转基因抗除草剂油菜与十字花科植物间的基因流研究

摘要

近年来，转基因抗除草剂作物在全球范围内大量种植。与此同时，也带来了一定的生态风险，主要风险之一是抗性转基因通过花粉漂流转移到野生近缘植物，导致这些植物产生抗性，从而形成“超级杂草”。本试验通过苯胺蓝荧光法观察、人工杂交、混合花粉蒙导授粉并结合人工授粉后代的分子鉴定，研究了甘蓝型抗草甘膦油菜Q3与15种十字花科植物(包括芸薹属油料作物的3个种、5种蔬菜作物和7种野生杂草，共16个材料)间的杂交亲和性、自然授粉条件下Q3与这些材料间的基因流频率以及抗除草剂基因在污染植株中的遗传传递能力，以期为转基因抗除草剂油菜的生态安全性评价提供科学依据。主要研究结果如下： (1)荧光显微镜观察结果表明，甘蓝型油菜(B.napus)、白菜型油菜(B.campestris)、芥菜型油菜(B.juncea)、二倍体小白菜(B.chinensis)、四倍体小白菜(B.chinensis)、大白菜(B.pekinensis)、雪里蕻(B.unceavarmulticeps)、甘蓝(B.oleraceavar.capitata)和野芥菜(B.juncea)授以Q3花粉后24h，均可见有一定数量的花粉管通过珠孔进入胚珠；而遏蓝菜(Thlaspiarvense)、播娘蒿(Descurainiasophia)、荠菜(Capsellabursa-pastoris)、碎米荠(Cardaminehirsuta)、诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)和风花菜(Rorippapalustris)6种杂草授Q3花粉后杂交不亲和，花粉管生长受阻，分别停滞在上述杂草的柱头表面或花柱上部1/3处。本结果说明Q3的抗除草剂基因有可能通过基因流逃逸到与其亲缘关系较近的油菜、蔬菜和野芥菜中，而逃逸到遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜和风花菜中的风险则较小。 (2)人工杂交和杂交后代的分子鉴定结果表明，甘蓝型油菜品种“扬油4号”、“宁油10号”(作母本)与Q3(作父本)杂交的亲和指数最高，分别为16.15、12.77；白菜型油菜品种“扬油3号”、芥菜型油菜品种“G11”、二倍体小白菜品种“丰抗80”、四倍体小白菜品种“扬州青1号”、大白菜品种“淄白8号”、“扬州雪里红”、野芥菜等芸薹属近缘植物(作母本)与Q3(作父本)杂交的亲和指数其次，居于0.85～2.37之间；甘蓝品种“YZS-1”与Q3杂交的亲和指数较低，为0.09；上述所有杂交组合的F1代植株抗草甘膦基因的PCR检测均为阳性；而遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜、风花菜6种杂草(作母本)与Q3(作父本)杂交亲和指数为0，这与荧光显微镜的观察结果相一致。本结果进一步说明了Q3的抗除草剂基因有可能通过基因流逃逸到甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、大白菜、小白菜、雪里蕻、甘蓝和野芥菜中，而转移到遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜和风花菜中的可能性则很小，基因流风险的大小顺序为：种内品种间＞种间＞属间。 (3)混合花粉蒙导授粉及其后代的分子鉴定研究结果表明，当遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜和风花菜6种杂草分别授以混合花粉(自花花粉与Q3花粉)蒙导后，与各自的自交相比，混合花粉在受体植物柱头上的萌发表现出花粉粒大量粘合、萌发快、伸进花柱与子房的花粉管数量多等特点。授粉后24～48h，各蒙导组合均可观察到一部分花粉管已经通过珠孔进入胚珠，但所有蒙导后代植株抗草甘膦基因的PCR检测均表现阴性。本结果进一步说明了遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜、风花菜与Q3杂交高度不亲和，Q3的抗除草剂基因不能通过基因流转移到这6种杂草中。 (4)邻近间隔种植和自然授粉条件下，Q3与上述15种十字花科植物(共16个材料)间的基因流频率研究结果，Q3与同类型的甘蓝型油菜品种“扬油4号”、“宁油10号”间的基因流频率最高，达2.3278％、2.1487％；与白菜型油菜品种“扬油3号”、芥菜型油菜品种“G11”、二倍体小白菜品种“丰抗80”、四倍体小白菜品种“扬州青1号”、大白菜品种“淄白8号”、雪里蕻品种“扬州雪里红”、野芥菜等芸薹属近缘植物间的基因流频率其次，居于0.8638％～1.0615％之间；与甘蓝品种“YZS-1”间的频率较低，为0.1103％；而Q3与遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜、风花菜6种杂草间的基因流频率为0。基因流频率的高低顺序为：种内品种间＞种间＞属间，这与通过杂交亲和性评估的结果完全一致，表明基因流频率与杂交亲和性高度相关。 (5)对大田筛选出的上述10种十字花科芸薹属近缘植物的基因污染植株进行育性观察，并通过与相应的未污染植株回交，研究了抗草甘膦基因在污染植株中的遗传传递能力。结果表明，白菜型油菜、芥菜型油菜、大白菜、小白菜、雪里蕻、甘蓝和野芥菜的基因污染植株(杂种F1代)生殖竞争优势较弱，抗草甘膦基因的遗传传递能力较差，但经与亲本回交后抗性基因能够完成一定的渗入；而抗草甘膦基因在甘蓝型油菜品种“扬油4号”、“宁油10号”的基因污染植株中的遗传传递能力较强，无亲和性障碍。 第二章抗除草剂油菜花粉在十字花科受体植物柱头上的萌发 本实验通过苯胺蓝荧光法观察了甘蓝型抗草甘膦油菜Q3的花粉在15种十字花科植物(共16个材料)柱头上的萌发情况，初步研究了Q3与这些植物间的杂交亲和性。本结果说明Q3的抗除草剂基因有可能通过基因流逃逸到上述3种类型的油菜、5种蔬菜和野芥菜中，而逃逸到遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜和风花菜中的风险则较小。 第三章抗除草剂油菜与十字花科受体植物人工杂交的结实情况 本实验通过人工杂交并结合杂交后代的分子鉴定，进一步研究了甘蓝型抗草甘膦油菜Q3与前文中15种十字花科植物间的杂交亲和性，来评估Q3与这些植物间的基因流。结果表明，甘蓝型油菜品种“扬油4号”、“宁油10号”(作母本)与Q3(作父本)杂交的亲和指数最高，分别为16.15、12.77；白菜型油菜品种“扬油3号”、芥菜型油菜品种“G11”、二倍体小白菜品种“丰抗80”、四倍体小白菜品种“扬州青1号”、大白菜品种“淄白8号”、“扬州雪里红”、野芥菜等芸薹属近缘植物(作母本)与Q3(作父本)杂交的亲和指数其次，居于0.85～2.37之间；甘蓝品种“YZS-1”与Q3杂交的亲和指数较低，为0.09；上述所有杂交组合的F1代植株抗草甘膦基因的PCR检测均为阳性；而遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜、风花菜(作母本)与Q3(作父本)杂交亲和指数为0，这与荧光显微镜的观察结果(见第二章)相一致。本结果进一步说明了Q3的抗除草剂基因逃逸到甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、二倍体小白菜、四倍体小白菜、大白菜、雪里蕻、甘蓝和野芥菜中的成功率较大，而转移到遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜和风花菜中的可能性则很小，基因流风险的大小顺序为：种内品种间＞种间＞属间。 第四章蒙导授粉条件下抗除草剂油菜与6种十字花科野生杂草间的杂交亲和性 本实验根据苯胺蓝荧光法观察和混合花粉蒙导授粉的结实情况，并结合蒙导后代的分子鉴定，研究了蒙导条件下甘蓝型抗草甘膦油菜Q3与遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜、风花菜6种十字花科杂草间的杂交亲和性，来进一步评估Q3与这些杂草间的基因流。结果表明，当遏蓝菜、播娘蒿、荠菜、碎米荠、诸葛菜和风花菜分别授以混合花粉(自花花粉与Q3花粉)蒙导后，与各自的自交相比，混合花粉在受体植物柱头上的萌发表现出花粉粒大量粘合、萌发快，伸进花柱与子房的花粉管数量多等特点。 第五章自然授粉条件下抗除草剂油菜与十字花科植物间的基因流 前面三章的研究表明，十字花科许多植物表现为异花授粉并具有较高的种间杂交亲和性，这些生殖特征喻示着外源基因在该科植物间存在潜在的逃逸风险。本实验通过邻近间隔种植的方式，研究了在自然授粉条件下，甘蓝型抗草甘膦油菜Q3与前文中15种十字花科植物间的基因流频率。 第六章抗除草剂基因在污染植株中遗传传递能力 本实验对10种芸薹属近缘植物基因污染植株进行了育性观察，并以基因污染植株为母本，相应的未污染植株为父本进行回交，初步研究了抗草甘膦基因在污染植株中的遗传传递能力。结果表明，白菜型油菜、芥菜型油菜、二倍体小白菜、四倍体小白菜、大白菜、雪里蕻、甘蓝和野芥菜的基因污染植株(杂种F1代)生殖竞争优势较弱，抗草甘膦基因在这些污染植株后代的遗传传递能力较差，但经与亲本回交后抗性基因能够完成一定的渗入；而抗草甘膦基因在甘蓝型油菜品种“扬油4号”、“宁油10号”基因污染植株中的遗传传递能力较强，无亲和性障碍。 综上所述，转基因抗除草剂油菜与十字花科植物间存在不同程度的基因流，基因流频率与杂交亲和性高度相关。在自然授粉条件下，甘蓝型转基因油菜Q3的抗草甘膦基因能够通过基因流逃逸到甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、二倍体小白菜、四倍体小白菜、大白菜、雪里蕻、甘蓝和野芥菜中，并且抗草甘膦基因在污染植株中具有一定的遗传传递能力，通过基因污染植株与亲本的回交能够完成一定的渗入。因此大面积种植抗除草剂油菜带来的与十字花科植物间的基因流问题应引起高度重视，生产上采取一定的隔离措施可以防止通过花粉漂流所带来的基因污染。根据农业部《农业转基因生物安全评价管理办法》对转基因生物安全性的4级分类标准，甘蓝型抗草甘膦油菜Q3的安全等级可以定为Ⅱ级。

目录

文摘

英文文摘

中英文对照词

第一章研究背景及研究思路

第二章抗除草剂油菜花粉在十字花科受体植物柱头上的萌发

第三章抗除草剂油菜与十字花科受体植物人工杂交的结实情况

第四章蒙导授粉条件下抗除草剂油菜与6种十字花科野生杂草间的杂交亲和性

第五章自然授粉条件下抗除草剂油菜与十字花科植物间的基因流

第六章抗除草剂基因在污染植株中的遗传传递能力

第七章综合讨论

附录

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文