一株产生beta、alpha两种半乳糖苷酶的伊利诺类芽孢杆菌及应用

摘要

本发明公开了一株产生beta、alpha两种半乳糖苷酶的伊利诺类芽孢杆菌及应用，所述菌株命名为伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)KWT5，已于2012年11月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No：6889。本发明所述伊利诺类芽孢杆菌在最佳培养基上的bata-半乳糖苷酶酶活性是0.239±0.014U/mg，alpha-半乳糖酶酶活性是0.160±0.015U/mg，预示该菌株在乳制品、豆制品发酵和微生态制剂制备中具有潜在而广泛的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株产生beta、alpha两种半乳糖苷酶的伊利诺类芽孢 杆菌及应用。

背景技术

类芽孢菌属细菌是芽孢杆菌属分类上的新发展，1993年Ash等人将11个种从芽孢杆菌 中独立出来，成立了类芽孢菌属，至今已有22个种归属于类芽孢菌属。由于类芽孢杆菌产 生抗逆性强的芽孢，在产品开发上备受重视，是芽孢菌中具有开发潜力的菌种之一。近年来， 国内外对于类芽孢杆菌各方面应用研究报道日益增多，在生物农药、环境污染治理、发酵生 产环化糊精葡萄糖转移酶等方面取得了一定结果，但有关类芽孢菌产生半乳糖苷酶活性研究 尚未见报道。

根据作用糖苷键的不同，半乳糖苷酶可分为bata和alpha两种类型。Bata-半乳糖苷酶又 称乳糖酶，多用于发酵乳制品的加工。该酶水解乳糖为葡萄糖和半乳糖，降低牛奶中乳糖含 量。bata-半乳糖苷酶广泛分布于细菌、酵母和真菌中，尤其以乳酸菌存在最为普遍，因此发 酵乳制品更适合乳糖不耐受人群。

大豆中存在多种低聚糖如棉籽糖和水苏糖，它们属于α-半乳糖苷酶类寡糖，而人体内缺 乏水解这类寡糖的水解酶α-半乳糖苷酶，它们可不经消化吸收直接到达结肠，在结肠中被细 菌发酵产气，引起胃肠胀气，这类寡糖又称为抗营养因子。乳酸菌发酵的酸豆奶是人们喜爱 的饮品，多很乳酸菌如双歧杆菌、发酵乳杆菌具有α-半乳糖苷酶，也就是说，经过乳酸菌发 酵的酸豆奶中含有少量的棉籽糖和水苏糖。因此利用产生bata或alpha-半乳糖苷酶的益生菌 株，发酵的酸奶或豆奶其附加值将会大幅度提高。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株产生beta、alpha两种半乳糖苷 酶的伊利诺类芽孢杆菌及应用。

本发明所述的产生beta、alpha两种半乳糖苷酶的伊利诺类芽孢杆菌，分离自新疆传统 酸奶中，是一株利用乳糖产生乙酸、乳酸的类芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株命名为伊利 诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)KWT5，已于2012年11月27日保藏于“中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No：6889。

上述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889：革兰氏阳性， 兼性厌氧，以周生鞭毛运动，产生芽孢，芽孢端生；菌落较大且大小不均，无突起；其生理 生化特征是：接触酶为阳性，V-P反应阴性。不产硫化氢。吲哚反应阴性。不能还原硝酸盐。 详见表1。

表1伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889的生理生化特性

上述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889生长温度为 30-37℃，最适生长温度为37℃。

上述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889在LB培养基中 生长缓慢，并且能够产酸。在含有10g/L乳糖培养基中震荡培养24小时，pH下降到4.89， 乙酸产量为0.435g/ml，乳酸为0.059g/ml。

上述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889：LB培养基中 添加Mg²⁺、PO₄^3-，能促进该菌株生长。添加1mM MgSO₄，培养12小时，菌体密度从2.0 能提高到5.20；添加100mM PO₄^3-，菌体密度能提高到5.23。

最佳的适合伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889生长的培 养基配方如下，1升蒸馏水中含：酪蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g，酵母粉5g，乳糖10g， MgSO₄·7H₂O 0.25g，Na₂HPO₄·12H₂O 16.71g，KH₂PO₄2.72g，pH 7.0，115℃条件下灭菌20 分钟。

通过在美国生物工程信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) 查阅国际相关的基因库，发现有相似的(如表1所示)与本发明所述伊利诺类芽孢杆菌 (Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889菌株的16S rDNA基因序列，但却不完全相 同，说明本发明菌株是首次分离鉴定。

表1伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889菌株

16S rDNA与GenBank提交菌株序列相似性比较

名称 同源性(%) Paenibacillus durus strain YUPP-3 99% Paenibacillus sp.ZY-8 99% Paenibacillus xylanilyticus strain XIL 14 99% Paenibacillus illinoisensis strain JCM 9907 99%

本发明所述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889菌株在不 含有诱导物乳糖或IPTG的X-gal平板上呈现了蓝色菌落，说明该菌株产生的半乳糖苷酶是 组成型表达。其产生的bata-半乳糖苷酶为bgaP，alpha-半乳糖苷酶为agaP。

本发明从新疆传统酸奶中分离到一株利用乳糖产生乙酸、乳酸的伊利诺类芽孢杆菌 (Paenibacillus illinoisensis)，该菌株产生bata和alpha两种半乳糖苷酶，预示该菌株在乳制 品、豆制品发酵和微生态制剂制备中具有潜在的应用。

实验证实，本发明提供的伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No： 6889菌株在最佳培养基上的bata-半乳糖苷酶酶活性是0.239±0.014U/mg，酶活单位定义 为在37℃下，每分钟每毫克菌体蛋白释放的ONP的微摩尔数；alpha-半乳糖酶酶活性是0.160 ±0.015U/mg，酶活单位定义为在37℃下，每分钟每毫克菌体蛋白释放的PNP的微摩尔数。

具体实施方式

实施例1：本发明所述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889 菌株的筛选及生理生化特性

将从新疆传统酸奶中分离到的发酵乳品样品涂布在含有X-gal(终浓度40μg/ml)和乳 糖(1%)的LB平板上，倒置平板37°C培养24小时，挑取变蓝的单菌落，反复划线确定纯 菌落KWT5，接种到含有乳糖(1%)的LB培养基，显微观察个体形态及进行生化反应测定， 最终确定培养菌为伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)KWT5，将该菌株于2012 年11月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No：6889。

上述菌株为革兰氏阳性杆菌，兼性厌氧，以周生鞭毛运动，产生芽孢，芽孢端生；菌落 较大且大小不均，无突起；其生理生化特征是：接触酶为阳性，V-P反应阴性。不产硫化氢。 吲哚反应阴性。不能还原硝酸盐。最适生长温度为37℃。

上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，pH 7.0。 15g琼脂粉，121℃条件下灭菌15分钟。

上述X-gal和乳糖的LB培养基配制：在上述1升LB培养基中加入10g乳糖和40mg X-gal 显色剂。

实施例2：本发明所述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889 菌株培养条件优化

将伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889菌株转接到LB培 养基，37℃震荡培养，菌体生长缓慢，培养12小时后OD值为2.0，显微镜观察形成较多芽 孢，并且产生酸。在含有10g/L乳糖的LB培养基中震荡培养24小时，pH下降到4.89，乙 酸产量为0.435g/ml，乳酸为0.059g/ml。添加1mM MgSO₄，培养12小时，菌体密度从2.0 提高到5.20；添加100mM PO₄^3-，菌体密度提高到5.23。以芽孢菌中常用的培养基Tryptic Soy Agar中的主要成分酪蛋白胨和大豆蛋白胨(TS)为基础，对伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889培养基进行优化。在基本培养基TS的基础上，分别添加葡 萄糖(G，0.5%)、乳糖(L，0.5%)、磷酸盐缓冲液(PO₄^3-，100mM)和MgSO₄(1mM)， 记录菌体到达稳定期的时间、培养24小时后的pH值、稳定期菌体的OD值及菌体形态。结 果见表2。

表2Paenibacillus illinoisensis CGMCC6889的培养基优化

上述LB培养基配方如下，1升蒸馏水中含：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g氯化钠，pH 7.0。 15g琼脂粉，121℃条件下灭菌15分钟。

上述Tryptic Soy Agar培养基(TS)配方如下，1升蒸馏水中含：酪蛋白胨15g，大豆蛋 白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，pH7.3，115℃条件下灭菌20分钟。

通过实验确定最佳的适合伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No： 6889生长的培养基(YIL)配方如下，1升蒸馏水中含：酪蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g， 酵母粉5g，乳糖10g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，Na₂HPO₄·12H₂O 16.71g，KH₂PO₄2.72g，pH 7.0， 115℃条件下灭菌20分钟。

实施例3：本发明所述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No：6889 菌株的bata-和alpha-半乳糖酶活性

取过夜培养的本发明所述伊利诺类芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)CGMCC No： 6889菌株，以体积比为2%接种接种量接种在5ml实施例2所述最佳培养基(YIL)上，37℃ 震荡培养12小时后，6000×g离心5min收集菌体，pH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤2次，收集 菌体细胞，然后重悬在上述缓冲液中，冰浴超声破碎细胞，破碎程序为400W工作5s，间 隙5s，共90个循环。12000×g离心10min，取上清液，测定bata-和alpha-半乳糖苷酶酶活。

结果：

bata-和alpha-半乳糖苷酶酶活分别为0.239±0.014U/mg和0.160±0.015U/mg。

实验证实本发明所述菌株产生bata和alpha两种半乳糖苷酶，预示该菌株在乳制品、豆 制品发酵和微生态制剂制备中具有潜在的应用。

上述beta-galactosidase酶活检测方法：以ONPG为底物的酶活测定方法。

待测pH的缓冲液50μl、20mM的ONPG 40μl于待测温度孵育10min，加入10μl适 当稀释的酶液，于待测温度反应10min后，加入100μl 1M NaCO₃终止反应，使用酶标仪 在405nm检测光吸收值。从ONP标准曲线计算出释放的ONP摩尔数。酶活单位定义：在 指定条件下，每分钟每毫克菌体蛋白释放的ONP的微摩尔数，单位U/mg。

上述alpha-galactosidase酶活检测方法：以PNPG为底物的酶活测定方法。

待测pH的缓冲液50μl、20mM的PNPG 40μl于待测温度孵育10min，加入10μl适 当稀释的酶液，于待测温度反应10min后，加入100μl1M NaCO₃终止反应，使用酶标仪 在405nm检测光吸收值。从PNP标准曲线计算出释放的PNP摩尔数。酶活单位定义：在指 定条件下，每分钟每毫克菌体蛋白释放的PNP的微摩尔数，单位U/mg。