转速为12000转/分钟，离心时间为15分钟，离心后收集 上清液中未被吸附的多柔比星，再加入与上清液等量的超纯水，将沉淀重悬，反复离心 操作三次，获得TiO₂-ZrO₂/多柔比星纳米复合物。

(2)合成氨甲蝶呤/TiO₂-ZrO₂/多柔比星纳米复合物：将步骤(1)中获得的TiO₂-ZrO₂/ 多柔比星纳米复合物沉淀中加入6mL超纯水，避光，通氮气搅拌均匀；滴加入3mM氨 甲蝶呤溶液1mL，避光，搅拌72小时，使氨甲蝶呤分子充分吸附到TiO₂-ZrO₂纳米粒 子表面；搅拌结束后，将混合物溶液转移到离心管中离心，离心转速为10000转/分钟， 离心时间为30分钟，离心后收集上清液中未被吸附的氨甲蝶呤，再加入与上清液等量 的超纯水，将沉淀重悬，反复离心操作三次，获得氨甲蝶呤/TiO₂-ZrO₂/多柔比星纳米复 合物。

实施例14

纳米复合物中叶酸、表柔比星搭载量的计算

(1)将叶酸溶于超纯水中，分别配制成0.3125、0.1562、0.0781、0.0391、0.0195mM 水溶液，测定各浓度叶酸的紫外-可见光吸收谱，根据浓度-吸光度关系，绘制叶酸水溶 液的标准工作曲线，测定实施例1步骤(1)中收集的离心后上清液的紫外-可见光吸 收谱，根据已绘制的叶酸水溶液标准工作曲线，计算离心后上清液中未被吸附的叶酸 浓度，从而获得TiO₂纳米粒子中钛与被吸附叶酸的摩尔比为40∶1。

(2)将表柔比星溶于超纯水中，分别配制成0.3125、0.1562、0.0781、0.0391、 0.0195mM水溶液，测定表柔比星的紫外-可见光吸收谱，根据浓度-吸光度关系，绘制 表柔比星水溶液的标准工作曲线，测定实施例1步骤(2)中收集的离心后上清液的紫 外-可见光吸收谱，根据已绘制的表柔比星水溶液标准曲线，计算离心后上清液中未被 吸附的表柔比星，从而获得TiO₂纳米粒子中钛与被吸附药物的摩尔比为20∶1。

实施例15

多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM对化疗药物的摄入

(1)将实施例1～实施例7获得的靶向分子/TiO₂/化疗药物纳米复合物重悬于2mL 磷酸缓冲液(PBS)中，超声波助溶30分钟，用0.2μm滤膜过滤，获得靶向分子/TiO₂/ 化疗药物纳米复合物的无菌溶液。

(2)用PBS配制相同浓度的化疗药物溶液，作为对照，用0.2μm滤膜过滤后待 用。

(3)取步骤(1)中纳米复合物230μL，溶于2ml DMEM培养基中；取步骤(2) 中相同体积的化疗药物溶液，溶于2mL DMEM培养基中。

(4)取对数生长期的多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为 1×10⁵个/mL，接种于35mm培养皿中，每皿2mL；细胞在5％CO₂、37℃、饱和湿度的 细胞培养箱中培养24小时。

(5)24小时过后，弃掉培养皿中的培养基，在培养皿中分别加入含有纳米复合物、 化疗药物的培养基，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中孵育2～24小时。

(6)弃掉培养液，用PBS溶液清洗培养皿3次，去掉未被细胞摄入的纳米复合物； 4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS溶液清洗3次；用Hoechst33342溶液(1μg/mL) 染色5min，PBS溶液清洗3次。

(7)将细胞培养皿置于荧光倒置显微镜下观察细胞对纳米复合物的摄入。表柔比 星激发波长480nm，发射波长560nm；Hoechst33342激发波长347，发射波长483。

实施例16

多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM对化疗药物的摄入

(1)将实施例9～实施例12获得的靶向分子/ZrO₂/化疗药物纳米复合物重悬于5mL 磷酸缓冲液(PBS)中，超声波助溶60分钟，用0.2μm滤膜过滤，获得靶向分子/ZrO₂/ 化疗药物纳米复合物的无菌溶液。

(2)用PBS配制相同浓度的化疗药物溶液，作为对照，用0.2μm滤膜过滤后待 用。

(3)取步骤(1)中纳米复合物600μL，溶于5ml DMEM培养基中；取步骤(2) 中相同体积的化疗药物溶液，溶于5mL DMEM培养基中。

(4)取对数生长期的多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为 1×10⁵个/mL，接种于35mm培养皿中，每皿2mL；细胞在5％CO₂、37℃、饱和湿度的 细胞培养箱中培养24小时。

(5)24小时过后，弃掉培养皿中的培养基，在培养皿中分别加入含有纳米复合物、 化疗药物的培养基，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中孵育2、4、8、16、24 小时。

(6)弃掉培养液，用PBS溶液清洗培养皿3次，去掉未被细胞摄入的纳米复合物； 4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS溶液清洗3次；用Hoechst33342溶液(1μg/mL) 染色5min，PBS溶液清洗3次。

(7)将细胞培养皿置于荧光倒置显微镜下观察细胞对纳米复合物的摄入。表柔比 星激发波长480nm，发射波长560nm；Hoechst33342激发波长347，发射波长483。

实施例17

多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM对化疗药物的摄入

(1)将实施例7、13中获得的靶向分子/TiO₂-ZrO₂/化疗药物纳米复合物重悬于1mL 磷酸缓冲液(PBS)中，超声波助溶45分钟，用0.2μm滤膜过滤，获得靶向分子/TiO₂-ZrO₂/ 化疗药物纳米复合物的无菌溶液。

(2)用PBS配制相同浓度的化疗药物溶液，作为对照，用0.2μm滤膜过滤后待用。

(3)取步骤(1)中纳米复合物100μL，溶于1ml DMEM培养基中；取步骤(2) 中相同体积的化疗药物溶液，溶于1mL DMEM培养基中。

(4)取对数生长期的多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为 1×10⁵个/mL，接种于35mm培养皿中，每皿2mL；细胞在5％CO₂、37℃、饱和湿度的 细胞培养箱中培养24小时。

(5)24小时过后，弃掉培养皿中的培养基，在培养皿中分别加入含有纳米复合物、 化疗药物的培养基，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中孵育2、4、8、16、24 小时。

(6)弃掉培养液，用PBS溶液清洗培养皿5次，去掉未被细胞摄入的纳米复合物； 4％多聚甲醛固定细胞20分钟，PBS溶液清洗5次；用Hoechst33342溶液(1μg/mL) 染色7min，PBS溶液清洗5次。

(7)将细胞培养皿置于荧光倒置显微镜下观察细胞对纳米复合物的摄入。表柔比 星激发波长480nm，发射波长560nm；Hoechst33342激发波长347，发射波长483。

实施例18

靶向分子/TiO₂/化疗药物纳米复合物对多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM的杀伤 作用(MTT法)

(1)取实施例15步骤(1)、(2)配制的靶向分子/TiO₂/化疗药物纳米复合物溶液 以及相同浓度的化疗药物无菌溶液，待用。

(2)取对数生长期的多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为 1×10⁵个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，细胞在5％CO₂、37℃、饱和 湿度的细胞培养箱中培养24小时。

(3)24小时过后，弃掉培养孔板中的培养基，在培养孔中分别加入含有纳米复合 物、化疗药物的培养基100μl，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中分别孵育 24、48、72小时。

(4)孵育结束前4小时，培养孔中加入20μl MTT(10mg/ml)，孵育4小时；孵 育结束后，每孔加入100μl细胞裂解液，裂解16小时。

(5)酶标仪(550nm)测各孔吸光度，以正常生长的细胞为对照，计算细胞的活 性。计算公式如下：细胞活性(％)＝(处理组细胞的光密度-样品对照组的光密度)/ (正常对照组细胞的光密度-空白对照组光密度)×100％。

实施例19

靶向分子/ZrO₂/化疗药物纳米复合物对多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM的杀 伤作用(MTT法)

(1)取实施例16(1)、(2)配制的靶向分子/ZrO₂/化疗药物纳米复合物溶液以及相 同浓度的化疗药物无菌溶液，待用。

(2)取对数生长期的多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为 1×10⁵个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔50μl，细胞在5％CO₂、37℃、饱和湿 度的细胞培养箱中培养24小时。

(3)24小时过后，弃掉培养孔板中的培养基，在培养孔中分别加入含有纳米复合 物、化疗药物的培养基50μl，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中分别孵育24、 48、72小时。

(4)孵育结束前4小时，培养孔中加入10μl MTT(10mg/ml)，孵育4小时；孵育 结束后，每孔加入100μl细胞裂解液，裂解16小时。

(5)酶标仪(550nm)测各孔吸光度，以正常生长的细胞为对照，计算细胞的活 性。计算公式如下：细胞活性(％)＝(处理组细胞的光密度-样品对照组的光密度)/ (正常对照组细胞的光密度-空白对照组光密度)×100％。

实施例20

靶向分子/TiO₂-ZrO₂/化疗药物纳米复合物对多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM 的杀伤作用(MTT法)

(1)取实施例17步骤(1)、(2)配制的靶向分子/TiO₂-ZrO₂/化疗药物纳米复合 物溶液以及相同浓度的化疗药物无菌溶液，待用。

(2)取对数生长期的多药耐药性人乳腺癌细胞MCF-7/ADM，调整细胞浓度为 1×10⁵个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，细胞在5％CO₂、37℃、饱和 湿度的细胞培养箱中培养24小时。

(3)24小时过后，弃掉培养孔板中的培养基，在培养孔中分别加入含有纳米复合 物、化疗药物的培养基100μl，在5％CO₂、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中分别孵育 24、48、72小时。

(4)孵育结束前4小时，培养孔中加入20μl MTT(10mg/ml)，孵育4小时；孵 育结束后，每孔加入100μl细胞裂解液，裂解16小时。

(5)酶标仪(550nm)测各孔吸光度，以正常生长的细胞为对照，计算细胞的活 性。计算公式如下：细胞活性(％)＝(处理组细胞的光密度-样品对照组的光密度)/ (正常对照组细胞的光密度-空白对照组光密度)×100％。

本发明虽然以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定权利要求，任何本领域 技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做出可能的变动和修改，因此本发 明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。