作为先兆子痫早期阶段标志物的HbF和A1M

摘要

通过测量样品中A1M以及一种或更多化合物HbA、HbF的水平并将所得值与参照值进行比较来诊断先兆子痫或预测其发生风险的方法。观察到通过使用A1M和HbF相关信息的组合改进了诊断或预测。

说明书

技术领域

本发明涉及胎儿血红蛋白(HbF)和(A1M)作为先兆子痫的标志 物的用途。

背景技术

先兆子痫(preeclampsia，PE)影响全部妊娠中的多达7-15％，并且 其是母体发病和致死的重要因素。PE的临床表现在孕中期和孕晚期出现。 较严重形式的早期发作型PE在第34孕周(gestational week，GW)之前 出现。症状经常是不清楚且多样的，例如头疼、视力模糊和浮肿。高血压 和蛋白尿不仅是疾病的标志，也是诊断所需的。

一般认为PE的发生分为两个阶段，其中第一阶段的特征是有缺陷的 胎盘形成，其导致胎盘中不均匀的血液灌注、缺血性再灌注损伤以及增加 的氧化应激。PE的第二阶段(即母体综合征)的特征为基于严重内皮损 伤的普遍性血管功能障碍，其最终导致血管收缩(vasoconstriction)、普 遍性血管炎症和多器官功能障碍。

尽管已有用于诊断PE的临床参数，但是PE的临床诊断仍然十分困 难，这主要是因为症状的模糊性。根据Schroeder BM(ACOG practice  bulletin on diagnosing and managing preeclampsia and eclampsia，15； 66(2)：330-1)和Redman CW&Sargent IL(Science；308(5728)：1592-4) 的观察，蛋白尿的量和高血压的水平与PE严重程度都没有很好的相关性。

由于没有用于预测和/或诊断PE的可靠生物标志物，最近在该领域投 入了大量的精力。但是，寻找良好的生物标志物非常有挑战性。许多提议 的标志物需要彼此组合和/或结合多普勒超声来进行评价，以提高诊断的 准确性。目前为止，已提议了一些标志物，但是无一被接受成为可用于临 床预测或诊断PE的生物标志物。两种抗血管发生因子是有希望的，其显 示出与PE的显著相关性：可溶性fms样酪氨酸激酶1(sFlt)和可溶性 endoglin，参见下列讨论和综述：Baumann et al.，Molecular aspects of  medicine 2007 Apr；28(2)：227-44，Grill et al.，Reprod Biol Endocrinol  2009；7：70，Levine et al.，The New England journal of medicine 2004 Feb 12；350(7)：672-83和Papageorghiou et al.，Current opinion in obstetrics& gynecology 2006 Dec；18(6)：594-600。

现有技术中已描述了一些诊断方法，但是其无一成功地用于大规模临 床。例如，US 5079171和US 5108898公开了可通过(例如借助夹心或竞 争免疫测定)鉴定孕妇血液、血浆或血清样品中的内皮细胞标志物-细胞 纤连蛋白(fibronectin)-的存在来诊断PE、怀孕诱导的高血压和子痫。 细胞纤连蛋白来源于在疾病过程中破裂或被破坏的内皮细胞。

一些研究表明，使用多普勒超声的预测率为约50％，特别是对于早 期发生的PE。

抗血管发生标志物sFlt是已广为探讨的用于孕中期和孕晚期的潜在 PE标志物。但是，在孕早期，sFlt水平与正常妊娠相比是未变化的，使 其不太适合用于预测PE。胎盘生长因子(placenta growth factor，PlGF) 也已被提议用作PE标志物，但是已有数据显示出有争议的结果。与使用 sFlt/PlGF组合所得的预测值相比，Endoglin在早期妊娠中具有较低的筛 选效率。

US5238819公开了使用测定血液中促有丝分裂因子的测定来诊断 PE。促有丝分裂因子是约160kDa的蛋白质化合物，其能够刺激成纤维 细胞有丝分裂。通过检测PE对象的血清或血浆所激活的细胞对放射性标 记胸苷的摄取来测定其存在。该标志物在母体血管床已发生损伤后出现， 因此是在疾病进程的后期。

WO 05/093413(Yale University和Brigham and Women’s Hospital) 公开了一种诊断孕妇中严重PE的方法，其包括测定脑脊液样品中游离血 红蛋白(Hb)水平。

目前，对于PE，尚没有已知的治愈方法。PE在严重程度上可以是多 样的，从轻微到危及生命。在卧床休息和经常监测的情况下，轻微形式的 PE可保持在轻微状态。对于中度至重度的情况，必须住院并处方血压药 物和抗惊厥药以防止突然发作。如果病症变得危及母亲或孩子的生命，那 么唯一的治愈方法就是终止妊娠，通常导致早产儿。

很明显，缺少PE的治疗方法并且长久以来缺乏在疾病发展到较严重 形式之前诊断PE的能力，使得需要诊断和治疗作为严重公共卫生问题之 一的PE的新方法。

发明内容

此处公开的本发明基于来自基因和蛋白质特征谱分析(profiling)研 究的数据，所述研究揭示了在获得自患PE妇女的胎盘血管腔中胎儿血红 蛋白(HbF)的合成和积累增加。另外，本发明人发现，HbF和血红素 清除剂α1-微球蛋白(A1M)的母体血浆和/或血清浓度与足月妊娠中该疾 病的严重程度具有相关性。

如本文所公开的，本发明人令人惊奇地发现，HbF比和A1M水平的 组合提供了特别精确的预测，并且可用作早期筛选PE的生物标志物。

具体实施方式

本发明人进行的研究表明，Hb诱导的氧化应激参与了PE的发生。 已在PE胎盘中观察到HbF基因的上调和其蛋白质的积累。游离的Hb(即 在红细胞外)及其代谢物血红素和铁通过形成活性氧物质(reactive oxygen  species，ROS)诱导了氧化应激。氧化应激可损伤血液-胎盘屏障，导致 HbF泄露进入母体循环并最终导致在母体血浆或血清中的水平升高。事 实上已经发现，在来自患PE妇女的血浆和胎盘中均发现，HbF、总Hb 和氧化应激标志物以及血红素清除剂和抗氧化内源蛋白A1M的水平升 高。

A1M是重要的血红素内源清除剂。其表达显示出应答于游离Hb和 ROS而上调。A1M大部分在肝脏合成和分泌，并快速分布到不同组织， 在这些组织中发现A1M以游离形式以及结合IgA、白蛋白和凝血酶原的 高分子量复合物的形式存在于血管外区室。Hb和A1M之间的生物和代 谢关联性还得到了我们目前所得结果的支持，因为在孕早期样品中HbF 和A1M都升高。在足月妊娠的PE中也显示A1M和Hb的同时升高。

如本文所述，A1M浓度以及一种或更多种的生物标志物HbA、HbF 或HbF比(总Hb/HbF)可用于预测发生PE的风险。针对HbF比和A1M 水平(尤其是它们的组合)所获得的预测值优于大部分其他有希望的PE 生物标志物。另外，HbF和A1M水平也可用于PE诊断和确定足月妊娠 中PE严重程度。

本发明的一个方面涉及HbF和A1M水平相组合用于诊断PE的用 途。因此，本发明的该方面涉及预测发生PE风险的方法，其通过测量对 象中HbF和A1M浓度(HbF和A1M水平)并将测得水平与参照值相联 系从而评估发生PE的风险。可以对包括尿、血液、血清或血浆、唾液在 内的样品测量所述浓度，最优选的对人血浆样品进行测量。可通过任何适 用的方法测量HbF和A1M水平，包括色谱、质谱以及最优选通过对HbF 的酶联免疫吸附测定即ELISA和对A1M的放射性免疫测定(RIA)。

本发明的另一个方面涉及HbF比和A1M水平用于诊断PE的用途。 为了针对来源于裂解的母体红细胞的HbF进行校正，使用总HbF/总Hb 的比(HbF比)。尽管在样品处理过程中很小心以尽可能降低技术上的血 细胞溶解，但是仍然经常发生血细胞溶解。通过使用HbF比，可评价大 多数样品而没有假阳性预测或诊断的风险。HbF比与A1M水平具有相关 性，由此提供了更精确的度量，其适用于预测发生PE的风险。因此，本 发明的该方面涉及通过下述方式预测发生PE风险的方法：测量对象中 HbA、HbF和A1M浓度(HbA、HbF和A1M水平)，计算HbF比和将 计算的HbF比及A1M水平与计划或参照值相联系从而提供发生PE风险 的指示。可通过任何合适的方法进行数学分析，所述方法包括回归分析或 逻辑斯蒂(logistic)回归分析，如二元逻辑斯蒂回归分析。可以对包括尿、 血液、血清、唾液在内的样品测定所述浓度，最优选的对人血浆样品进行 测定。可通过任何适用的方法测量HbF和A1M水平，包括色谱、质谱以 及最优选通过对HbF的酶联免疫吸附测定即ELISA和对A1M的放射性 免疫测定(RIA)或ELISA。

本发明的另一个方面涉及诊断PE或预测发生PE风险的方法，所述 方法的特征在于包括下列步骤：

a)测量对象中或来自对象的分离样品中A1M水平以及化合物HbA、HbF 中一种或更多种的水平，

b)将测量值与一种或更多种参照值进行比较以评估发生PE的可能性。

如上所述，与单独HbF相关的信息相比，与A1M和HbF水平相关 的组合信息提供了优点。

另外，所述方法中可包括额外的步骤，由此提供了用于诊断PE或预 测发生PE风险的方法，所述方法的特征在于包括以下步骤：

a)测量对象中或来自对象的分离样品中A1M水平以及化合物HbA、HbF 中一种或更多种的水平，

b)计算HbF比，

c)将测量值与一种或更多种参照值进行比较以评估发生PE的可能性。

另外，所述方法可进行修改，由此提供了用于诊断先兆子痫或预测其 发生风险的方法，所述方法的特征在于包括以下步骤：

a)测量对象中或来自对象的分离样品中A1M、HbA和HbF的水平，

b)计算HbF比，

c)将HbF比和A1M浓度与参照值进行比较以评估发生先兆子痫的可能 性。

作为另一个进展，可利用数学方法和分析，其中对测量值进行统计学 分析，由此提供了用于诊断PE或预测发生PE风险的方法，所述方法的 特征在于包括以下步骤：

a)测量对象中或来自对象的分离样品中A1M水平以及化合物HbA、HbF 中一种或更多种的水平，

b)计算HbF比，

c)将HbF比与A1M水平相关联，

d)将b)中计算的比、c)中计算的相关性数据或者a)中所测得的水平 与一种或更多种参照值进行比较以评估发生PE的可能性。

本发明的方法还可包括对所测值的统计学分析，如本文所解释的。因 此，可使用二元逻辑斯蒂回归分析，任选地结合似然性比值(likelihood  ratio，LR)检验，通过分析A1M水平和HbF比和/或作为独立测量值的 HbF、HbA或A1M水平来评估PE的诊断或其发生风险。

为了评估发生PE的风险，可解释测量值和/或计算值并与参照值组合 进行比较。

通过测量和分析对象中HbF水平，可评估发生PE的风险。如果测 得的HbF水平超过0.45μg/ml，例如0.75μg/ml例如1.0μg/ml、例如1.5μg/ml 例如2.5μg/ml，那么认为对象发生PE的可能性增加。

通过测量和分析对象中A1M水平，可评估发生PE的风险。如果测 得的A1M水平超过21μg/ml，例如23μg/ml、例如25μg/ml、例如30μg/ml、 例如35μg/ml、例如40μg/ml，那么认为对象发生PE的可能性增加。

通过测量和分析对象中HbA和HbF水平，可通过计算HbF比来评 估发生PE的风险。根据前述任一权利要求的方法，其中如果HbF比超 过0.0020，例如0.0025、例如0.0060、例如0.01，那么认为对象发生PE 的可能性增加。

通过测量和分析HbF、HbA和A1M水平、HbF，可通过计算HbF 比以及将HbF比与A1M水平相关联来评估发生PE的风险。这可通过例 如逻辑斯蒂回归来进行。

如图6所示，HbF比可与A1M水平组合使用以提高对发生PE的预 测。

通过将两个参数相组合，极大地增强了预测的精确性。如图6所示， 可定义A1M水平的特定参照值(图6中的值m)以及HbF比(图6中 的值n)，若超过所述参照值，则对象被视为发生PE的风险增加。

在本发明中，当对象被认为发生先兆子痫的可能性增加时，参照值 (m)约为21μg/ml，例如23μg/ml、例如25μg/ml、例如30μg/ml、例如 35μg/ml、例如40μg/ml。参照值(n)约为0.0020，例如0.0025、例如0.0060、 例如0.01。因此，如果超过参照值之一(由区域II和IV所示)，对象被 认为发生PE的风险增加。如果两个值均被超过(即图6中的区域III)， 则对象被认为发生PE的风险高度增加。

可测量分离自对象的样品中的标志物水平，最优选母体样品。

样品可包括血液、血浆、尿液和血清。本文描述了来源于母体静脉血 清/血浆的结果。可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定 (RIA)、蛋白质印迹、光谱法、LC-MS、MALDI-TOF MS、色谱等测定 所述水平。样品还可来自胎盘或尿。

样品可在整个妊娠期间从对象分离并进行分析，例如第3-42孕周， 例如第7-24孕周，例如第10-20孕周，例如第11-16孕周。

如果可能，可在第3-42孕周、例如第7-24孕周，例如第10-20孕周， 例如第11-16孕周对对象进行非侵入性测量。

可通过任何适用方法测定HbF水平，包括色谱、质谱以及最优选酶 联免疫吸附测定，即ELISA。

可通过任何适用方法测定A1M水平，包括色谱、质谱以及优选酶联 免疫吸附测定或放射性免疫测定(RIA)。

可通过任何适用方法测定总Hb水平以及HbA，包括色谱、质谱以 及优选酶联免疫吸附测定或放射性免疫测定(RIA)。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于测量和分析对象中或者分离自 对象的样品中A1M水平以及一种或更多种HbA或HbF水平的试剂盒。 除了测量A1M、HbA和HbF水平的工具之外，所述试剂盒可包含有关 如何对所测量数据实施统计学分析的指导，对所测量水平和参照值进行统 计学分析的算法，所述参照值可与测量值和/或计算值进行比较以评估发 生PE的风险。另外，所述试剂盒可提供自动化设备，以用于测量、计算 和PE风险评估，例如固定或便携式电子设备。

定义

在本公开中，除非另有指明，否则没有数量词修饰时表示“一个或多 个”。

本文使用的PE根据妊娠高血压研究国际协会所定义。因此，PE的 定义为：间隔至少四小时的血压的两个读数高于140/90mmHg，以及在 24小时内蛋白尿高于或等于300mg，或者如果24小时尿收集不可用，则 为中段或导管尿标本的试纸分析为至少2+的两个读数。或者，可适用术 语“先兆子痫”的其他定义，如根据例如美国妇产科学会命名委员会所建 立的标准，即高血压加蛋白尿、明显浮肿或者其两者。例如，PE可定义 为第20孕周后血压＞140/90mmHg并且蛋白尿＞0.3g/L。

本文定义的术语正常妊娠定义为在第37孕周后分娩并且血压正常。

血红蛋白A(HbA)。存在不同形式的Hb。成体Hb(HbA)由两条 α和两条β多肽链(Hbα、Hbβ)组成，其每个含有可逆地结合单个氧分 子的非肽血红素基团。Hb A2，另一种成体Hb成分，由两条α和两条δ 链(Hbα、Hbδ)构成。

在本公开中，术语“游离Hb”表示广义地游离Hb，其包括总游离 Hb、游离Hb A、游离Hb A2、游离Hb F、任何游离的Hb亚基(例如 Hbα、Hbβ、Hbδ或Hbγ)或者其任意组合。其还包括多肽(蛋白质)或 核苷酸(RNA)形式的这些Hb实体，当用作治疗靶标时除外。

胎儿血红蛋白(HbF)。术语“胎儿Hb”表示游离的HbF或者HbF 的任何亚基，其包括多肽(蛋白质)或核苷酸(RNA)形式的HbF实体， 当用作治疗靶标时除外。

在本公开中，在表述“游离Hb”、“游离胎儿Hb”或“游离Hb亚基 (例如Hbα、Hbβ、Hbδ或Hbγ)”中所用术语“游离”等表示游离地循 环于生物流体中的Hb、胎Hb或Hb亚基，其与表示分子驻留于细胞内 的细胞Hb相对。因此，术语“游离”在该意义下主要用于将游离Hb与 完好红细胞中存在的Hb区分开来。

本文使用的表示HbF比的术语涉及HbF/总Hb，因此通过用HbF水 平除以总Hb水平来计算。

在本公开中，术语“标志物”或“生物标志物”表示生物分子，优选 多肽或蛋白质，与从称为“正常”妇女/对象的妇女取得的相应样品相比， 其有差异地存在于从患PE妇女或发生PE风险增加的妇女取得的样品中， 所述“正常”妇女/对象不具有先兆子痫，发生PE的风险也没有增加。

术语“来自怀孕雌性哺乳动物的生物样品”、术语“对象”或者等同 的表述旨在表示来自哺乳动物自身的样品；因此，该样品并非获得自例如 胎儿或者羊水。

本文使用的胎儿Hb(缩写为HbF)表示Hb的类型，其为胎儿中 Hb的主要组分。胎儿Hb具有两条α和两条γ多肽链(Hbα、Hbγ)。

本文使用的α1-微球蛋白(A1M)表示被称为α1-微球蛋白的lipocalin 家族成员。在文献中，α1-微球蛋白可被称为A1M、EDC1、HCP、HI30、 IATIL、ITI、ITIL、ITILC和UTI。

在本公开通篇中，任何和所有参考文献通过引用具体地并入本专利申 请。

附图说明

图1：病例和对照的人口统计学图表

分娩时的孕周(gestational week，GW)、取样时间、出生体重、经产 和早产的数据。数据以中值(±2个标准差)或个数(％)显示。除e之外 使用Mann-Whitney U检验。

^a：p＝0.0001

^b：p＝0.03

^c：针对妊娠龄归一化后p＝0.001

^d：PE中27个为初孕，正常妊娠中18个为初孕。

^e：早产定义为在GW 37+0之前分娩，7个具有PE的患者在GW 34+0之 前分娩。

图2显示先兆子痫病例和对照中的HbF、A1M和总Hb的平均浓度。 使用二元逻辑斯蒂回归来确定显著性。

^a：由于组间差异不显著，所以未计算。

^b：HbF比定义为HbF浓度/总Hb浓度

^c：基于HbF比x100的比值比计算。这是由于HbF级分的值非常低

图3：HbF比、A1M水平以及两个参数之组合的灵敏度和特异性值。

^a：HbF比＝HbF浓度/总Hb浓度

^b：基于包含这两个参数的逻辑斯蒂回归。

图4：散点图

A：散点图提供了有关HbF比和取样时间的对照样品和PE之分布的图示。

HbF比＝HbF/总Hb

GW-取样：取样周数，

B：散点图提供了有关A1M水平和取样时间的对照样品和PE之分布的图 示。

A1M：以μg/ml计的所测A1M水平

GW-取样：取样周数。

图5：接受者操作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC) 曲线

ROC曲线提供了HbF比、A1M水平及其组合的特异性(X轴)和 灵敏性(Y轴)的图示。

图6：风险特征的图示

m：参照值，A1M

n：参照值，HbF比

灰度区域

I：低风险

II和IV：风险增加

III：风险高度增加

颜色梯度、黑色代表风险。

实施例

实施例1

患者和人口统计学

包含总计96位妇女。排除患其他疾病例如糖尿病和原发高血压的患 者。包含随后发生PE的60位妇女(病例)和36位正常简单妊娠的妇女 (对照)。所有对照在37+0GW后分娩。

在表1中显示特征。在60个病例中，20个病例在37+0孕周(gestational  week，GW)前分娩，其中7个在34+0GW之前分娩。所有妊娠结局获 得自主要分娩组数据库(main delivery suite database)，对每一个患者进 行检查。使用妊娠高血压国际研究协会对PE的定义：间隔至少四小时的 血压的两个读数高于140/90mmHg，以及在24小时内蛋白尿高于或等于 300mg，或者如果24小时尿收集不到，则为中段或导管尿标本的试纸分 析为至少2+的两个读数。正常妊娠定义为在37GW后分娩并且血压正常。 对照样品随机选自在相同时间段内参与研究的妇女。

在伦理委员会同意下招募患者，其为正在进行的针对PE的孕早期超 声和血清标志物的前瞻性研究的一部分，该研究是在定期前往伦敦圣乔治 医院产科进行产检的女性中开展的。从最后一次月经起计算妊娠龄，并通 过头臀径超声测量来确认。

实施例2

取样

在11至16GW收集母体静脉血清样品用于分析HbF、总Hb和A1M。 将静脉血收集到5ml不含添加剂的真空管(Beckman Dickson)中，使其 凝固，在室温下以2000g离心10分钟。

将血清保存于零下80摄氏度直至进一步分析。

实施例3

测定总Hb、HbF和A1M

如前所述，分别通过夹心法ELISA和放射性免疫测定(RIA)测定 HbF和A1M浓度。如前所述，使用抗成体Hb(HbA)的抗体通过竞争 ELISA测定血清中的总Hb浓度。计算HbF/总Hb的比，其称为HbF比。

实施例4

统计学分析

使用统计学计算机软件(SPSS)分析数据。使用二元逻辑斯蒂回归 分析与似然性比(LR)检验，针对HbF比和/或HbF、HbA或A1M水 平来分析发生PE的可能性。计算生物标志物的比值比(odd ratio，OR)。 因为HbF比显示较低的值，故将其乘以100，然后计算OR。在所有检验 中使用0.05的显著性水平。

基于逻辑斯蒂回归的结果绘制HbF、A1M、HbF比以及HbF比和 A1M的组合的ROC曲线。从ROC曲线计算曲线下面积(AUC)。逻辑 斯蒂回归允许我们计算不同筛选阳性率下的灵敏度。评价最优灵敏度水 平。通过计算Pearson相关系数的双变量相关性分析评价了三个生物标志 物之间的线性相关性。

实施例5

研究组

所包含病例和对照的人口统计学数据显示于图1和实施例1中。在分 娩时的妊娠长度上有预期的显著差异。与妊娠龄相关后，出生体重有显著 差异(p＝0.001)。PE血液样品平均比对照样品的收集晚8天(p＝0.018)。

实施例6

HbF比和A1M血浆水平

在所有样品中见到高浓度的总Hb，表明一定程度的血细胞溶解。通 过分光光度法验证了这一高水平(数据未显示)。但是，所研究的组之间 总Hb浓度没有显著差异，PE中为178μg/ml，对照中为206μg/ml(p＝0.232) (图2)。HbF的平均浓度为PE中1.38μg/ml，对照中0.45μg/ml。由于背 景血细胞溶解可以对HbF值有贡献，并且由于HbF水平与Hb总水平显 著相关，所以计算HbF比(HbF/总Hb)。相比于对照，PE中的平均HbF 比显著升高(p＜0.0001)(图2)。在散点图中显示了与妊娠龄相关的HbF 比(图3A)。相比于对照(21μg/ml)，PE中平均A1M水平(24μg/ml) 显著升高(p＝0.0001)。A1M水平与妊娠龄相关联，显示于散点图(图3B)。

实施例7

相关性分析

HbF水平和HbF比水平都不与A1M水平显著相关(p＝0.17，r＝0.16)。 但是，HbF水平与总Hb水平显著相关(p＝0.001，r＝0.35)，在PE病例 中甚至相关性更强(p＝0.005，r＝0.39)。总Hb和A1M的水平不显著相关 (p＝0.61，r＝-0.055)。

HbF比与妊娠龄的相关性

检验HbF比和A1M水平与取样时妊娠龄的相关性(如图1所示)。 对于HbF比和A1M，在10-16GW之间都未观察到与妊娠龄的相关性。 逻辑斯蒂回归和接受者操作特征(ROC)曲线

使用逻辑斯蒂回归来计算显著性和比值比(图2)。绘制ROC曲线(图 5)，获得HbF比、A1M及其组合的灵敏性和特异性。在图3所示的四个 不同截断值下分析结果。对于HbF比来说曲线下面积(AUC)为0.82， 而对于A1M来说是0.75，HbF比和A1M的组合则是0.89。两个生物标 志物的组合显示最高的预测值，在23％筛选阳性率时有最佳灵敏度90％ (图3)。

实施例8

通过HbF比和A1M水平的组合测量值进行的诊断

如前所述，分别通过夹心法ELISA和放射性免疫测定(RIA)测定 HbF和A1M浓度。使用抗成体Hb(HbA)的抗体通过竞争ELISA测定 血清中的总Hb浓度。计算HbF/总Hb的比，其称为HbF比。

如图6所示，HbF比可以与A1M水平组合使用，以改进对发生PE 的预测。

通过将两个参数相组合，极大地增强了预测的精确性。如图6所示， 可定义A1M水平的特定参照值(图6中的值m)以及HbF比(图6中 的值n)，若超过所述参照值，则对象被视为发生PE的风险增加。

在本发明中，当对象被认为发生先兆子痫的可能性增加时，参照值 (m)约为21μg/ml，例如23μg/ml、例如25μg/ml、例如30μg/ml、例如 35μg/ml、例如40μg/ml。参照值(n)约为0.0020，例如0.0025、例如0.0060、 例如0.01。因此，如果超过参照值之一(由区域II和IV所示)，对象被 认为发生PE的风险增加。如果两个值均被超过(即图6中的区域III)， 则对象被认为发生PE的风险非常高。