人工合成用于转基因抗除草剂植物的EPSPS基因

摘要

本发明涉及人工合成用于转基因抗除草剂植物的EPSPS基因，它较其密码子优化前更容易获得高表达的转基因植株。本发明也涉及利用该基因培育抗草甘膦植物的应用。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学和植物遗传工程学领域。具体的说，本发明涉及一种抗草甘膦 的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因及其在抗草甘膦植株选育、组织细胞培养中 的应用。

背景技术

N-膦酰甲基甘氨酸，也称草甘膦，是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜无毒，自 然条件下杂草和农作物难以对其产生抗性，低土壤残留量、易于被微生物分解等特点，已广 泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的除草剂品种。然而由于草甘膦无选择性 的杀死杂草和作物，限制了其只能在作物出苗前或非作物种植区使用，这便制约了其在农业 上的应用。为了获得抗草甘膦作物，从上世纪80年代，人们便开始培育抗草甘膦农作物，其 中最成功的例子是将改良的草甘膦靶标酶EPSP合酶导入植物中，以提高转基因植物对草甘膦 的抗性。

草甘膦是通过抑制芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶 (EPSPS)，该酶催化莽草酸代谢途径倒数第二个反应。正常情况下EPSPS催化磷酸烯醇式丙 酮酸(PEP)与3-磷酸莽草酸(S3P)反应生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)和无机 磷。由于草甘膦与PEP结构相似，在植物和微生物体内可形成EPSP合成酶-S3P-草甘膦复合 物，阻截PEP与酶的结合，从而阻断芳香族氨基酸的合成。该酶只在植物和微生物中存在， 在动物体中不存在。在一些极端环境下，如长期喷洒草甘膦的农田、草甘膦工厂的废液池以 及人为的加大对某植株草甘膦的选择压力等，发现了部分对草甘膦具有耐受能力的细菌和植 物。如Amrhein等人通过逐渐增加草甘膦的浓度，分离到一个耐受草甘膦的矮牵牛细胞系； Baerson等人在长期喷洒草甘膦的果园中发现了一株耐受草甘膦的牛筋草，经过后期实验证 明这些抗性的产生均为EPSPS基因发生了突变，导致了其与草甘膦的结合能力降低，并且保 证了正常的催化能力。植物可以通过转化对草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而获得抗草甘 膦的能力。根癌农杆菌CP4、荧光假单胞菌G2和Salmonella typhimurium CT7的EPSPS已 经在植物中得到广泛的验证和应用。

在植物和某些细菌中发现的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)对草甘膦具有抗性。 在植物中草甘膦的抗性可以通过表达与草甘膦具有较低亲和力的EPSPS而获得，存在草甘膦时 此酶也仍然保持其催化活性。植物对草甘膦耐受或对草甘膦具有抗性是指用草甘膦除草剂喷 施植物后，植物可以正常生长发育。

现已被确定EPSP合成酶分为两个家族(Ming He等2001)，家族I包括来源于大肠杆菌和鼠 伤寒沙门氏菌的EPSP合成酶；家族II包括来源于根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA、假单胞菌 PG2982。家族II的EPSP合成酶多克隆抗体与家族I的EPSP合成酶不发生交叉反应，且两者间的 氨基酸同源性低于50％。

在天然的植物EPSPS基因中，叶绿体转运肽区域包含在天然的编码序列中(例如：CTP2， Klee等，Mol.Gen.Genet.210：47-442，1987)，CTP在叶绿体膜上从EPSPS酶上裂解下来，产生 成熟的EPSPS。叶绿体转运肽对EPSPS酶行使正常功能是必须的，在蛋白结构及功能一致的前 提下，如果去掉信号肽，虽然整个植物组织EPSPS蛋白表达量一致，但是植株确不具有草甘膦 抗性，不同来源的信号肽对EPSPS蛋白在不同转化受体中行使功能的效率存在差异(Guy della  Cioppa 1988，Guy della Cioppa1986)。

密码子偏爱性是一个阻碍细菌基因在植物中表达的障碍。对于一个给定氨基酸的同义密 码子，不同的物种会有不同的偏爱性。例如在苜蓿中精氨酸的密码子CGU出现的概率是罕见密 码子CGG的50多倍。而在玉米中AGG和CGC是精氨酸常用密码子，CGG也经常被使用。玉米中许 多常用密码子却在细菌中很少见，反之亦然。来源于细菌P.luminescens的两个杀虫蛋白基 因(tcdA和tcbA)的密码子使用频率中可以发现(Patent No.US6，590，142B1)，丙氨酸的 GCG密码子，谷氨酸的GAA密码子，亮氨酸的CTG密码子并没有在这两个细菌基因中使用。但是 这些密码子在玉米中的使用频率大约是23％、20％和26％。所以对于来源于细菌的基因在转 入植物之前都要根据宿主植物进行基因改造和密码子优化。

在植物分子生物学领域内需要可提供阳性选择标记表型的各种基因。具体地说，草甘膦 耐受可在植物中广泛地用作阳性选择标记，并且用在农作物生产中是很有价值的表型。当使 用不同的阳性选择标记基因时，扩展了现有的转基因性状与新开发性状的堆积和组合。标记 基因提供了不同的表型如抗生素或草甘膦耐受，或者通过DNA检测方法可区别的分子差异。通 过多重抗生素或除草剂耐受分析，或通过DNA检测方法检测新型DNA分子的存在，可以筛选叠 加性状的转基因植物。本发明提供了抗草甘膦EPSP合酶的DNA和蛋白组合物。本发明也提供了 用于植物的DNA构建和展示草甘膦抗性的转基因植物。

发明内容

根据CP4EPSPS不同区域的活性分析及玉米基因组特点，我们对CP4EPSPS(SEQ ID No：1) 的密码子及编码框进行了改造，改造后的核苷酸序列(SEQ ID No：2)与原始的EPSPS同源性仅 为88％，而G的含量由原来的31.2％变为35.5％；C的含量也由原来的34.6％变为32.7％；T的 含量由原来的16.4％变为15.2％，A的含量由原来的17.8％变为16.7％。同时我们在优化后的 EPSPS基因5’端增加了一个来源于高粱的叶绿体转运肽(SEQ ID No：3)，整合了叶绿体信号 肽并经过密码子优化的CP4EPSPS基因我们命名为CC-M EPSPS(SEQ ID No：4)。通过对转CP4 EPSPS基因及CC-M EPSPS基因的玉米不同转化事件的分析，我们发现转CC-M EPSPS基因更 容易获得高表达的转化事件。

本发明的一方面是包含启动子的DNA构建物，此启动子在植物细胞中有功能，有效与优 化后的CC-M分子连接。

本发明的另一方面是一个制备转基因植物的方法，包括提供具有CC-M基因的植物表达载 体，在允许植物表达载体能被受体植物细胞摄取的条件下，将受体植物细胞与植物表达载体 接触；选择包含植物表达载体的受体植物细胞；从选择的受体植物细胞再生植株；鉴定耐受 草甘膦的转基因植物。

本发明的又一方面是可育的草甘膦耐受的转基因植物，它包含具有CC-M基因的植物表达 载体，将此转基因植物与其他植物杂交，以提供耐受草甘膦的子代植物。

本发明的还一方面提供了在作物田地中杂草防除的方法，其中作物田地用有效量的含草 甘膦除草剂处理，并且田间作物包含具有CC-M基因的植物表达载体。

附图简述

图1.CP4EPSPS基因的植物表达载体

图2.CC-M EPSPS基因的植物表达载体

图3.转CP4EPSPS基因的玉米检测结果

图4.转CC-M EPSPS基因的玉米检测结果

图5.转CP4EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果

图6.转CC-M EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体实施步骤参考(Sambrook等人， 分子克隆实验指南，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，所用术语和 缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。

实施例1、CP4EPSPS基因的密码子优化。

根据CP4EPSPS不同区域的活性分析及玉米基因组特点，我们对CP4EPSPS(SEQ ID No：1) 的密码子及编码框进行了改造，改造后的核苷酸序列(SEQ ID No：2)与原始的EPSPS同源性仅 为88％，而G的含量由原来的31.2％变为35.5％；C的含量也由原来的34.6％变为32.7％；T的含量 由原来的16.4％变为15.2％，A的含量由原来的17.8％变为16.7％。

实施例2、优化后CC-M EPSPS植物表达载体的构建

按照实施例1的方案我们分别合成了CP4EPSPS及密码子优化的CP4EPSPS，同时在合 成基因的5’端添加了BamHI的酶切位点，3’端添加了KpnI的酶切位点。利用BamHI、KpnI 消化合成的DNA，回收目标基因片段，然后与BamHI、KpnI消化的已有植物表达载体pHM102 进行连接。

我们分析了高粱EPSPS基因的结构，确定其5’端225bp为叶绿体转运肽，我们人工合 成了该序列，并在该序列的两端分别添加了BglII酶切位点，由于BglII的酶切位点与BamHI 的酶切位点相同，我们分别用BglII消化合成的叶绿体转运肽，用BamHI消化pHM102与CP4

EPSPS及密码子优化的CP4EPSPS连接产物，分别回收目标片段进行连接，得到含有信号肽 的CP4EPSPS植物表达载体(图1)，基因序列如SEQ ID No：5所示；含有转运肽的CC-M EPSPS 植物表达载体(图2)，基因序列如SEQ ID No：4所示。

实施例3、抗草甘膦基因CC-M在玉米中的表达。

1、转抗草甘膦基因CC-M玉米的获得

转基因玉米的获得方法为采用基因枪法将插入序列导入受体植株的愈伤组织，经100mg/L 的除草剂草甘膦筛选后获得转基因植株。具体方法为：

(1)、诱导II型愈伤组织

a、去除苞叶：切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，这样可以以镊子当 作把手，有利与操作，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可以在同一个 烧杯里放4-6个果穗。

b、向烧杯里加约700ml的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween 20)用来浸泡果穗，在消毒20分钟过程当中，不时的旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除子粒 表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果。消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里， 在水里洗3次，然后准备剥胚。

c、把消过毒的果穗一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1-2mm)， 在这过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等。

d、用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托 起幼胚，确保幼胚不受到任何的损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基，胚的密度 大约是2X2cm(20-25个/皿)。

e、新鲜的幼胚大约1.5-1.8mm大小，放置在N6E培养基上面，每隔10-15天继代一次， 刚获得的幼胚容易长出芽状组织，这样可以提早去掉该组织，而不用等到10-15天。

f、挑选优等II型愈伤：第二次愈伤继代时，II型愈伤已经开始形成，其特征为：颜色米 黄，生长速度快，松散易碎，新生愈伤顶端呈现米粒状颗粒。可以根据其特征来进行有针对 性的挑选，可以把已经分化出的II型愈伤分成麦粒状大小，每皿(90cm)放20-25块。

g、为了保证愈伤的质量，保证每次继代的时间间隔不能超过15天，同时保证一直有400 皿以上的II型愈伤，以便做基因枪转化。

(2)、金粉的准备和基因枪轰击

a、称量15mg金粉并放入灭菌后的1.5ml的eppendorf离心管当中，这样结果是10X的 量。

b、在超净台下，向每个离心管中加入500ul冰冻(-20℃)无水乙醇，震荡15sec，在 超净台上收集金粉到离心管底部，静置30min，直到金粉全部沉淀。

c、然后转速3000rpm离心60sec，彻底去除乙醇。再向离心管中加入冰浴的无菌ddH2O， 用手指轻弹混匀，然后转速3000rpm离心60sec。重复上述步骤2-3次，最后一次用转速 5000rpm离心15sec，然后移去上清，再用500ulddH2O悬浮。震荡15sec，然后快速悬浮混匀， 边混边分装。

d、具体的分装方法是：先把10个离心管放好，用25ul的量分装，重复分装两次，第一 遍从第一个管开始，第二遍从最后一个管开始，这样每个离心管含有50ul水，1.5mg金粉。 然后盖上盖子于-20℃保存。

e、上午先把要打枪的愈伤分成小块，堆积在渗透培养基(N6OSM)的中央区域，根据计划 做准备。

f、目的DNA的包裹，先把分装好的金粉(-20℃)(每管1.5mg并保存在50微升超纯水当 中)放在冰上，同时把CaCL2浓度为2.5M(4℃)和亚精胺浓度为0.1M(-70℃)也放在冰上融化， 其中CaCl2和亚精胺分装成一次性使用的包装。

g、用手指轻轻弹装有金粉的离心管使之悬浮起来，然后加入目的DNA(60-200ng)，迅 速用手指轻弹使之混匀然后加入50微升CaCL2并用枪头轻轻吸吐使之混匀，然后加入20微 升亚精胺，静置30秒把离心管放在涡旋振荡器上面震荡10分钟(注意使旋涡液体不要上升 太高，同时使液体全部悬浮起来)。

h、离心管放到冰上静置5分钟(如果震荡以后有金粉在液体表面漂浮，静置前再用手指 轻弹使之沉淀下来)，2000rpm离心15秒，然后用吸头吸掉上清加入预冷(-20℃)的无水 乙醇250微升，并用枪头轻轻(20微升的枪调到10-13微升)吸吐混匀。重复以上步骤3-4 次，然后加入无水乙醇120-140微升使之平均分成8份并加到宏载片上面开始基因枪轰击。

i、基因枪轰击以后的1-12小时把愈伤倒至N6E培养基上进行恢复。

(3)、转基因植株的获得

a、在N6E培养基上诱导愈伤组织10-14天后，转移到N6S(选择培养基)上(2.0mg/L bialaphos)，开始选择含有转化子的细胞，然后用parafilm封口膜封培养皿。

b、3周以后，把胚转移到新鲜的N6S培养基上，大约6-8周，就会选到抗草胺膦的克隆。

c、把II型愈伤组织每皿转移15片(4mm/片)到再生培养基I上，25度暗培养2-3周， 并用通风带封住培养皿。

d、2-3周后，把成熟的胞质胚转移到再生培养基II上准备发芽，同时用通风带封住培 养皿，植株将在这个培养基里长叶和根。

e、移栽成活的转化植株长出7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，转 基因植株开花后套袋自交或姊妹交结实。种子播种在温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取 DNA，采用PCR技术检测是带有外源基因。

2、转基因植株的检测

根据修饰后高粱EPSPS(P106S)合酶基因序列和PHM102载体上的序列分别设计上游和下游 引物，引物序列如下：CC-M1F：5’CCTTACCGTGGAGACCGATGC 3’，CC-M1R：5’ CCGCCATGAGGTCCATGAACT 3’分别提取通过上述方法获得的转基因植株的基因组DNA，取 0.1μg基因组DNA为模板，分别在检测引物F和检测引物R的引导下，用PCR法鉴定外源基因CC-M 在基因组上的整合情况，反应条件为：95℃反应5min，95℃反应45s，59℃反应45s，72℃反应 1min，32个循环，72℃反应10min，10℃保持。电泳PCR产物结果图4.转CC-M EPSPS基因的玉 米检测结果，结果表明不同的转化事件均有目标基因的整合。

CP4EPSPS转化玉米的检测上游引物为：5’CCTTACCGTCGAGACGGATGC 3’，下游引物为 5’CGGCCATCAGGTCCATGAACT 3’，检测结果见图3.转CP4EPSPS基因的玉米检测结果，结果 表明不同的转化事件均有目标基因的整合。

泳道M为MarkerIV，泳道CK-为转化有空载体的阴性对照，空为以ddH2O为模版扩增结 果，CK+为质粒DNA阳性对照，泳道1-20为不同的转化事件，可以扩增出680bp左右大小特 异片段的即为含有目标基因的转基因阳性植株，通过PCR结果可以看出1-20均为阳性植株。

3、转基因玉米田间草甘膦抗性检测

对获得的转基因植株喷施800ml/亩的商品化草甘膦，植株没有药害的条件下表明该转基 因植株拥有足够的草甘膦抗性。我们对CP4EPSPS及CC-M EPSPS基因分别构建了植物转化载 体并转化了玉米，每个诱变体获得了20个转化事件，通过对这些转化事件田间抗性鉴定结果 表明：转化CP4EPSPS基因的20个转化事件在喷施浓度为800ml/亩的草甘膦时，均有不同 的药害产生，图5.转CP4EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果，CK+为未喷施草甘膦的植株， 1、2分别为不同的转化事件喷施800ml/亩的草甘膦后的植株。而转化CC-M EPSPS基因的20 个转化事件在喷施浓度为800ml/亩的草甘膦时，有13个转化事件生长没有受到任何程度的 影响，图6.转CC-M EPSPS基因的玉米田间抗性鉴定结果，CK+为未喷施草甘膦的植株，1、 2分别为不同的转化事件喷施800ml/亩的草甘膦后的植株。这说明优化后的CC-M基因更容易 获得有效的转化事件，这主要取决于优化后的EPSPS基因密码子特征更适合在玉米中的表达。