一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法

摘要

本发明属于遗传工程技术领域。公开了一种高山植物长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法。该方法首次将CTAB法与SDS法相结合提取纯化长白山牛皮杜鹃基因组DNA，并且提取方法中，CTAB提取缓冲液中的PVP用量为4%，较常规方法增加了2%；?-巯基乙醇用量为4.3%，较常规方法增加了约1倍；65℃温浴时间由常规方法的1小时延长至4小时；并结合SDS法纯化所提取的基因组，成功地提取出了纯度高、质量好的长白山牛皮杜鹃基因组DNA。本发明克服了现有高山植物基因组提取困难、提取的基因组纯度低、易降解的不足，对于后续的分子水平研究及高山植物基因组的研究均具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高山植物基因组DNA提取的方法，属于基因工程技术领域，具体的说涉及一种长白山牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法。

背景技术

由于高山植物环境条件恶劣，所以高山植物通常被认为是陆地上最为极端的生物，但是高山植物却也拥有丰富极具价值的基因资源。自1896年以来，作为生物进化研究中的热点和难点，高山和极地植物对生境的适应机制和策略一直倍受研究者们的关注。高山植物基因组DNA的提取技术是进行植物分子生物学研究的基本技术之一，DNA产率的高低，质量的好坏直接影响到后续实验的成败。探讨高山植物基因组DNA的提取方法是一项非常有意义的工作，为确保在农作物环境胁迫抗性育种方面提供优异种质和选择指标、为农业基础研究与基因工程提供相关基因。将这种特殊的基因资源应用在观赏陆地植物，将保护与合理利用有效结合，走人与自然和谐发展的可持续性发展道路，这不仅有利于该区域植被的生长发育、生态系统的稳定，更有利于地区经济的发展。

高山植物的基因组提取方法有多种，近年来，人们一直致力于研究一种高效快速的提取方法，但是由于物种的特异性，高山植物的基因组提取起来并不是那么方便，。高山植物生存的环境温度低，辐射强，在这样的环境中，植物生长极其缓慢，产物消耗减少，为提高其抵御寒冷和生理干旱方面，使部分糖分和脂类物质积累并储存于叶片组织细胞中，使得高山植物基因组DNA的提取难度加大。王卓伟，等在对桑叶DNA提取方法研究过程中发现PVP还能有效地去除多糖。罗志勇等在研究中对这种方法进行了几点改进:①提高CTAB的浓度;②对于含多酚类较多的植物，增加CTAB提取缓冲液中?-巯基乙醇的含量，同时加入PVP使其与多酚类物质结合形成复合物；③增加低盐沉淀缓冲液的量;④增加高盐溶液中盐的浓度。用改进的方法从人参、西洋参、三七等药用植物中分离获得了高纯度的DNA; Porebski,等在沉淀粗提 DNA时，将提取缓冲液中氯化钠的浓度提高至2.5 mol·L^-1以使DNA在高盐缓冲条件下优先沉淀，可更有效地除去多糖。余志雄对火龙果总DNA提取方法比较研究验证了CTAB法对火龙果基因组提取是有效，而且应雄美对两种不同甘蔗基因组DNA提取方法的比较，同时证明了SDS和CTAB法都能提取到基因组DNA并且对两种方法进行了改进。

长白山杜鹃是一种有代表性高山植物，在海拔1700 m-2500 m海拔带均有分布，其生理生化指标较为特殊，关于本研究中提到的长白山杜鹃基因组提取的方案也有多种，但是不同方法对不同植物的基因组提取效果大不相同。对于杜鹃的基因组DNA提取方面的研究还是很少的。赵喜华，等以杜鹃属常绿杜鹃亚属井冈山杜鹃树叶为材料分别采用CTAB法、碱裂解法、SDS法提取杜鹃基因组DNA，三种方法所提取的DNA纯度及产率有差别，其中CTAB法较好。庄得凤,曹后男,采用CTAB法（①取0.2 g 左右研磨好的新鲜叶片置于1.5 mL 离心管中, 加800 ul 经65℃预热的CTAB ( 2% CTAB; 100 mmol·L^- 1 Tris -HCl , pH8.0；20 mmol·L^- 1 EDTA；1.4 mol·L^- 1 NaC1；2% PVP ) 提取缓冲液, 研磨前加入2% β- 巯基乙醇；充分混匀后, 在水浴锅中65℃温浴1h；等）提取几个品种长白山杜鹃的基因组DNA, 所得的DNA 纯度高、质量好，但是牛皮杜鹃及孢叶杜鹃基因组未能提取出来。本实验用SDS法提取植物基因组（魏群.分子生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2007.）的方法：“取0.2g新鲜植物叶片，在液氮中研磨成粉末状；转移至2 mL离心管中，加入800 ul细胞提取液（pH 8.0，100 mmol·L^-1 Tris·HCl, 5 mmol·L^-1 EDTA, 500 mmol·L^-1 NaCl, 1.25% SDS, 100 ul β-巯基乙醇 ），充分混匀；65^oC水浴保温20分钟; 从水浴中取出离心管，加入250 ul 5 mol·L^-1 KCl溶液，混匀，冰浴20分钟；等”来提取长白山杜鹃的基因组，未能成功提取出其基因组DNA。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的在于克服现有技术对长白山杜鹃基因组DNA提取方法中，基因组提取困难、纯度低、易降解的不足，提供一种新的长白山杜鹃基因组DNA提取的方法，从而获得纯度高、稳定性强的长白山杜鹃基因组DNA。

本发明是按以下技术方案实现的：该方法采用CTAB法与SDS法相结合，即首先采用CTAB法提取牛皮杜鹃基因组，然后再采用SDS法纯化所提取的牛皮杜鹃基因组DNA。

该方法的具体步骤如下：

（1）、CTAB法提取牛皮杜鹃基因组DNA：

向提取容器内加入CTAB提取缓冲液，预热至65 ℃；将牛皮杜鹃新鲜叶片在研磨前加入?-巯基乙醇，加入量为CTAB提取缓冲液体积的4.3%V/V，经液氮研磨成冻粉状后迅速加入到上述预热的CTAB提取缓冲液中，充分混匀；于 65 ℃温浴4小时；然后按常规方法提取出基因组DNA；

（2）、结合SDS法纯化所提取的基因组DNA：

向上述CTAB法提取出的牛皮杜鹃基因组DNA溶液中加入1/10体积（SDS体积：基因组DNA溶液体积=1：10）2% 的SDS，冰浴10 分钟；加入1/10体积5 mol·L^-1 KAc，冰浴30 分钟；18 ℃下12,000 rpm离心10 分钟，取上清液；加入1/20体积2% 的 SDS，冰浴10 分钟；加入1/20体积5 mol·L^-1 KAc，冰浴30 分钟；离心，取上清液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗涤沉淀，溶解沉淀即为纯化的牛皮杜鹃基因组DNA。

所述的CTAB法提取牛皮杜鹃基因组DNA的具体步骤如下：

取2.0 ml离心管，加入700 ul的CTAB提取缓冲液，65 ℃预热； 取新鲜幼嫩牛皮杜鹃材料0.3 g，研磨前加入30 ul ?-巯基乙醇，液氮中研磨成冻粉末状并迅速将该冻粉转入上述离心管中，充分混匀；水浴中65 ℃温浴4小时；然后按常规方法提取出牛皮杜鹃基因组DNA粗品；

所述的结合SDS法纯化所提取的基因组的具体步骤如下：

向上述CTAB法提取出的牛皮杜鹃基因组DNA溶液中加入1/10体积2%  的SDS，冰浴10 分钟；加入1/10体积5 mol·L^-1 KAc，冰浴30 分钟；18 ℃下12,000 rpm离心10 分钟，取上清液；加入1/20体积2% 的 SDS，冰浴10 分钟；加入1/20体积5 mol·L^-1 KAc，冰浴30 分钟；离心，取上清液；酚氯仿抽提一次，取上清液；醇沉，洗涤沉淀，溶解沉淀即为纯化的牛皮杜鹃基因组DNA。

以上牛皮杜鹃基因组DNA提取的方法中，所述的CTAB提取缓冲液是由：2% CTAB，100 mmol·L^-1 Tris-HCl pH 8.0, 20mmol·L^-1 EDTA，1.4 mol·L^-1 NaCl，4% PVP组成；所述的酚氯仿是苯酚与氯仿按1：1体积比配制而成。

本发明具有以下有益的效果：

1、本发明的牛皮杜鹃基因组提取方法中，首次采取了CTAB法与SDS法结合，即CTAB法提取基因组之后，结合SDS法纯化所提取的基因组。

2、本发明的方法对现有的CTAB法和SDS法进行了有创造性的改进，具有突出的实质性特点和显著的进步，具体体现在 ：

    步骤(1) CTAB法提取牛皮杜鹃基因组DNA过程中：较常规的CTAB法比：CTAB提取缓冲液中的PVP用量增加了2%，即由2%增加至4%；研磨前?-巯基乙醇用量较常规的CTAB法，增加了约1倍，即由2%增加至4.3%；温育时间由常规的CTAB法1小时延长至4小时。

步骤(2) 结合SDS法纯化所提取的基因组过程中：SDS加量分别为0.2%（1/10体积2% 的SDS）与0.1%（1/20体积2% 的SDS），且是在基因组提取出来之后单独加入的，而常规的SDS法中，SDS的加量为1.25%，且是在基因组提取出来之前混合在细胞提取液中加入的；纯化步骤还分别用0.5 mol·L^-1与0.25 mol·L^-1的KAc代替了常规SDS法中的1.56 mol·L^-1 的KCl。

由于CTAB法与SDS法的结合与改进并用，克服了高山植物基因组与其它多糖、多酚类等次生代谢物难分离的困难。提取得到了用常规方法不易提取的牛皮杜鹃基因组DNA。

3、本发明的方法与其他植物基因组提取的方法相比，经检测，本发明获得的牛皮杜鹃基因组DNA，不仅提取效率高，而且基因组DNA的纯度高，不容易降解，为后续分子生物学的研究奠定了坚实基础，且操作简单可行，实用性强。

附图说明

    图1是海拔2000 m左右的长白山牛皮杜鹃实物照片图。

    图2是长白山极地杜鹃基因组DNA电泳检测结果图，其中1-为试剂盒快速提取的长白山杜鹃基因组DNA，2-为SDS法提取的长白山杜鹃基因组DNA，3,4-均为CTAB-SDS法提取的长白山牛皮杜鹃基因组DNA。

具体实施方式

下面结合实施案例对本发明作进一步说明：

一、CTAB-SDS法提取长白山杜鹃基因组DNA

（一）、改进CTAB法提取植物基因组DNA

 1、取0.4 g左右的长白山牛皮杜鹃新鲜叶片，液氮研磨成粉末状，置于2 ml离心管中，管中预先加入700 ul 经65 ^oC预热的CTAB提取缓冲液（2% CTAB，100 mmol·L^-1 Tris-HCl pH 8.0，20mmol·L^-1 EDTA；1.4 mol·L^-1 NaCl，4% PVP），研磨前加入30 ul β-巯基乙醇。

 2、迅速充分混匀后，在水浴锅中65 ^oC温浴4小时，每隔30 分钟轻轻摇匀。

3、加等体积（730 ul）的酚：氯仿（1：1）混合液，颠倒混匀混合物，18 ^oC下12000 rpm离心10分钟；重复一次。

4、取上清液，加3倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，-20^oC醇沉1-2小时。

5、18^oC下12000 rpm离心30分钟，弃上清液。

6、加入1 ml 70％乙醇，清洗沉淀，18℃下12000 rpm 离心6分钟；重复2次。

7、弃上清，风干沉淀。

8、加入适量103 ul (ddH₂O：胰RNA酶预混液)（100 ul：3 ul）溶解沉淀，37 ^oC水浴1小时。

9、加入等体积的酚：氯仿（1：1）混合液，颠倒混匀混合物，18 ^oC下12000 rpm离心10分钟。

 10、取上清液，加1/10体积3 mol·L^-1 NaAc(pH 5.2)，3倍体积的无水乙醇，-20 ^oC静置1-2小时。

11、18 ^oC下12000 rpm离心30分钟，弃上清液。

12、加入1 ml 70％乙醇，清洗沉淀，12000 rpm 18 ℃离心6分钟；重复2次。

 13、弃上清，风干沉淀。

 14、加入适量（30-80 ul）(ddH₂O：胰RNA酶预混液)溶解沉淀。

（二）、结合SDS法纯化植物基因组DNA

 15、在上述所提基因组DNA溶液中加入1/10体积 2% SDS，冰浴10分钟。

16、加入1/10体积 KAc（5mol/L），冰浴30分钟。

17、18 ^oC下12000 rpm离心10分钟，取上清液。

 18、重复上述步骤15—18，但1/10改为1/20。

19、加入1/10体积3 mol·L^-1NaAc，再加入3倍体积无水乙醇，-20 ^oC醇沉2小时，有白色絮状沉淀出现时取出。

 20、18 ^oC下12000 rpm离心30分钟，弃上清。

 21、加入1 ml 70％乙醇，清洗沉淀，18 ℃下12000 rpm 离心6分钟；重复2次。

 22、弃上清，风干沉淀，加入20ul ddH₂O溶解沉淀。

 23、短期用存于4^oC，长期保存存于-20^oC。

三、琼脂糖凝胶电泳检测（见图2）

用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳缓冲液为1×TAE，上样缓冲液为10×LoadingBuffer，分子量标准Marker为DL2,000，记录点样顺序及点样量（样品：5ul，Marker：DL2,000）。用紫外凝胶成像仪在紫外灯312nm下观察电泳结果，照相，保存。