法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-03-25
授权
授权
2013-05-01
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/04 申请日:20120920
实质审查的生效
2013-04-03
公开
公开
本发明涉及具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶（lactate oxidase）、编码突变型乳酸氧化酶的核酸、包含所述核酸的表达载体、包含所述核酸或所述表达载体的宿主细胞、测定样品中的乳酸的方法、突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的用途、使用所述突变型乳酸氧化酶用于测定样品中的乳酸的装置和包含所述突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的试剂盒。
乳酸（lactic acid）也称为乳酸（milk acid），在几个生物化学过程中起作用。乳酸是具有化学式C3H6O3的α羟酸。在溶液中它以其离子形式存在，即作为乳酸根（lactate）CH3CH（OH）COO?。乳酸（lactate）是手性的，并且具有2种光学异构体。一种称为L-（+）-乳酸或（S）-乳酸，并且另一种称为D-（?）-乳酸或（R）-乳酸。L-（+）-乳酸是生物学重要的异构体。
在动物（包括人）中，L-乳酸（L-lactate）在正常代谢和运动过程中经由酶乳酸脱氢酶（LDH）由丙酮酸（pyruvate）不断产生。它通常直到乳酸生产率超过乳酸去除率才在浓度中增加，这由许多因素支配，包括单羧酸转运蛋白、LDH的浓度和同种型、和组织的氧化能力。在人中，血液乳酸的浓度在静止时通常是1–2 mmol/L，但在激烈运动过程中可以升高至超过20 mmol/L。
乳酸浓度或乳酸与丙酮酸比反映氧化还原态。因此，监控乳酸水平是在组织需氧量和利用之间的平衡的良好指示剂，并且当研究细胞和动物生理学是有用的。相应地，可以监控在生物学样品例如血清、血浆、血液、尿和唾液中的乳酸或在细胞培养样品中的细胞内和细胞外乳酸浓度，以便研究或监控受试者或细胞的状况。
血液乳酸的测定频繁用于竞争性体育运动、健身和康复中，允许：
● 个体运动强度的评估
● 运动和恢复期的改善
● 超负荷和损伤的危险减少
如上文详述的，无氧糖酵解显著增加血液乳酸，尤其是对于延长运动。
在医学中，乳酸的测定可以用于
● 测定组织缺氧
● 测定疾病的严重性和预后，到由乳酸水平反映的程度。
例如，乳酸浓度可以在降低机体可用的氧量、增加乳酸生产和/或降低乳酸清除率的任何状况下增加。这可以是从由于剧烈运动在肌肉中产生的乳酸的局部增加直到威胁生命的全身休克的任何事情。过量乳酸可以存在于一系列疾病、感染和遗传性代谢和线粒体病症中。关于增加的血液乳酸的常见原因是起因于此类状况例如休克、肺炎和充血性心力衰竭的缺氧。乳酸酸中毒还可以在肾衰竭和白血病中出现。此外，硫胺素缺乏病和糖尿病酮症酸中毒与增加水平的乳酸相关。它们还可以通过特定药物例如二甲双胍（由糖尿病患者服用）和异烟肼（肺结核治疗）引起。
用于测定乳酸的测试是本领域已知的。近年来，用于测定乳酸的酶促方法已得到开发。酶促方法涉及在测定方法中酶的使用，并且一般是简单的且提供更大的特异性、准确度和重现性。对于乳酸测定描述的第一种酶促方法基于通过乳酸脱氢酶从乳酸到铁氰化钾的氢转移。然而，该程序是麻烦的且未受到广泛承认。后续方法涉及NADH形成的UV测量。在1974年，描述了测量通过由乳酸脱氢酶催化的乳酸氧化形成的NADH的乳酸程序，使用肼作为用于丙酮酸的捕获剂。另一种方法还基于乳酸脱氢酶的催化作用，但在反应混合物中包括丙氨酸转氨酶，以更快速地去除由乳酸转换形成的丙酮酸。另外一种方法使用涉及乳酸氧化酶的酶促反应，以将乳酸转换为丙酮酸。通过这种反应产生的过氧化氢随后可以用于酶促反应中，以生成有色染料。
来自绿浅气球菌（Aerococcus viridans）的乳酸氧化酶通常用于生物传感器和体外测试中，以便检测例如在血液中的乳酸。这些生物传感器和体外测试占优势地用于例如重点护理患者和运动员的监控中。传感器的寿命由乳酸氧化酶的稳定性决定，所述乳酸氧化酶在使用和贮存期限过程中变得失活。此外，用于体外测试的试剂的贮存期限和使用中时间受乳酸氧化酶的稳定性影响。因此，增加乳酸氧化酶的稳定性具有很大利益，以便增加生物传感器和体外测试的贮存期限和使用中时间。相应地，本发明的目的是提供具有增加的稳定性的乳酸氧化酶。
令人惊讶的是，已发现在SEQ ID NO: 1的乳酸氧化酶的氨基酸序列的位置191上的酪氨酸突变增加乳酸氧化酶的稳定性。
由于传感器和测试的有限贮存期限和使用中时间，它们必须频繁取代，因为活性下降到技术可接受的水平下。明显地，传感器和测试设备的频繁变化是消费者不友好的、资源的浪费且因此要避免的。由于野生型乳酸氧化酶的低稳定性，涉及乳酸氧化酶的测定通常在低温下执行。增加的乳酸氧化酶稳定性的另外优点将是当测量乳酸时，在用于血液分析的装置中，用于将温度减少至25 – 30℃的恒温器（thermostate）是可以避免的，因为血气分析（通常伴随执行）通常在37℃执行。相应地，更稳定的乳酸氧化酶将显著减少装置的复杂性。这将提供关于低成本装置的基础，这例如在所谓的新兴市场中具有特别关联性。
相应地，在第一个方面，本发明提供了具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶，其包含这样的氨基酸序列，其
（i）与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或其功能活性变体至少90%等同；和
（ii）具有在对应于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的位置Tyr191的位置上的氨基酸置换，
其中功能活性变体具有在选自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的Gly36、Ala95、Thr103、Glu160、Val198、Asn212、Ala/Gly232和Phe277的位置上的至少一个进一步的氨基酸置换。
术语“乳酸氧化酶”（由国际生化联合会的酶学委员会（Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry）分类为EC 1.1.3.15）一般意指催化L-乳酸至丙酮酸的氧化的酶，伴随O2至H2O2的还原（（S）-2-羟酸氧化酶）。乳酸氧化酶是FMN（黄素单核苷酸）依赖性α羟酸氧化酶家族的成员。它采用黄素单核苷酸（FMN）作为辅因子。乳酸氧化酶在病毒和细胞生物中出现。
根据本发明，与在位置191上不含突变的各自乳酸氧化酶相比较，突变型乳酸氧化酶具有增加的稳定性。令人惊讶的是，发现其中Tyr由另一种氨基酸置换的在位置191上的突变，特别是带有非极性较大侧基的氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸和色氨酸的置换，相对于野生型乳酸氧化酶，增加在碱性环境的存在下酶的稳定性。用于研究酶的稳定性特别是依赖于环境条件例如培养基条件的合适测试是技术人员众所周知的。合适和示例性测试也在实施例特别是实施例1中描述。
在本发明的一个优选实施方案中，相对于在位置191上不含突变的各自乳酸氧化酶，突变型乳酸氧化酶的增加的稳定性表示为相对于在位置191上不含突变的各自乳酸氧化酶的半衰期（t1/2（野生型191）），在突变型的半衰期（t1/2（mut191））中的增加。酶的半衰期（t1/2）指示其中50%的原始活性（在t=0时的活性）丧失（关于进一步举例说明参见实施例1）和在这之后残留活性量至50%的时间量。
相应地，增加的稳定性导致相对于在位置191上不含突变的各自乳酸氧化酶，突变型增加的半衰期。优选地，半衰期增加至少10%、20%、30%或40%，优选至少50%、75%或100%，更加优选至少125%、150%、175%或200%，尤其是250%且最优选300%。半衰期中的增加百分比可以测定为[t1/2（mut191）/t1/2（野生型191）－1] * 100。
如本文提及的术语“SEQ ID NO: 1”指示如SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列，并且代表来自绿浅气球菌的野生型乳酸氧化酶的氨基酸序列，具有羧基末端缺失但不具有突变的Tyr191。绿浅气球菌的野生型乳酸氧化酶片段是276氨基酸蛋白质。特别地，术语“SEQ ID NO: 1”指如下所示的氨基酸序列：（请注意上文指定的置换位点由下划线指出且由位置编号指定）：
。
如本文提及的术语“SEQ ID NO: 2”指示如SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列，并且代表来自绿浅气球菌的野生型乳酸氧化酶的氨基酸序列，不含羧基末端缺失不具有突变的Tyr191。绿浅气球菌的全长野生型乳酸氧化酶是374氨基酸蛋白质。它的序列还可在登记号Q44467下从UNIPROT数据库可获得（请注意上文指定的置换位点由下划线指出且由位置编号指定）：
。
请注意SEQ ID NO: 1和2的序列在其长度中以及在位置102、163、232和255上的氨基酸中不同。在本发明的背景中，由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2组成的蛋白质称为绿浅气球菌的野生型乳酸氧化酶。
术语“突变型乳酸氧化酶”涉及其氨基酸序列不同于来自绿浅气球菌的乳酸氧化酶的野生型序列（即SEQ ID NO: 1或2的乳酸氧化酶）。就本发明的突变型乳酸氧化酶而言，应当注意突变型是功能上有活性的。这意指突变型已维持其生物学功能，即其乳酸氧化酶的酶促活性。然而，相对于野生型，突变型的活性可以是减少或增加的（还参见实施例1）。
酶的活性可以表示为单位（U）。1个U定义为每分钟催化1微摩尔底物的转换的酶量。还必须指定条件：通常采取37℃的温度以及获得最大限度底物转换率的pH值和底物浓度。技术人员将理解突变型应维持最低限度活性，优选至少5 U/ mg酶，更优选20 U/ mg酶。
优选地，生物学功能的维持定义为具有SEQ ID NO: 1或2的乳酸氧化酶活性的至少10%、20%、30%或尤其是50%，优选至少60%，更优选至少70%、80%或90%，更加优选95%。生物学活性可以如技术人员已知的例如如实施例1和2中所述的进行测定。
根据本发明的突变型乳酸氧化酶尤其通过具有在对应于SEQ ID NO: 1或2的位置Tyr191的位置上的氨基酸置换进行定义。这意指在SEQ ID NO: 1或2的位置191上的氨基酸Tyr由另一种氨基酸置换。酪氨酸（也称为4-羟基苯丙氨酸）具有极性侧基。在实施例中，Tyr191已由苯丙氨酸或亮氨酸即具有非极性侧基的氨基酸置换。由于苯丙氨酸与色氨酸（也具有非极性、疏水性、芳香族侧链的氨基酸）和亮氨酸与异亮氨酸的相似性，可以得出结论Tyr191由Trp或Ile的置换也提供所需效应，即增加的稳定性。此外，假定这对于具有非极性侧基的其他氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸也是正确的。由于其大小，这对于异亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸应是特别正确的。
如本文使用的术语“至少90%等同”或“至少90%序列同一性”意指根据本发明的突变型乳酸氧化酶的序列具有氨基酸序列，其特征在于在100个氨基酸的段内，至少90个氨基酸残基与相应野生型序列的序列等同。在本发明的一个优选实施方案中，突变型的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列或其功能活性变体至少91%、92%、93%或94%等同，更优选至少95%或96%，更加优选至少97%或98%，尤其是99%等同。根据本发明的序列同一性可以例如通过以序列比较形式的序列比对方法进行测定。序列比对方法是本领域众所周知的，并且包括多种程序和比对算法，其已在例如Pearson和Lipman（“Improved tools for biological sequence comparison“，Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 Apr；85（8）:2444-8）中描述。此外，NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）可从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information）（NCBI，Bethesda，MD）。
在一个更优选实施方案中，突变型与SEQ ID NO: 1或2的序列100%等同，除在位置Tyr191上的突变以及任选在选自Gly36、Ala95、Thr103、Glu160、Val198、Asn212、Ala/Gly232和Phe277的位置上的至少一个进一步的氨基酸置换外。在一个最优选实施方案中，突变型与SEQ ID NO: 1或2的序列100%等同，除在位置Tyr191上的突变（优选Tyr191Phe或Tyr191Leu）以及任选在位置Ala95上的一个进一步的氨基酸置换（优选Ala95Gly）外。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的突变型乳酸氧化酶可以包含一个或多个氨基酸缺失，特别是小（例如直到10个氨基酸）N和/或C末端缺失。
在一个实施方案中，除在SEQ ID NO.: 1或2的位置Tyr191上的置换以及任选在选自Gly36、Ala95、Thr103、Glu160、Val198、Asn212、Ala/Gly232和Phe277的位置上的至少一个进一步的氨基酸置换外，根据本发明的突变型乳酸氧化酶的序列还可以包含一个或多个另外的氨基酸置换，特别是一个或多个保守氨基酸置换。保守氨基酸置换的实例包括下文列出的那些：
。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的突变型乳酸氧化酶可以包含一个或多个氨基酸添加，特别是小（例如直到10个氨基酸）内部氨基酸添加。
在另一个实施方案中，除在SEQ ID NO.: 1或2的位置Tyr191上的置换以及任选在选自Gly36、Ala95、Thr103、Glu160、Val198、Asn212、Ala/Gly232和Phe277的位置上的至少一个进一步的氨基酸置换外，根据本发明的突变型乳酸氧化酶的序列还可以包含如上定义的一个或多个缺失、一个或多个置换或一个或多个添加的组合。
在本发明的背景中，SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的功能活性变体的特征在于在SEQ ID NO: 1或2的下述位置上具有至少一个，即1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸置换：Gly36、Ala95、Thr103、Glu160、Val198、Asn212、Ala/Gly232和Phe277。特别地，列出的任何氨基酸分别由一个可替代氨基酸置换。SEQ ID NO: 1或2的变体的举例说明性实例包括通过下述置换不同于SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的那些：
。
在位置Gly36、Thr103、Glu160、Val198、Asn212、Ala/Gly232和Phe277上的置换已显示对突变型乳酸氧化酶赋予增加的热稳定性（参见US 5,656,471、US 7,416,871 B2）。相应地，将针对碱性（即在pH值> 7）条件的稳定性（Tyr191的突变）与增加的热稳定性组合是有利的。
在位置Ala95上的置换已显示改善底物特异性（参见Yorita等人，J. Biol. Chem.，1996，45，28300-28305和实施例2）。相应地，将稳定性（Tyr191的突变）和任选增加的热稳定性（Gly36、Thr103、Glu160、Val198、Asn212、Ala/Gly232和/或Phe277）与改善的底物特异性（Ala95的突变）组合是有利的。
请注意氨基酸Phe277仅存在于SEQ ID NO: 2中，并且因此氨基酸置换Phe277涉及SEQ ID NO: 2。
另外，SEQ ID NO: 1和2的序列在位置232上的氨基酸中不同，其中SEQ ID NO: 1和2在那个位置上分别具有Ala和Gly。相应地，如果Ala/Gly232涉及SEQ ID NO: 1，那么它意指在位置232上的Ala被置换，并且如果Ala/Gly232涉及SEQ ID NO: 2，那么它意指在位置232上的Gly被置换。
相应地，功能活性变体的特征可以在于与SEQ ID NO: 1或2等同，除下述外
（i）在对应于位置Tyr191的位置上的氨基酸置换；和
（ii）在一个或多个下述位置上的一个或多个氨基酸置换：
。
就变体而言，它着重于根据本发明的SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列的变体是功能活性变体。功能活性变体是具有维持的生物学功能的变体，例如乳酸氧化酶的酶促活性。优选地，生物学功能的维持定义为具有至少10%、20%、30%或尤其是50%，优选至少60%，更优选至少70%、80%或90%，更加优选95%或更多的SEQ ID NO: 1或2的乳酸氧化酶活性。生物学活性可以如技术人员已知的例如如实施例1和2中所述的进行测定。
依照本发明，具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶，包含与SEQ ID NO: 1或2的氨基酸序列或其功能活性变体至少90%等同的氨基酸序列；且具有在对应于SEQ ID NO: 1或2的位置Tyr191的位置上的氨基酸置换。这意指突变型乳酸氧化酶可以包含除如上指定的氨基酸外的一个或多个进一步元件。一个或多个元件可以是进一步的蛋白质组分或非蛋白质组分。在蛋白质组分的情况下，突变型乳酸氧化酶可以是融合蛋白，例如具有待用于蛋白质的分离、纯化或鉴定的标记。组分的进一步实例包括接头（例如以便使酶与载体偶联）、信号序列（以便将蛋白质导向靶）等。在一个可替代方案中，突变型乳酸氧化酶可以由如上指定的氨基酸序列组成。
在一个优选实施方案中，突变型乳酸氧化酶的特征在于在位置191上的酪氨酸由基本上非极性的氨基酸置换，特别地其中氨基酸置换选自Tyr191Phe、Tyr191Leu、Tyr191Ile、Tyr191Met和Tyr191Trp，尤其地氨基酸置换是Tyr191Phe或Tyr191Leu，优选Tyr191Phe。如本文详述的，已显示相对于野生型（参见实施例），在位置191上的Tyr（具有极性OH基团）由非极性氨基酸（例如苯丙氨酸或亮氨酸）的置换增加乳酸氧化酶的稳定性。相应地，此类置换是优选的。具有非极性侧基的氨基酸的实例是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸。由于与苯丙氨酸和亮氨酸的高相似性，具有相当低极性的侧基的氨基酸包括甲硫氨酸和色氨酸（Met和Tyr将视为Phe或Leu的保守氨基酸置换；参见上文列表）。
在本发明的另一个优选实施方案中，突变型乳酸氧化酶的特征在于至少一个进一步的氨基酸置换选自SEQ ID NO: 1或2的Gly36Ser、Ala95Gly、Thr103Ser、Glu160Gly、Val198Ile、Asn212Asp、Ala/Gly232Ser和Phe277Tyr，特别是当在位置191上的突变是Tyr191Phe、Tyr191Leu、Tyr191Ile、Tyr191Met和Tyr191Trp时，尤其地氨基酸置换是Tyr191Phe或Tyr191Leu，优选Tyr191Phe。Gly36Ser、Thr103Ser、Glu160Gly、Val198Ile、Asn212Asp、Ala/Gly232Ser和Phe277Tyr的置换已显示对突变型乳酸氧化酶赋予增加的热稳定性。相应地，这些置换是优选的。
在本发明的一个更优选实施方案中，突变型乳酸氧化酶的特征在于至少一个进一步的氨基酸置换是Ala95，特别是Ala95Gly。Ala95Gly的置换已显示改善底物特异性（参见实施例2）。相应地，在位置95上的Ala可优选由Gly置换。
依照本发明，突变型乳酸氧化酶具有增加的稳定性。在本发明的一个优选实施方案中，相对于相应的野生型酶，突变型乳酸氧化酶具有至少1.5倍增加的稳定性，优选至少2倍增加的稳定性，优选至少2.5倍增加的稳定性，更优选至少3倍增加的稳定性。用于测定增加的稳定性的合适方法在实施例中详述。稳定性在20 mM HEPES、pH 8.1、150 mM NaCl、20 mM NaHCO3和0.02 - 1 mg/ml乳酸氧化酶的缓冲溶液中进行测定。
在本发明的一个更优选实施方案中，突变型乳酸氧化酶的特征在于相对于相应的野生型酶，突变型乳酸氧化酶具有与羟乙酸（glycolate）相比较对于乳酸至少2倍增加的选择性，优选至少2.5倍增加的选择性，优选至少3倍增加的选择性，更优选至少3.5倍增加的选择性，且最优选至少4倍增加的选择性，特别是如果突变型乳酸氧化酶包含在位置A95上的氨基酸置换，特别是Ala95Gly。用于测定增加的选择性的合适方法在实施例中详述。
在一个进一步方面，本发明涉及编码本发明的突变型乳酸氧化酶的核酸。
如本文使用的术语“核酸”一般涉及任何核苷酸分子，其编码本发明的突变型乳酸氧化酶，并且可以具有可变长度。本发明的核酸的实例包括但不限于质粒、载体或任何种类的一种或多种DNA和/或RNA片段，其可以通过标准分子生物学程序包括例如离子交换层析进行分离。本发明的核酸可以用于特定细胞或生物的转染或转导。
本发明的核酸分子可以以RNA的形式，例如mRNA或cRNA，或以DNA的形式，包括例如cDNA和基因组DNA，例如通过克隆获得的或通过化学合成技术或通过其组合产生的。DNA可以是三链、双链或单链的。单链DNA可以是编码链，也称为有义链，或它可以是非编码链，也称为反义链。如本文使用的核酸分子还尤其指单和双链DNA或RNA，其为单和双链RNA的混合物的RNA以及其为单和双链区的混合物的RNA，其可以是单链或更一般地双链或三链的包含DNA和RNA的杂交分子，或单和双链区的混合物。此外，如本文使用的核酸分子指包含RNA或DNA或RNA和DNA的三链区。
此外，核酸可以含有一个或多个修饰碱基。此类核酸还可以含有例如在磷酸核糖主链中的修饰，以增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。因此，具有由于稳定性或其他原因修饰的主链的DNA或RNA是“核酸分子”，因为那个特征是在本文中预期的。此外，仅举2个例子，包含稀有碱基例如肌苷或修饰碱基例如三苯甲基化碱基的DNA或RNA是在本发明的背景内的核酸分子。应当理解广泛多样的修饰已对于DNA和RNA作出，其发挥本领域技术人员已知的许多有用目的。如它在本文中采用的，术语核酸分子包含此类化学、酶促或代谢修饰形式的核酸分子，以及病毒和细胞尤其包括简单和复杂细胞特有的化学形式的DNA和RNA。
此外，编码本发明的突变型乳酸氧化酶的核酸分子可以是使用标准技术例如标准克隆技术，与任何所需调节序列、前导序列、异源标记序列或异源编码序列功能连接的，以产生融合蛋白。
本发明的核酸可以最初在体外或在培养中的细胞中形成，一般而言，通过经由内切核酸酶和/或外切核酸酶和/或聚合酶和/或连接酶和/或重组酶或熟练从业者已知的其他方法的核酸操作，以产生核酸。
在一个进一步方面，本发明涉及包含本发明的核酸的表达载体，其中核酸与能够促进核酸在宿主细胞中的表达的启动子序列可操作地连接。
如本文使用的，术语“表达载体”一般指可以用于在细胞中表达目的蛋白质的任何种类核酸分子（还参见上文关于本发明的核酸的细节）。特别地，本发明的表达载体可以是本领域技术人员已知的任何质粒或载体，其适合于在特定宿主细胞中表达蛋白质，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌细胞和酵母细胞。本发明的表达构建体还可以是这样的核酸，其编码本发明的乳酸氧化酶，并且用于后续克隆到各自载体内以确保表达。用于蛋白质表达的质粒和载体是本领域众所周知的，并且可以从不同供应商商业购买，包括例如Promega（Madison，WI，美国）、Qiagen（Hilden，德国）、Invitrogen（Carlsbad，CA，美国）或MoBiTec（德国）。蛋白质表达的方法是本领域技术人员众所周知的，并且例如在Sambrook等人，2000（Molecular Cloning: A laboratory manual，第3版）中描述。
载体可以另外包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点，一种或多种治疗基因和/或可选标记基因和本领域已知的其他遗传元件，例如指导编码蛋白质的转录、翻译和/或分泌的调节元件。载体可以用于转导、转化或感染细胞，从而促使细胞表达除对于细胞天然的那些外的核酸和/或蛋白质。载体任选包括帮助达到核酸进入细胞内的材料，例如病毒颗粒、脂质体、蛋白质外壳等。众多类型的合适表达载体是本领域已知用于蛋白质表达的，通过标准分子生物学技术。此类载体选自常规载体类型中，包括昆虫，例如杆状病毒表达或酵母、真菌、细菌或病毒表达系统。其中众多类型是本领域已知的其他合适表达载体也可以用于这个目的。用于获得此类表达载体的方法是众所周知的（参见例如Sambrook等人，同上）。
如上文详述的，编码本发明的突变型乳酸氧化酶的核酸与适合于驱动蛋白质在宿主细胞中的表达的序列可操作地连接，以便确保蛋白质的表达。然而，在本发明内包含请求保护的表达构建体可以代表中间产物，其后续克隆到合适的表达载体内，以确保蛋白质的表达。本发明的表达载体可以进一步包含所有种类的核酸序列，包括但不限于多腺苷酸化信号、剪接供体和剪接受体信号、间插序列、转录增强子序列、翻译增强子序列、一种或多种药物抗性基因或类似的。任选地，药物抗性基因可以与内部核糖体进入位点（IRES）可操作地连接，所述内部核糖体进入位点可以是细胞周期特异性或细胞周期依赖性的。
如本文使用的术语“可操作地连接的”一般意指基因元件像这样排列，从而使得它们对于其预期目的协同起作用，例如因为转录通过启动子起始并且通过编码本发明的蛋白质的DNA序列进行。即，RNA聚合酶将编码融合蛋白的序列转录成mRNA，其随后剪切且翻译成蛋白质。
如本发明的背景中使用的术语“启动子序列”一般指与下游编码序列可操作地连接的任何种类的调节DNA序列，其中所述启动子能够结合RNA聚合酶且起始编码的开放读码框在细胞中的转录，从而驱动所述下游编码序列的表达。本发明的启动子序列可以是本领域技术人员已知的任何种类的启动子序列，包括但不限于组成型启动子、诱导型启动子、细胞周期特异性启动子和细胞类型特异性启动子。
本发明的核酸或表达载体可以包含在宿主细胞中。相应地，本发明的另一个方面涉及包含本发明的核酸或表达载体的宿主细胞。本发明的“宿主细胞”可以是适合于在重组DNA技术中应用的任何种类的生物，并且包括但不限于所有类别的细菌和酵母菌株，其适合于表达一种或多种重组蛋白质。宿主细胞的实例包括例如多种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或大肠杆菌（E. coli）菌株。多种大肠杆菌细菌宿主细胞是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于菌株例如DH5-α、HB101、MV1190、JM109、JM101或XL-1蓝，其可以从不同供应商商业购买，例如Stratagene（CA，美国）、Promega（WI，美国）或Qiagen（Hilden，德国）。特别合适的宿主细胞还在实施例中描述，即大肠杆菌BL21 Gold细胞。可以用作宿主细胞的枯草芽孢杆菌菌株包括例如1012野生型：leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1和168 Marburg: trpC2（Trp-），其例如从MoBiTec（德国）商购可得。
根据本发明的宿主细胞的培养是技术人员已知的常规程序。即，编码本发明的突变型乳酸氧化酶的核酸可以通过重组方法引入一种或多种合适的宿主细胞内，以产生各自的蛋白质。这些宿主细胞可以是任何种类的合适细胞，优选细菌细胞例如大肠杆菌，其可以在培养中进行培养。在第一个步骤时，这种方法可以包括各自基因克隆到合适的质粒载体内。质粒载体广泛用于基因克隆，并且可以容易地引入即转染到已变得对于DNA可瞬时渗透的细菌细胞内。在蛋白质已在各自的宿主细胞中表达后，可以收获细胞且充当用于制备含有目的蛋白质的细胞提取物的原材料。含有目的蛋白质的细胞提取物通过细胞的裂解获得。借助于化学或机械细胞裂解制备细胞提取物的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于例如低渗盐处理、匀浆化或超声破碎。用于培养宿主细胞用于表达本发明的突变型乳酸氧化酶的合适方法的实例在实施例1和2中描述。
本发明的另一个方面涉及测定样品中的乳酸的方法，该方法包括
a）在有助于乳酸氧化酶的活性的条件下，使样品与本发明的突变型乳酸氧化酶接触；和
b）测定
i）在乳酸的存在下由突变型乳酸氧化酶产生的丙酮酸和/或H2O2，和/或
ii）在乳酸的存在下由突变型乳酸氧化酶消耗的O2，
从而测定乳酸。
上述方法基于根据下述方案乳酸氧化酶可以用于催化L-乳酸至丙酮酸的氧化的事实：
L-乳酸 + O2 → 丙酮酸 + H2O2
在本发明的方法的第一个步骤中，使样品与本发明的突变型乳酸氧化酶接触。样品与突变型乳酸氧化酶的接触可以是直接的（例如在液体测定中）或间接的（例如在其中仅样品的部分（含有分析物）接触突变型乳酸氧化酶的传感器系统中）。
显而易见的是接触应在有助于乳酸氧化酶的活性的条件下执行，即允许酶将乳酸氧化为丙酮酸。孵育步骤可以从约5秒到几小时，优选从约10秒到约10分钟不同。然而，孵育时间将取决于测定形式、溶液体积、浓度等。通常测定将在环境温度或伴随执行的其他测试形式所需的温度（例如25℃ - 38℃；例如30℃或37℃）执行，尽管它可以在温度的范围例如10℃ - 40℃进行。
任选地，酶可以在与样品接触前安装至或固定到支持层上，以促进测定。支持层的实例包括以例如微量滴定板、玻璃显微镜载玻片或盖玻片、棒、珠或微珠、膜（例如在测试条中使用的）和生物传感器的层的形式的玻璃或塑料。
样品可以是怀疑含有乳酸的任何样品，包括来自受试者的样品。术语“来自受试者的样品”包括从任何给定受试者特别是人中分离的所有生物学液体、排泄物和组织。在本发明的背景中，此类样品包括但不限于血液、血液血清、血液血浆、乳头抽吸物、尿、精子、精液、精浆、前列腺液、排泄物、泪、唾液、汗、活组织检查、腹水、脑脊髓液、乳、淋巴液、支气管和其他灌洗样品、或组织提取样品。优选地，受试者是动物（包括人），更优选哺乳动物，更加优选人。
可替代地，怀疑含有乳酸的样品还可以是含有乳酸的食物或饮料样品，如酸奶酪、山羊乳酪或乳以及发酵或细胞培养基。
一般地，血样是用于在本发明的背景中使用的优选测试样品。为此，血液可以从静脉中通常从肘的内部或手背中抽取。特别地，在婴儿或幼儿中，称为刺血针的尖锐工具可以用于刺破皮肤且使得其出血。血液可以例如收集到吸管内或载玻片或测试条上。
在接触和氧化乳酸(如果存在)后，测定在乳酸的存在下由突变型乳酸氧化酶产生的丙酮酸和/或H2O2和/或消耗的O2，从而测定样品中的乳酸。明显地，由突变型乳酸氧化酶产生的丙酮酸和H2O2量以及消耗的O2量与样品中存在的乳酸量关联。
用于测定丙酮酸、H2O2和/或O2的多种方法是本领域已知的，并且可以使用这些中的任何。
用于测定丙酮酸的示例性方法包括比色法（例如通过在340 nm测量乳酸脱氢酶介导的NADH/NAD+转换）、气相色谱法、HPLC分析等。涉及乳酸脱氢酶且使丙酮酸氧化酶脱羧的方法也是技术人员已知的。
用于检测H2O2的已知方法包括经典分析方法，例如H2O2介导的CrO3至CrO（O2）2的转换，涉及碘化物和淀粉的方法，光度测定法（还参见下文）、光学方法（任选在比色杯中或用传感器通常伴随辣根过氧化物酶介导的染料氧化）、荧光法例如通过H2O2的过氧化物酶介导的10-乙酰基-3,7-二氢吩噁嗪至试卤灵（在590 nm读出）的氧化、发光测定法（luminometric method）（例如使用鲁米诺的化学发光）和安培测定法例如基于工作电极（例如相对于AgAgCl在650 mV的铂电极）通过H2O2的阳极氧化，其中所得到的电流指示H2O2的量。在本发明的一个优选方法中，酶过氧化物酶可以用于H2O2的测定。
用于测定H2O2的特别合适的方法在下述中描述：对于H2O2的测定，可以使用酶过氧化物酶。过氧化物酶特别用于在使用H2O2的存在下生成有色染料。反应可以如下：
H2O2 + H供体 + 色原前体 → 色原 + 2 H2O
形成的颜色的强度与L-乳酸浓度成正比，并且可以通过测量吸光度中的增加进行测定。
合适的色原前体（和用于读出的合适波长）包括
－ ABTS: 2,2’-连氮基-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸（6）]（在410 nm读出）
－ 4-APP: 4-氨基安替比林（在510 nm读出）
－ TMB: 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（在450 nm读出）
多种过氧化物酶底物包括色原前体例如从Sigma-Aldrich（St. Louis，MO，美国）商购可得。
尽管存在用于过氧化物酶的许多合适的生色和发光（luminogenic）底物，但存在使用的极少的荧光过氧化物酶底物。荧光过氧化物酶底物例如二氢荧光素（也称为荧光素）、二氢罗丹明和二氢乙啶（氢化乙啶）在酶和过氧化氢的存在下转换为荧光产物。稳定和灵敏的荧光底物的实例是10-乙酰基-3,7-二氢吩噁嗪（ADHP）。
过氧化物酶可以是依赖于H2O2的存在能够将色原前体转换为色原的任何过氧化物酶。频繁使用的过氧化物酶是辣根过氧化物酶。
用于测定O2的示例性方法包括气相层析、例如用克拉克电极的安培测定法、或荧光法例如涉及O2引起的特定染料的荧光猝灭。O2的测定可以涉及氧光极。光极（optode或optrode）是光传感器装置，其通常借助于化学转导物光学测量特异性物质（例如O2）。
对于通过乳酸氧化酶的乳酸氧化，可以使用介质代替O2。如果如此，那么可以测定介质而不是O2的浓度。这一般用于测试条，以便保证不依赖于环境氧。
依照本发明的方法，通过测定在乳酸的存在下由突变型乳酸氧化酶产生的丙酮酸和/或H2O2和/或消耗的O2测定乳酸。该方法以这样的方式进行设计：由突变型乳酸氧化酶产生的丙酮酸和/或H2O2量与样品中的乳酸量成正比，并且消耗的O2量与样品中的乳酸量成反比。相应地，样品中的乳酸量可以衍生（例如计算）自产生的丙酮酸和/或H2O2和/或消耗的O2量。用于此类计算的一般方法包括标准曲线，校正等。
该方法可以例如用作诊断测定。如上文详述的，改变的乳酸水平可以与乳酸酸中毒相关，即乳酸/乳酸根（lactic acid/lactate）的累积。如果乳酸水平相对于对照或参考是改变的，那么这可以指示乳酸酸中毒，例如由于运动和/或疾病。
在诊断方法中，对于样品测定的乳酸值可以与参考相比较。参考可以是来自健康受试者的样品或由一组健康受试者测定的。可替代地，它可以是已知参考值。对于人血样和人血浆样品，分别在0.5-2.2 mmol/L（优选1.0-1.8 mmol/l）和0.9-1.7 mmol/L的范围中的乳酸浓度通常视为正常的。如果乳酸测定用于监控训练，那么在耐力训练过程中的血液乳酸浓度应直到3-4 mmol/L。在长期训练期间（超过45分钟）过程中，更低的乳酸浓度是优选的（约或小于2 mmol/L）。在耐力训练过程中，应避免超过4 mmol/L的乳酸浓度。
本领域技术人员了解评估2个值是否彼此显著不同的统计程序，例如斯氏t检验或卡方检验。此外，技术人员了解如何选择合适对照。
该方法可以在所谓的液体或湿润测试中例如在比色杯中执行，或作为在合适试剂载体上的所谓的干燥测试，必需测试试剂从而存在于固体载体中或上，所述固体载体优选是吸收剂或可膨胀材料。
在一个优选实施方案中，H2O2的测定可以通过转换成色原执行，特别是如上所述通过过氧化物酶介导的转换。
可替代地或另外地，突变型乳酸氧化酶可以是传感器、测试条、测试元件、测试条装置或液体测试的部分。
传感器是测量物理/化学数量的实体，且将其转换成可以通过观察者或仪器阅读的信号。在本发明中，突变型乳酸氧化酶可以是传感器的部分，其中传感器将乳酸转换成信号例如颜色中的变化或在显示器或监视器上展示的值。
在一个实施方案中，乳酸传感器可以由突变型乳酸氧化酶和安培测定装置组成，以测定样品的过氧化氢。此外，与电化学流动池偶联的微透析系统可以用于样品或受试者中乳酸的连续监控。流动池的工作电极可以用固定在电极表面上的氧化还原剂聚合物膜中的突变型乳酸氧化酶进行制备。电化学乳酸传感器与微透析直接偶联消除用后置柱氧化酶反应器将样品等分试样转移到液体层析系统的需要。来自微透析探针的透析液中的乳酸可以在酶电极上选择性检测，而无来自其他可氧化种类的显著干扰。此外，酶偶联的生物传感器已在本领域中描述。依照这点，突变型乳酸氧化酶可以与表面偶联（例如通过将突变型乳酸氧化酶/石墨混合物印刷到电镀了的石墨垫上或通过突变型乳酸氧化酶吸附或固定在碳粒、镀铂碳粒、碳/二氧化锰颗粒、玻璃碳上，或将其与碳糊电极混合等），以便电化学检测过氧化氢。
测试条或测试元件是用于测定在样品内靶物质的存在和/或数量的分析或诊断装置。标准测试条可以包括包含试剂的一个或多个不同反应区或垫，所述试剂当接触（例如浸入，且随后取出）样品时反应（例如变色）。测试条是例如来自EP 262445和US 4816224的许多实施方案中已知的。基于测试条技术的乳酸测试的商购可得实例是用于Roche Diagnostics（Mannheim，德国）的Accutrend仪的BM乳酸测试。通常已知执行测定方法所需的一种或多种试剂（例如酶）存在于固体载体层上或中。作为载体层，存在尤其优选的吸收剂和/或可膨胀材料，其由待分析的样品液体润湿。实例包括明胶、纤维素和合成纤维羊毛层。
突变型乳酸氧化酶还可以是液体测试的部分。液体测试是其中测试组分在液体介质中反应的测试。液体乳酸测试的商购可得实例是用于Roche Diagnostics（Mannheim，德国）的cobas c 111分析仪的乳酸测试。通常在实验室分析学领域中，液体试剂在水的基础上，例如缓冲盐溶液，以便提供所涉及的一种或多种酶的活性。液体通常适合于特定的预期用途。为了执行液体测试，将所有测试组分溶解于液体中且组合（或反之亦然）。用于执行此类测试的一般容器包括小瓶、多孔板、比色杯、器皿、试剂杯、管等。
在本发明的一个实施方案中，本发明的突变型乳酸氧化酶可以是固定的。一般固定方法包括例如与膜共价结合，装入聚合物中，与支持基质交联或固定在溶胶凝胶基质（例如玻璃例如硅酸盐玻璃）中或吸附在多孔底物上。用于固定酶例如乳酸氧化酶的合适方法是本领域已知的（参见例如Lillis等人，2000，Sensors and Actuators B 68: 109-114）。
本发明的另一个方面涉及本发明的突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的用途。涉及本发明的突变型乳酸氧化酶用于测定乳酸的用途的合适方法在上文描述。
在另一个方面，本发明提供了用于测定样品中的乳酸的装置，该装置包含根据本发明的突变型乳酸氧化酶和任选的进一步组分，例如对于所述测定所需的其他试剂。
本发明的突变型乳酸氧化酶可以是用于测定样品中的乳酸的装置的部分。装置可以是适合于这个目的的任何装置。装置可以是可以用于测定乳酸的机器或工具。优选地，装置是传感器，优选电化学传感器，或测试条。示例性装置在上文和下述中描述：
装置可以是传感器，例如生物传感器，其是用于检测分析物的分析装置，其将生物学组分（此处根据本发明的突变型乳酸氧化酶）与检测器组分特别是物理化学检测器组分组合。
生物传感器特别用于测定来自生物学样品特别是血液的多种分析物（包括乳酸）的浓度。基于电化学测试条形式的示例性生物传感器在美国专利号5,413,690；5,762,770和5,997,817中描述。
在本发明的（生物）传感器中，乳酸和O2在突变型乳酸氧化酶的存在下转换成丙酮酸和H2O2，并且任何产物中的增加或任何底物中的降低可以通过转导物或检测器元件进行监控。
特别地，乳酸传感器已与其他传感器组合，例如用于测定葡萄糖、胆固醇、甘油三酯、尿素、血液气体或电解质等。明显地，本发明的突变型乳酸氧化酶还可以用于这些多分析物装置中。
如上文详述的，传感器优选是电化学传感器。电化学传感器基于化学信号（此处乳酸的存在）翻译成电信号（例如电流）。合适的电极可以测量乳酸氧化酶介导的过氧化氢的形成，作为电信号。信号在电子从过氧化氢转移到电极后产生，并且在合适条件下，酶催化的电流流动与乳酸浓度成比例。
乳酸生物传感器的另一个商购可得实例是Roche Diagnostics（Mannheim，德国）的cobas b 123分析仪的可重复使用的乳酸传感器。对于可重复使用的生物传感器，2组主要的生物传感器已是商业化、基于膜的传感器（例如来自YSI、Eppendorf、Nova Biomedical and Radiometer），以及来自Bayer或Roche的厚膜生物传感器。
在本发明的一个实施方案中，传感器提供了电化学传感器，包括非导电底物、工作电极和覆盖工作电极的半透性膜，其允许乳酸和氧经过至电极。工作电极包括附着至底物的部分的导电材料和催化活性数量的乳酸氧化酶。传感器可以进一步包括具有附着至非导体底物的第二个部分的第二种导电材料的对电极。半透性膜可以由乙酸纤维素、聚氨基甲酸酯、硅酮化合物和本领域已知的其他材料形成。在本发明的另一个实施方案中，电化学传感器可以进一步包括参考电极。
在另一个示例性电化学传感器中，将突变型乳酸氧化酶固定在酶层中（例如经由自交联丙烯酸盐聚合物）。化学信号翻译成电信号通过响应H2O2的二氧化锰层来达到。进一步组分是除工作电极外的参考电极。示例性传感器也在Schaffar等人，1999，Clinical Chemistry 45（9）: 1678-1679中描述。
除突变型乳酸氧化酶外，本发明的装置还可以包含一种或多种进一步组分，例如对于所述测定所需或有帮助的其他试剂。组分可以是在本发明的方法和装置的背景中描述的那些中的任何。另外，这可以包括指导手册、刺血针装置、毛细吸管、进一步的酶（例如过氧化物酶）、底物（例如色原前体）和/或乳酸对照溶液等。
再在另一个方面，本发明提供了用于测定乳酸的试剂盒，其包含根据本发明的突变型乳酸氧化酶和对于所述测定所需的至少一种进一步试剂。
为方便起见，根据本发明的突变型乳酸氧化酶可以在试剂盒中提供，例如以预定量的试剂与用于执行（诊断）测定的说明书的包装组合。当需要时，试剂盒将包括底物、生色团的前体、进一步的酶（例如过氧化物酶）和由酶需要的辅因子。其他添加剂可以包括在试剂盒中，例如稳定剂、缓冲液（例如封闭缓冲液、裂解缓冲液或稀释缓冲液）等。试剂盒中提供的多种试剂的相对量可以广泛改变，例如以提供在试剂的溶液中的浓度，其基本上最佳化测定的灵敏度。试剂可以优选作为通常冻干的干粉提供，包括赋形剂，例如其在溶解时将提供具有合适浓度的试剂溶液。
本发明并不限于本文描述的特定方法学、方案和试剂，因为它们可以改变。进一步地，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且并不预期限制本发明的范围。如本文和附加权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参考，除非上下文另有明确说明。类似地，单词“包含”、“含有”和“包括”应包括在内地而不是排外地解释。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语和任何首字母缩写具有与本发明领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然本文描述了优选方法和材料，但与本文描述的那些相似或等价的任何方法和材料可以用于本发明的实践中。
下述附图和实施例预期举例说明本发明的多个实施方案。像这样，讨论的具体修饰不应解释为对本发明的范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是，可以制备多个等价物、变化和修饰，而不背离本发明的范围，并且因此应当理解此类等价实施方案要包括在本文中。
附图
图1A举例说明野生型乳酸氧化酶（◇）和突变型Tyr191Phe（●）的动力学表征。实验如实施例1中所述执行。
图1B举例说明野生型乳酸氧化酶（◇）和突变型Ala95Gly（●）的动力学表征。实验如实施例2中所述执行。
图2显示LOD野生型（◆）、Tyr191Phe（■）和Try191Leu（▲）的稳定性测定。活性针对起始值标准化。关于半衰期的下述值已得到测定：WT：4.5天；Tyr191Phe：9.8天和Try191Leu：7.4天。
实施例
实施例1: 具有增加的稳定性的乳酸氧化酶
1. 材料与方法
遗传学
含有野生型乳酸氧化酶（根据SEQ ID NO: 1）的质粒用作原材料。质粒是具有tac启动子的p-LO1质粒。相应地，蛋白质表达可以通过IPTG（异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷）诱导。此外，质粒具有氨苄青霉素抗性基因。
为了用苯丙氨酸置换在位置191上的氨基酸酪氨酸，使用下述引物：
为了用亮氨酸置换在位置191上的氨基酸酪氨酸，使用下述引物：
修饰的核碱基以粗体字母显示。编码置换的氨基酸的密码子通过下划线鉴定，并且关于限制性酶PvuI的识别序列以斜体字体显示。根据由Wang和同事（Wang等人，Biotechniques，1999，26，680-682）公开的方案执行两阶段PCR。其后，将PCR产物在37℃与DpnI一起孵育30分钟，并且随后在大肠杆菌BL21金细胞中转化。将细胞在LB氨苄青霉素板上划线培养，并且在第二天时，由其分离质粒DNA。在通过测序证实突变前，使用基于PvuI切割的测定选择质粒。
培养和纯化
如上所述的细胞在具有氨苄青霉素（100 mg/l）的LB培养基中在30℃培养，并且在已达到在595 nm处0.8的光密度后用IPTG（250 μM）诱导表达。在30℃4小时表达后，收获细胞，重悬浮于50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0；称为KPP）中且使用弗氏压碎器解离。通过超速离心去除细胞碎片，并且将粗提取物用于蛋白质纯化。
为此，在搅拌的同时，将大肠杆菌蛋白质的部分用1.5 M（NH4）2SO4沉淀。将上清液转移至HiTrap Phenyl FF疏水相互作用层析（HEC）柱（内径：16 mm；体积：64 ml；蛋白质: 30 mg）。其后，使用50 mM KPP，pH 7.0，1.5 M（NH4）2SO4（缓冲液A）至50 mM KPP，pH 7.0（缓冲液B）（流速2.5 ml/分钟）的梯度洗脱乳酸氧化酶。乳酸氧化酶峰可以在70%缓冲液B时得到鉴定。在至缓冲液B的缓冲液取代后，将10 mg蛋白质转移至阴离子交换柱（MonoQ）（内径: 5 mm；柱体积: 5 ml）。洗脱使用缓冲液B加上1 M KCl（缓冲液C）以1.5 ml/分钟的流速逐步执行。乳酸氧化酶在28% 缓冲液C时洗脱。在至缓冲液B的缓冲液取代后，获取100 μl的等分试样且冷冻。
活性的测定
活性使用Sigma Aldrich的方案进行测定，其中L-乳酸母液的浓度通过因子10减少至50 mM用于稳定性评估，并且反应体积通过因子2减少。
Sigma Aldrich的方案如下：
在H2O2的存在下，过氧化物酶介导氨基安替比林（4-AAP）和N,N-二甲基苯胺（DMA）的反应，以获得苯醌二亚胺染料。测试以下述条件执行：T = 37℃，pH = 6.5，A565nm，光程 = 1 cm，使用下述试剂：
A. 在37℃的200 mM 3,3-二甲基戊二酸-NaOH缓冲液，pH 6.5（DMGA）（使用3,3-二甲基戊二酸，Sigma产品编号D-4379在去离子水中制备5 ml，用1 M NaOH在37℃调整至pH 6.5。）
B. 15 mM 4-氨基安替比林溶液（4-AAP）（使用4-氨基安替比林，游离碱，Sigma产品编号A-4382在去离子水中制备1 ml。）
C. 在37℃的500 mM L（+）乳酸溶液，pH 6.5（乳酸）（使用L（+）乳酸，游离酸，Sigma产品编号L-1750在去离子水中制备1 ml。用1 M NaOH调整至pH 6.5。）
D. 过氧化物酶酶溶液（POD）（在使用前立即，在冷去离子水中由Horseradish，Sigma产品编号P-8250制备含有50红紫棓精单位/ml过氧化物酶II型的溶液。）
E. 在37℃具有0.010 mM黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的10 mM磷酸钾缓冲液，pH 7.0（酶稀释剂）（使用磷酸钾，一元，无水，Sigma产品编号P-5379和黄素腺嘌呤二核苷酸，二钠盐，Sigma产品编号F-6625在去离子水中制备50 ml。用1 M NaOH在37℃调整至pH 7.0。新鲜制备。）
F. 0.2%（v/v）N,N-二甲基苯胺溶液（DMA）（使用N,N-二甲基苯胺，Sigma产品编号D-8509在去离子水中制备10 ml。）
G. 0.25%（w/v）十二烷基苯磺酸溶液（DBS）（使用十二烷基苯磺酸，钠盐，Sigma产品编号D-2525在去离子水中制备5 ml。）
H. 乳酸氧化酶酶溶液（LOX）（在使用前立即，在冷试剂E中制备含有0.1 - 0.2单位/ml乳酸氧化酶的溶液。）
测定程序如下：
通过将下述试剂吸取（以毫升表示）到合适容器内制备反应混合物（cocktail）：试剂A（DMGA）2.00、试剂D（POD）1.00、试剂B（4-AAP）1.00、试剂C（乳酸）1.00、去离子水3.00。通过倒转混合且平衡至37℃。将下述试剂吸取（以毫升表示）到合适比色杯内：反应混合物0.80、试剂G（DMA）0.20。通过倒转混合且平衡至37℃。随后加入：试剂I（LOX）0.020用于测试样品或试剂E（酶稀释剂）用于空白对照。立即通过倒转混合且在37℃孵育确切地10分钟。随后加入：试剂H（DBS）2.00。通过倒转混合且使用合适的分光光度计对于测试和空白对照记录A565nm。
活性（U / mg酶）如下计算：
其中
3.02 = 测定的总体积
df = 稀释因子
35.33 = 苯醌二亚胺染料在565 nm处的毫摩尔消光系数。
0.5 = 基于1摩尔H2O2产生半摩尔苯醌二亚胺染料的转换因子
10 = 按照单位定义的测定时间（以分钟表示）
0.02 = 使用的酶体积（以毫升表示）
在1.02 ml反应混合物中，终浓度是39 mM 3,3二甲基戊二酸、5单位过氧化物酶、1.5 mM 4-氨基安替比林、49 mM L（+）乳酸0.04%（v/v）、N,N-二甲基苯胺、0.20 mM磷酸钾、0.20 μm FAD和0.002 - 0.004单位乳酸氧化酶。
1单位在37℃在pH 6.5每分钟将1.0 μmole L-乳酸氧化为丙酮酸和H2O2。
获得的数据根据下式拟合：
无底物抑制: v = vmax * [S] /（Km + [S]） （等式1）
底物抑制: v = vmax * [S] /（Km + [S] *（1 + [S] / [I]）） （等式2）
v = 反应速率，vmax= 最大限度速率，[S] = 底物的浓度，Km = 米氏常数， [I] = 抑制剂的浓度。
稳定性测定
为了更好地测定失活，使用下述条件进行加速稳定性测定：20 mM HEPES、pH 8.1、150 mM NaCl、20 mM NaHCO3和0.05 mg/ml乳酸氧化酶。在活性测定前将样品离心且在37℃进行孵育。
2. 结果
如上所述表达且纯化具有在位置191上的酪氨酸由苯丙氨酸（称为Tyr191Phe）或亮氨酸（称为Try191Leu）置换的突变型乳酸氧化酶。使用SDS凝胶层析证实纯度。
对于Tyr191Phe，突变型的比活性可以测定为23 U/mg。与野生型相比较，活性减少8倍。米氏或亲和常数Km对于突变型Tyr191Phe是0.017 mM，并且显著低于野生型的那种（0.897 mM）。此外，突变型还显示显著的底物抑制（如图1中所示，与野生型相比较，I = 48.4 mM）。
突变型Tyr191Phe的稳定性测定3周时期，由此定期获取样品且测定样品的活性。结果就t = 0而言标准化。为了更好地测定失活，进行加速稳定性测定（如上所述），由此通过环境条件的变化增加失活。对于选择的条件，野生型（对照）具有4.5天的半衰期。与之对比，突变型Tyr191Phe显示在这些条件下显著更高的稳定性，并且50%的原始活性在9.8天后达到，这等价于稳定性中的2.2倍增加。
对于Try191Leu，突变型的比活性可以测定为16 U/mg。与野生型相比较，活性减少12倍。米氏或亲和常数Km对于突变型Try191Leu是1.065 mM，并且几乎与野生型的那种（0.897 mM）相同。突变型Try191Leu显示无显著的底物抑制。
突变型Try191Leu的稳定性测定3周时期，由此定期获取样品且测定样品的活性。结果就t = 0而言标准化。为了更好地测定失活，进行加速稳定性测定（如上所述），由此通过环境条件的变化增加失活。对于选择的条件，野生型（对照）具有3.8天的半衰期。与之对比，突变型Try191Leu显示在这些条件下显著更高的稳定性，并且50%的原始活性在7.4天后达到，这等价于稳定性中的1.6倍增加。
可以得出结论与野生型相比较，突变型Tyr191Phe和Try191Leu具有显著改善的稳定性，并且可以急剧增加传感器和测试的寿命。
实施例2: 具有改善的选择性的乳酸氧化酶
1. 材料与方法
遗传学
如实施例1中所述的含有野生型乳酸氧化酶的质粒用作原材料。
为了用甘氨酸置换在位置95上的氨基酸丙氨酸，使用下述引物：
修饰的核碱基以粗体字母显示。编码置换的氨基酸的密码子通过下划线鉴定，并且关于限制性酶NcoI的识别序列以斜体字体显示。根据由Wang和同事（Wang等人，同上）公开的方案执行两阶段PCR。其后，将PCR产物在37℃与DpnI一起孵育30分钟，并且随后在大肠杆菌BL21金细胞中转化。将细胞在LB氨苄青霉素板上划线培养，并且在第二天时，由其分离质粒DNA。在通过测序证实突变前，使用基于NcoI切割的测定选择质粒。
培养和纯化
如上所述的细胞在具有氨苄青霉素（100 mg/l）的LB培养基中在30℃培养，并且在已达到在595 nm处0.8的光密度后用IPTG（250 μM）诱导表达。在30℃4小时表达后，收获细胞，重悬浮于50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0；称为KPP）中且使用弗氏压碎器解离。通过超速离心去除细胞碎片，并且将粗提取物用于蛋白质纯化。
为此，在冰上搅拌的同时，将大肠杆菌蛋白质的部分用1.5 M（NH4）2SO4沉淀。将上清液转移至High Trap Phenyl FF疏水作用层析（HIC）柱（内径：16 mm；体积：64 ml；蛋白质: 30 mg）。其后，使用50 mM KPP，pH 7.0，1.5 M（NH4）2SO4（缓冲液A）至50 mM KPP，pH 7.0（缓冲液B）（流速2.5 ml/分钟）的梯度洗脱乳酸氧化酶。乳酸氧化酶峰可以在70%缓冲液B时得到鉴定。在至缓冲液B的缓冲液取代后，将10 mg蛋白质转移至阴离子交换柱（MonoQ）（内径: 5 mm；柱体积: 5 ml）。洗脱使用缓冲液B加上1 M KCl（缓冲液C）以1.5 ml/分钟的流速逐步执行。乳酸氧化酶在28% 缓冲液C时洗脱。在至缓冲液B的缓冲液更换后，获取100 μl的等分试样且冷冻。
活性的测定
活性使用Sigma Aldrich的方案在37℃进行测定（参见实施例1）。
通过测定相对于羟乙酸（glyc）对于乳酸（lac）的各自催化效率Kcat / Km的比，计算对于L-乳酸的选择性（Rsel）（Rsel = [（Kcat,lac / Km,lac）/（Kcat,glyc / Km,glyc）]，其中Kcat（周转率）是每单位时间酶可以转换为产物的最大限度摩尔数的底物。获得的数据根据下式拟合：
无底物抑制: v = vmax * [S] /（Km + [S]） （等式1）
v = 反应速率，vmax= 最大限度速率，[S] = 底物的浓度，Km = 米氏常数
当测量底物抑制时，值Kcat / Km由在低底物浓度时的线性区域推断。
稳定性测定
为了更好地测定失活，使用下述条件进行加速稳定性测定：20 mM HEPES、pH 8.1、150 mM NaCl、20 mM NaHCO3和0.05 mg/ml乳酸氧化酶。在活性测定前将样品离心且在37℃进行孵育。
2. 结果
L-乳酸是乳酸氧化酶的优选底物。使用上述纯化方案，测定的44.5 sec-1活性。Km值测定为0.23 mM，导致193.4 sec-1 mM-1的催化效率。关于羟乙酸的催化效率在等同条件下测量。由于观察到的高底物抑制，在低底物浓度时的线性区域用于Kcat/Km（2.4 sec-1 mM-1）的测定。依照上述效率，乳酸的选择性Rsel是80.4。
突变型Ala95Gly如上所述制备且纯化至同质性。这通过SDS凝胶电泳加以证实。纯化的酶表征为野生型酶。相对于野生型，关于乳酸的Km值（0.63 mM）增加因子3，导致对于作为底物的乳酸（21.5 sec-1）的活性丧失。更小的底物羟乙酸再次显示强底物抑制。使用上述方法，测定0.089 sec-1 mM-1的催化效率Kcat/Km。效应的组合导致改变的选择性（通过比较催化效率测定的），其对于突变型Ala95Gly可以测定为Rsel = 384。与野生型相比较，选择性增加因子4.8（还参见表1）。
表1: 野生型乳酸氧化酶（WT）和突变型Ala95Gly的动力学常数
*: 由于强底物抑制，对于羟乙酸无法计算Km和Kcat值。如也在本申请的范围内所述的，在低底物浓度时的线性区域用于关于羟乙酸的Kcat/Km比测定。
野生型以及突变型Ala95Gly显示通过羟乙酸的底物抑制（参见图2），而L-乳酸未显示在这些浓度（0-50 mM）时的任何抑制。底物抑制还可以是关于显著更高的底物选择性的原因，这在使用未纯化的突变型Ala95Gly的初步测量中观察到（数据未显示）。这些活性测定在50 mM的底物浓度时进行，这伴随强抑制。
对于突变型表征的完成，它的稳定性还如实施例1中所述进行测定。与野生型（3.8天）相比较，突变型Ala95Gly的稳定性略微减少（2.3天）。
总之，可以显示突变型Ala95Gly（其由现有技术已经是已知的；参见Yorita等人，J. Biol. Chem.，1996，45，28300-28305）对于L-乳酸略微减少，但它对于乳酸的选择性显著改善。相应地，具有突变Ala95Gly的变体是用于在乳酸活性测定中例如在生物传感器和体外测试中使用的有利候选物。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶
以及涉及其的产品、方法和用途
<130> R67690EP
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 276
<212> PRT
<213> 绿浅气球菌(Aerococcus viridians)
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Glu Phe Gly Thr Ile Met Ser Ile Ser Ala Tyr Ser Gly Ala Thr
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<210> 8
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<212> DNA
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<220>
<223> A95Grev
<400> 8
agcgtgagct aaaccatggg caccaattgg ggccatgatg aatgg 45
机译： 具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶以及涉及该突变型的乳酸氧化酶的产品，方法和用途
机译： 具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶以及涉及该突变型的乳酸氧化酶的产品，方法和用途
机译： 具有增加的稳定性的突变型乳酸氧化酶以及涉及该突变型的乳酸氧化酶的产品，方法和用途
