一种花药培养分子标记检测鉴别烟草Va基因型的方法

摘要

本发明公开了一种花药培养分子标记检测鉴别烟草Va基因型的方法，常用的烟草马铃薯Y病毒（

说明书

技术领域：

本发明属于作物育种技术领域，具体为烟草质量性状抗病性转育的目的基因 型筛选技术。

背景技术:

烟草马铃薯Y病毒病，又称为脉斑病，是由马铃薯Y病毒(Potato virus Y， PVY)引起的蚜传病毒病，在中国北方烟区危害严重，在南方烟区的危害呈上升 趋势。为选育抗病品种，国内外鉴定出多个抗PVY的种质资源，如VAM、V.SCR 等，并育成抗病白肋烟品种TN86、TN90和烤烟品种NC55、NC102等。大部分 抗源的抗性表现为隐性基因（va）控制，是由于对PVY感病的基因缺失造成的。 并开发出与Va位点相关的分子标记（RAPD、SCAR）（Noguchi S.,Mol Gen Genet, 1999,262:822-829;Julio et al.,TheorAppl Genet.2006,112(2):335-346.）。烤烟种质 RY5对PVY坏死株系（PVY^N）的抗性符合孟德尔一对隐性基因控制的质量性状 的遗传模型，已报道与抗病基因对应的显性等位基因位点（Va）紧密连锁的RAPD 标记O12V3₆₉₅与SCAR标记PVYME1（王贵等，分子植物育 种,2012,10(1):97-103）。但缺乏共分离的可区分VaVa与Vava的分子标记，回交 转育va位点时，不能直接利用分子标记辅助选择。通常采用测交方法筛选Vava 单株，每回交一代需要测交并接种筛选一次，比较费时费力。烟草花药培养技术 简便，能在2个月左右培养出单倍体苗。理论上Vava植株的花培单倍体后代，Va 单株与va单株的比例为1:1。因此，采用分子标记检测花培单倍体后代，能快速 鉴定出Va单株与va单株的比例，从而间接鉴定出基因型为Vava的单株。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有测交鉴定VaVa与Vava单株的方法存在之不足， 提供一种花药培养分子标记检测鉴别烟草Va基因型的方法，这是一种新的花药培 养标记检测的方法，能有效提高转育烟草va位点的效率和烟草品种选育效率。

本发明的技术原理为：烟草为二倍体植物，基因型为VaVa的植株，产生Va 的一种雄配子。基因型为Vava的植株，产生Va和va两种雄配子。采用花药培养方 法，可获得单个雄配子发育而成的单倍体苗。通过检测来源于某个单株的一定数 量的单倍体苗中Va和va基因型苗的比例，即可鉴定该单株的Va基因型是否纯合与 杂合。本发明根据烟草花药培养技术简便成熟、烟草抗PVY的va位点对应的Va 位点已有分子标记文献报道，通过组合花药培养和分子标记辅助选择技术，鉴定 烟草Va基因型。

花药培养标记检测与测交接种方法比较，具有节省时间、减少收种工作量、 所需光照培养室的空间很小，日常管理人工少等优点。而采用测交接种方法，需 要对2倍数量的单株收种，并进行育苗、盆栽、接种病原菌、调查抗性分离情况 等一系列工作。由于冬春季气温低，在南方日光型温室中耗时较长（5个月左右）、 育苗、盆栽和接种需要的温室面积较大，日常管理人工多。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

一种花药培养分子标记检测鉴别烟草Va基因型的方法，其特征在于：采集 待鉴定烟草单株的花药，利用花药培养出单倍体苗，检测单倍体苗的标记分离情 况，根据标记分离情况鉴定单株的基因型是否为纯合体和杂合体。

所述的每个待鉴定烟草单株的花药培养出至少4株单倍体苗，取每株单倍体 苗的叶片，提取DNA，检测与烟草PVY抗性基因Va位点紧密相关的RAPD标 记O12V3695与SCAR标记PVYME1，根据标记的实际分离比与理论分离比的 吻合情况，分析单株的Va基因型是否为纯合体和杂合体。

单株花药培养单倍体苗获得：对需要鉴定基因型的单株，采集花冠与花萼等 长的花蕾，每株采集10个左右。参照文献（陈学军等,植物遗传资源学 报,2011,20(1):65-68）花药培养。随机选择10株左右花药培养单倍体苗，转移至 新的生根培养基上，继续培养至约4-5片叶。采集每株单倍体苗的叶片用于Va 分子标记检测。

花药培养单倍体苗分子标记检测：采用市售试剂盒或者CTAB方法提取叶片 总基因组DNA。采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，质 量合格的DNA样品，用0.5×TE溶液稀释至30~50ng/μL，-20℃保存备用。与 PVY抗性紧密连锁的分子标记检测采用下列引物扩增获得，包括但不限于SCAR 标记引物PVYME1（Julio et al.,Theor Appl Genet.2006,112(2):335-346.），目标条 带172bp。RAPD标记O12V3₆₉₅(Noguchi S.,Mol Gen Genet,1999,262:822-829)， 目标条带695bp。引物和PCR试剂购自市售公司。PCR反应在基因扩增仪上进 行。PCR反应体系体积为20μL，其中30~50ng/μL DNA样品2.5μL、10×PCR buffer2.0μL，2.5mM dNTPs2.5μL，10μM引物1.5μL，5U/μL rTaq DNA酶 0.5μL，ddH₂O11.0μL。PVYME1扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性 30sec，62℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸5min，4 ℃保存。

采用琼脂糖凝胶电泳检测标记的目的条带，采用凝胶成像系统记录结果。

单株基因型结果分析：花药培养单倍体苗扩增出Va的目标条带，判断为Va 标记阳性，花药培养单倍体苗未扩增出Va的目标条带，判断为Va标记阴性。 若某个单株的花药培养单倍体苗的Va标记阳性株数与阴性株数的比例符合1:0 的理论分离比，则该单株的基因型为VaVa。若某个单株的花药培养单倍体苗的 Va标记阳性株数与阴性株数的比例符合1:1的理论分离比，则该单株的基因型为 Vava。

常用的烟草马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）抗源的抗性表现为隐性基 因（va）控制，烤烟抗PVY育种，需要鉴定单株Va基因是否为杂合体和纯合体； 目前已有Va基因型的RAPD标记O12V3₆₉₅与SCAR标记PVYME1，由于缺少 Va共显性的DNA标记或相斥相标记，不能直接采用分子标记筛选杂合体和纯合 体；本发明采集待鉴定烟草单株的花药，利用花药培养出单倍体苗，检测单倍体 苗的标记分离情况，根据标记分离情况鉴定单株的Va基因型是否为纯合体和杂 合体。本发明与常规测交方法相比，具有相对省时省力的优点。

附图说明

图1为花药培养单倍体苗的PVYME1标记检测成像记录。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的说明，但实施例不是对本发 明的限定。

实施例1

1.1植物材料

转育va位点的回交1代单株由烤烟种质RY5（PVY抗病亲本）和烤烟种质 Coker176（PVY感病亲本）常规杂交回交获得。

1.2花药培养

对田间株型较好的单株，采集花冠与花萼等长的花蕾，每株采集10个左右。 参照文献（陈学军等,植物遗传资源学报,2011,20(1):65-68）花药培养。每个单株 随机选择10株左右花药培养单倍体苗（简称花培苗），转移至新的生根培养基上， 继续培养至约4-5片叶。采集0.1g叶片组织，用于DNA提取。

1.3分子标记检测

采用试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit,Qiagen,GmbH Germany）提取烟草总基 因组DNA。采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法检测DNA质量，将质量 合格的DNA样品，用0.5×TE溶液稀释至30~50ng/μL，-20℃保存备用。与PVY 抗性紧密连锁的分子标记检测采用SCAR标记引物PVYME1（Julio et al.,Theor  Appl Genet.2006,112(2):335-346.）,目标条带172bp。PCR试剂购自宝生物公司。 PCR反应在BIO-RAD基因扩增仪上(BIO-RAD，C1000Thermal Cycler)上进行。 PCR反应体系体积为20μL，其中30~50ng/μL DNA样品2.5μL、10×PCR buffer 2.0μL，2.5mM dNTPs2.5μL，10μM引物1.5μL，5U/μL rTaq DNA酶0.5μL， ddH₂O11.0μL。PVYME1扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，62 ℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环，72℃延伸5min，4℃保存。

采用2%的琼脂糖凝胶进行检测，Marker为100bp分子量标准（大连宝生物 公司）。

1.4回交1代的Vava杂合体筛选

在将抗PVY的隐性基因位点（va）回交转育至栽培品种（基因型VaVa）时， F₁的基因型为Vava，BC₁F₁的后代出现两种基因型（VaVa和Vava）。继续回交时， 需要预先挑选出Vava单株。对BC₁单株取花药培养出单倍体苗，利用分子标记检 测单倍体群体的标记分离情况，鉴定出BC₁F₁的Vava单株。对6个回交1代（BC₁） 单株分别花药培养，获得单倍体群体（6株/群体），SCAR标记PVYME1标记检测， 其中1号至6号单株的单倍体群体的阴性苗数与阳性苗数比例表现为2:4或3:3分 离，表明这6个单株的Vava基因杂合。其中7号单株的单倍体群体的阴性苗数与阳 性苗数比例表现为0:6分离，表明该单株的Vava基因纯合。

表1利用花药培养单倍体苗的Va标记检测筛选Vava杂合体

实施例2

重复实施例1，有以下不同点：采用与Va紧密连锁的RAPD标记O12V3₆₉₅检测单倍体苗。

参考文献：

Noguchi S.,Tajima T.,Yamamoto Y.,Ohno T.,and Kubo T.,1999,Deletion of  a large genomic segment in tobacco varieties that are resistant to potato virus Y (PVY).Mol Gen Genet,262:822-829.

陈学军,彭双玉,罗建蓉,杨彦明,肖炳光.6个烟草杂交组合花药再生苗的培 养和DH群体的构建.植物遗传资源学报,2011,20(1):65-68；

Julio E,Verrier J L,Dorlhac de Borne F.Development of SCAR markers linked  to three disease resistances based on AFLP within Nicotiana tabacum L.Theor Appl  Genet.2006,112(2):335-346.

王贵,刘勇,卢秀萍,李昆志.烟草PVY抗性的遗传分析与分子标记筛选，分子植物育 种.2012,10(1):97-103。