一种产喜树碱的喜树内生真菌及其应用

摘要

本发明公开了一种产喜树碱的喜树内生真菌及其在制备喜树碱中的应用。深绿木霉LY357是从珙桐科植物喜树器官组织中分离得到的内生真菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏编号CGMCC6858。该菌株采用常规的液体发酵培养方法可应用于制备喜树碱，所得喜树碱主要存在于发酵液提取物中。深绿木霉LY357从喜树植物材料中分离获取的方法简单易操作，利用深绿木霉LY357发酵培养获得喜树碱的方法简单易操作，并且所得喜树碱产量较高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种内生真菌及其应用，特别是涉及一种喜树内生真菌及其在制备喜树碱中的应用，属于微生物真菌及由其制造或获得的物质技术领域。 

背景技术

喜树碱（CPT）属于萜类吲哚生物碱，是一种通过抑制拓扑异构酶I而发挥抗肿瘤活性的天然化合物，其抗肿瘤机制独特。喜树碱系列衍生物如10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康等是附加值极高的抗肿瘤药物，对多种器官组织的癌症病变均有效，已成为世界抗肿瘤药物市场上的主要品种。喜树碱最早由Wall等人于1966年从我国特有珙桐科植物喜树（Camptotheca acuminata）树皮中分离获得，后来又陆续在海木狗牙花(Ervatamia heyneana)、臭味假柴龙树(Nothapodytesfoetida)以及短小蛇根草(Ophiorrhizapumila)等植物中发现。喜树碱市场需求大，单纯靠从喜树中提取喜树碱已无法满足人们的需求（国际市场每年喜树碱需求量3000kg，但是全球喜树碱年产量仅600kg），同时也会造成资源的浪费和环境的破坏。因此，开展喜树内生真菌的分离及其代谢产物的研究，利用微生物发酵技术合成喜树碱，提高喜树碱产量成为喜树碱获取的重要途径。 

发明内容

本发明的目的就是提供一种喜树内生真菌菌株及其在喜树碱制备中的应用方法。该菌株从喜树植物材料中分离获取，通过发酵培养能够获得喜树碱，且产量较高。 

为实现上述目的，本发明提供一种从珙桐科植物喜树中分离得到内生真菌LY357，属深绿木霉（Trichoderma atroviride），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏编号CGMCC6858。 

从喜树中分离得到内生真菌LY357的ITS和5.8S rDNA碱基序列如SEQ ID NO.1所示为： 

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA 

测序结果SEQ ID NO.1递交http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast进行比对，根据BLAST结果并结合形态学特征得出结论，确证该菌株为深绿木霉，命名为深绿木霉LY357（Trichoderma atroviride LY357）。 

一种从喜树中分离深绿木霉LY357的方法：将喜树植物材料按照常规操作切段、清洗、消毒后接种到5%水琼脂固体培养基，28℃±2℃恒温培养2～3周，待植物材料长出菌丝，挑取菌丝移至沙氏琼脂固体培养基继续培养，最后经纯化后得到内生真菌深绿木霉LY357。按照接种的一般操作方法，经切段、清洗、消毒的喜树植物材料在接种前先切断，并将新切面接种到5%水琼脂固体培养基。 

上述深绿木霉LY357采用常规的液体发酵培养方法可应用于制备喜树碱。 

一种利用深绿木霉LY357获得喜树碱的方法，包括深绿木霉LY357菌株发酵培养步骤、喜树碱提取步骤；其特征在于：在所述发酵培养步骤中，将深绿木霉LY357菌株接种到沙氏琼脂液体培养基，摇床160±20rpm，28±2℃，发酵培养8～15d，得到发酵混合物；在所述喜树碱提取步骤中，将发酵混合物经4000rpm离心15min，过滤，分别收集滤液与菌丝体；所述滤液经氯仿-甲醇（V/V=4:1）混合溶剂萃取，有机相于40℃减压浓缩至干得到发酵液提取物；所述菌丝体研磨破碎，甲醇浸泡过夜，等体积氯仿-甲醇（V/V=4:1）混合溶剂萃取，有机相40℃减压浓缩得到菌丝体提取物；发酵液提取物或菌丝体提取物加入氯仿-甲醇（V/V=4:1）溶解，经针头过滤器过滤得到喜树碱粗提物。 

上述获得喜树碱的方法，依照常规操作必要时需要先制备种子液，包括菌种活化与种子培养。菌种活化中，活化培养基为沙氏固体培养基， 28±2℃，培养时间5～7d；种子培养中，培养基为沙氏液体培养基，28±2℃，摇床160±20rpm培养2～3d。 

深绿木霉LY357经发酵培养制得的发酵液提取物或菌丝体提取物的成分分析显示，喜树碱主要存在于发酵液提取物中，菌丝体提取物中仅含有痕量喜树碱。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1）从喜树植物中分离出新的喜树内生真菌深绿木霉LY357；（2）深绿木霉LY357具有产喜树碱特性，能够应用于制备喜树碱；（3）深绿木霉LY357经发酵培养具备较高的喜树碱产量（见表1）；（4）深绿木霉LY357分离方法简单易控制；（5）利用深绿木霉LY357获得喜树碱的方法简单易控制。 

表1深绿木霉LY357与现有产喜树碱株菌产量的比较 

喜树内生真菌深绿木霉LY357保藏信息：深绿木霉LY357（Trichoderma atroviride LY357）已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏日期2012年11月19日，保藏编号CGMCC6858。 

参考文献：内生真菌产生喜树碱及其类似物的研究进展，现代生物医学进展，2010，Vol.10NO.17 

附图说明

图1A，喜树碱标准品（I）与深绿木霉LY357发酵液提取物（II）的HPLC-DAD图，·为喜树碱； 

图1B，喜树碱标准品（I）与深绿木霉LY357发酵液提取物（II）所产喜树碱（II）的紫外波谱图； 

图2，喜树碱标准品（I）与深绿木霉LY357发酵液提取物所产喜树碱（II）的质谱图。 

图3，深绿木霉LY357的PDA固体培养（A）、SBA固体培养（B）、SBA液体种子培养（C）、SBA液体发酵培养（D）图。 

图4，深绿木霉LY357的系统发育树。 

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步描述。 

实施例一 

从喜树中分离内生真菌菌株LY357。 

1、试验材料 

1.1植物材料： 

选取正常健康生长的喜树器官或组织作为植物材料，如树根、树皮、果实、树叶、树枝等部位。 

采集植物材料按照常规操作切段、清洗、消毒。本实施方式采用自来水彻底冲洗除去尘土等杂物，用无菌手术刀将植物材料切成10mm×10mm小块，先后用浓度为75%乙醇浸泡5min，10%次氯酸钠溶液浸泡5min，1%Triton浸泡5min，无菌水冲洗5次，每次1min，最后用无菌滤纸吸除喜树各组织部位的表面水分，待用。 

1.2培养基： 

5%水琼脂固体培养基：琼脂含量为5%（W/W），用水配制，不添加任何营养成分。 

沙氏琼脂固体培养基（SBA固体培养基）：蛋白胨10g/l，葡萄糖40g/l， pH5.6，121℃高压灭菌30min。 

2、植物材料接种培养 

将准备好的植物材料按常规无菌操作方法接种培养。 

将准备好的喜树植物材料沿中轴切开，将新切面接种到5%水琼脂固体培养基上，28℃±2℃恒温培养2～3周；待植物材料新切面长出菌丝后，挑取菌丝移至SBA培养基上继续培养，条件28℃±2℃恒温培养；最后经纯化后得到内生真菌菌株LY357。 

将菌株LY357保藏于SBA固体斜面培养基上。 

实施例二 

利用喜树内生真菌菌株LY357获得喜树碱。 

1、培养基与萃取溶剂 

培养基：沙氏液体培养基（SBA液体培养基），组分同实施例一中SBA固体培养基，但不加入琼脂。 

萃取溶剂：氯仿-甲醇混合溶剂（V/V=4:1） 

2、喜树碱提取方法 

2.1发酵培养 

将实施例一中保藏的菌株LY357依照常规方法制备得到种子液。将50ml种子液接种到500ml SBA液体培养基中，28±2℃，摇床160±20rpm，培养8～15d，得到发酵混合物。 

2.2制备发酵提取物 

将发酵混合物经4000rpm离心15min，过滤，分别收集滤液和菌丝体。 

所得滤液用等体积氯仿-甲醇混合溶剂萃取，有机相于40℃减压浓缩 得到发酵液提取物；加入一定量萃取溶剂溶解，经针头滤器过滤得到喜树碱粗提物。 

所得菌丝体烘干研磨破碎，甲醇浸泡过夜，等体积氯仿-甲醇混合溶剂萃取，有机相于40℃减压浓缩得到菌丝体提取物；加入一定量萃取溶剂溶解，经针头滤器过滤得到喜树碱粗提物。 

实施例三 

利用喜树内生真菌菌株LY357获得喜树碱，其与实施例二相同之处不再重复，其不同之处在于在发酵培养前增加种子液制备步骤，包括菌种活化与种子培养。 

菌种活化：将实施例一中保藏的菌株LY357接种SBA固体培养基上进行活化，培养5～7d，得活化菌种； 

种子培养：将经活化的菌种接入50ml SBA液体培养基中，28±2℃，摇床160±20rpm，培养2～3d，制得种子液。 

试验例一 

菌株LY357发酵物的HPLC-DAD检测。 

采用HPLC-DAD分别检测实施例二或实施例三得到的发酵液提取物与菌丝体提取物。 

HPLC-DAD分析检测条件：Altima column C18柱（5μm,250mm×4.6mm），流动相A：甲醇，流动相B：水＋0.1%甲酸，柱温：35℃，流速：1ml/min；进样量：20μl；检测器：二极管阵列（DAD）；检测波长：254nm、266nm、373nm；梯度洗脱程序如表2所示： 

表2HPLC-DAD梯度洗脱条件 

时间（min） 0 12 30 39 45 流动相A% 5 50 80 98 98 流动相B% 95 50 20 2 2

[0058] 在上述条件下，喜树碱标准品的保留时间为：25.39min；内生菌株LY357发酵液提取物中喜树碱的保留时间为：25.37min。图1A所示为喜树碱标准品（I）与LY357菌株发酵液提取物（II）的HPLC-DAD图；图1B所示为喜树碱标准品（I）与深绿木霉LY357发酵液提取物（II）所产喜树碱（II）的紫外波谱图。HPLC-DAD结果显示，菌丝体提取物中仅含痕量喜树碱。 

试验例二 

产喜树碱内生菌菌株LY357的HPLC-DAD-MS确证。 

将经试验例一验证的含有与喜树碱标准品保留时间和紫外波谱图一致的发酵液提取物进行液质联用分析，确证该产物为喜树碱。图2所示为喜树碱标准品（I）与内生菌株LY357所产喜树碱（II）的HPLC-DAD-MS图。 

试验例三 

产喜树碱内生真菌菌株LY357的分类学鉴定，形态学鉴定部分。 

（1）固体培养基培养条件形态学特征 

将内生菌株LY357分别接种到SBA培养基、马铃薯琼脂固体培养基，28±2℃培养，观察菌落形态。 

菌株LY357在SBA培养基上生长迅速，菌落在3d内覆盖直径80mm的平板，呈辐射状，表面疏松、平坦，菌丝呈白色丝状，有椰子气味（图3A）；在马铃薯琼脂固体培养基上培养的第5d明显可见有孢子产生，最初为淡绿色，以后逐渐增多，呈现深绿色，产孢丛束排列成同心的轮纹（图3B）； 

（2）液体培养基培养条件形态学特征 

将内生菌株LY357接种到沙氏液体培养基，28±2℃，160±20rpm摇床培养，观察菌落形态。 

培养1～2d有少许1-2mm白色菌丝球出现，培养液澄清；培养3～4d时菌丝球直径增大至3～4mm，培养液澄清（图3C）；培养5～8d，菌球数量增多，白色菌球体直径为4～5mm，培养液澄清（图3D）。 

试验例四 

产喜树碱内生真菌菌株LY357的分类学鉴定，分子生物学鉴定部分。 

如实施例二或三所述制得菌株LY357发酵液，将发酵混合物经4000rpm离心15min，过滤，收集菌丝体；用灭菌去离子水冲洗菌丝体2次，离心去上清液；按照真菌基因组DNA抽提试剂盒（E.Z.N.A.TM Bacterial DNA Kit）的操作说明进行菌株LY357的基因组DNA提取；基因组DNA质量和浓度用UV-1100D紫外分光光度计（MAPADA，中国）检测，OD260/280为1.9，DNA质量佳。 

以获得的菌株LY357基因组DNA为模板，ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’为正向引物，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’为反向引物；PCR反应体系及反应条件：25μl2×Master Mix，ddH₂O20μl，正向、反向引物各2μl，DNA模板1μl；反应条件依试剂盒所列为94℃，3min变性后进入循环，循环参数为：94℃，30sec；55℃，30sec；65℃，1min；35个循环后于65℃再延伸5min，进行PCR扩增，获得ITS和5.8S rRNA扩增产物。 

将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，在600bp附近出现明显的目的扩增片段，表明已成功从LY357菌株扩增获得ITSrDNA。采用琼脂糖凝胶回收试剂盒（DP209，天根，中国）回收纯化该目的片段； 采用pGM-T克隆试剂盒（天根，中国），按照使用说明将回收的目的片段与pGM-T载体进行连接；将连接产物转化进入E.coli DH5α；进行蓝白斑筛选；挑选单克隆并培养在加有氨苄抗性的液体LB培养基中37℃，180rpm培养过夜；提取质粒，凝胶电泳检测、PCR验证正确的片段送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序，碱基序列结果见SEQ ID NO.1。 

将菌株LY357的ITS rDNA序列在NCBI数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）中应用BLAST分析进行同源性比较，该菌株ITS rDNA序列与同源性比较得到的序列相似性高的序列相似性都达到了99%以上，应用MEGA4.0软件中邻接法构建系统发育树，如图4所示。由此确定LY357菌株的分类地位，确定内生真菌LY357为深绿木霉（Trichoderma atroviride LY357）。