表达血凝素之转基因植物中生产的重组流感病毒样颗粒(VLP)

摘要

本发明提供了在植物或植物部分内合成流感病毒样颗粒(influenza virus-like particle，VLP)的方法。所述方法包括在植物中表达流感HA并通过体积排阻色谱进行纯化。本发明还涉及包含流感HA蛋白和植物脂质的VLP。本发明还涉及编码流感HA的核酸以及载体。所述VLP可用于配制流感疫苗，或者可用于充实现有的疫苗。

说明书

本申请是申请号为200980109781.5的中国专利申请的分案申请，原 申请是国际申请PCT/CA2009/000032的中国国家阶段申请。

本申请是2008年7月11日提交PCT申请No.PCT/CA2008/001281 的部分连续案并要求享有其优先权。本申请还要求享有2008年1月21 日提交的加拿大申请No.2,615,372以及2008年1月22日提交的美国申 请No.61/022,775的优先权。

技术领域

本发明涉及病毒样颗粒的生产。更具体而言，本发明涉及包含流感 抗原之病毒样颗粒的生产。

背景技术

流感是人由于呼吸道病毒引起的死亡的首要原因。常见的症状包括 发热、喉咙疼痛、气短和肌肉酸痛等。在流感季节，流感病毒感染全世 界10～20％的人口，每年导致250～500,000人死亡。

流感病毒是从受感染之哺乳动物和禽类细胞的质膜出芽的包膜病 毒。根据所存在的核蛋白和基质蛋白抗原，流感病毒分为A型、B型或 C型。根据所存在的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面糖蛋白的 组合，A型流感病毒可进一步分成若干亚型。HA支配病毒与宿主细胞 结合以及穿入宿主细胞的能力。NA从宿主细胞和病毒表面蛋白上的聚 糖链除去末端唾液酸残基，这防止病毒凝集并有利于病毒运动。目前， 已鉴定出16种HA(H1-H16)和9种NA(N1-N9)亚型。每种A型流 感病毒具有一种HA糖蛋白类型和一种NA糖蛋白类型。一般而言，每 种亚型均表现出物种特异性；例如，已知所有HA和NA亚型均感染鸟 类，而只有H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10、N1、N2、N3和N7 显示感染人类(Horimoto2006；Suzuki2005)。含有H5、H7和H9的 流感病毒被认为是致病性最强的A型流感病毒形式，并且最有可能引起 将来的大流行。

流感大流行通常由高传播性且致病性强的流感病毒引起，并可导致 全球性疾病和死亡水平升高。在20世纪，新的A型流感亚型的出现导 致四次主要的大流行。1918～1919年由H1N1病毒引起的西班牙流感在 1917年至1920年之间导致世界范围内超过五千万人死亡。当前，新亚 型出现的风险或者动物中特有的亚型向人传播的风险总是存在。特别受 到关注的是高致病性形式的禽流感(也称作“鸟流感”)，据报道其已经 在全世界若干国家爆发。在许多情形下，该禽流感可在48小时内导致 接近100％的死亡率。据推测，1997年在香港首次鉴定的禽流感病毒 (H5N1)向其它亚洲国家和欧洲的传播与野生鸟类的迁徙模式有关。

目前对抗人中流感的方法是每年接种疫苗。疫苗通常是预测为即将 到来之“流感季节”强势毒株(dominant strain)的几种毒株的组合。所 述预测由世界卫生组织来协调完成。一般而言，每年生产的疫苗剂量数 不足以接种全世界的人群。例如，加拿大和美国获得足以免疫其约三分 之一人口的疫苗剂量，而欧盟仅有17％的人口可接种疫苗。很显然，在 世界范围的流感大流行到来时，目前全世界的流感疫苗生产不能满足需 求。即使所需的年产量在给定年份中可以某种方式实现，然而强势毒株 每年都在变化，因此在一年的低需求时间大量储备是不切实际的。经济 地、大规模地生产有效流感疫苗是政府和私营企业等非常关心的。

用于疫苗中的病毒储液是在受精的蛋中生产的。收获病毒颗粒，为 了得到灭活病毒疫苗，通过去污剂破坏进行灭活。减毒活疫苗由适于在 低温下生长的流感病毒制备，这意味着在正常体温下所述疫苗的毒力减 弱。这样的疫苗在美国被批准用于5～49岁的个体。全病毒灭活疫苗是 通过化学试剂灭活而变为无害的，并且其已在胚蛋或哺乳动物细胞培养 物中生产。所有这些类型的疫苗都显示出一些特定的优点和缺点。全病 毒来源之疫苗的一个优点是这种疫苗所引起的免疫类型。通常，裂解型 疫苗诱导强的抗体应答，而由全病毒制得的疫苗诱导抗体(体液)应答 和细胞应答。尽管功能性抗体应答是与疫苗诱导之保护作用相关的获批 标准，然而越来越多的证据表明T细胞应答对流感免疫也很重要，其还 可为老年人提供更好的保护。

为了诱导细胞免疫应答，开发了由全病毒制得的疫苗。由于流感毒 株(例如H5N1)的高致病性，因此在BL3+设备中生产这些疫苗。对 于高致病性流感毒株(例如H5N1)来说，为了降低流感毒株的致病性、 使其无毒且更容易在胚蛋或哺乳动物细胞培养物中生产，一些制造商对 血凝素的基因序列进行了修饰。另一些人还使用重排列(reassortant) 流感株，其中血凝素和神经氨酸酶蛋白的基因序列被克隆进高产量、低 致病性的流感供体株(A/PR/8/34；Quan F-S等，2007)中。尽管这些方 法可产生有用的疫苗，但是它们不能提供以满足正常年份全球需求的所 需规模来大量、低成本及快速生产疫苗的解决方法，并且当大流行到来 时几乎必然地不能满足需求。

利用该反向遗传技术，还可能需要对HA蛋白的基因序列进行突变 以使其无毒。就高致病性流感株而言，全病毒疫苗的生产需要防护 (confinement)程序或者所得疫苗不与循环病毒的基因序列完全匹配。 在减毒活疫苗的情形中，仍存在所施用的疫苗可与来自宿主的流感病毒 重组而产生新流感病毒的风险。

尽管该方法保持了抗原表位和翻译后修饰，但是该方法存在许多缺 点，包括由于使用全病毒而引起的污染风险以及取决于病毒株的可变的 产量。亚最佳水平的保护可由以下原因导致：由于将病毒引入蛋中而引 起的病毒遗传异质性。其它缺点包括为了获得蛋而进行大量计划，由于 在纯化中使用的化学品引起的污染风险以及生产时间长。此外，对蛋中 蛋白质过敏的人可能不适于接种所述疫苗。

在大流行的情形中，裂解型疫苗的生产受到需要使毒株适于在蛋中 生长以及所得产量不同的限制。尽管此技术用于生产季节性疫苗已使用 了多年，但是它很难在合理的时间范围内响应于大流行，并且世界范围 的生产能力有限。

为了避免使用蛋，已经在哺乳动物细胞培养物中(例如在MDCK 或PERC.6细胞等中)生产流感病毒。另一种方法是反向遗传方法，其 中通过用病毒基因转化细胞来生产病毒。然而，这些方法也需要使用全 病毒以及精准的方法和特定的培养环境。

已开发了几种作为候选重组流感疫苗的重组产物。这些方法关注A 型流感病毒HA和NA蛋白的表达、制备以及纯化，包括利用杆状病毒 感染的昆虫细胞(Crawford等，1999；Johansson，1999)、病毒载体和 DNA疫苗构建体(Olsen等，1997)来表达这些蛋白质。

流感病毒感染的特异性是公知的。简言之，感染循环是从病毒体表 面HA蛋白与含有唾液酸的细胞受体(糖蛋白和糖脂)结合开始的。NA 蛋白介导对唾液酸受体的处理，病毒穿入细胞则取决于HA依赖性受体 介导的内吞作用。在含有流感病毒体的内化内涵体的酸性界限内，HA 蛋白发生构象变化，这导致病毒与细胞膜融合，病毒脱壳以及M2介导 的从核衣壳相关核糖核蛋白(RNP)释放M1蛋白，M1蛋白迁移到细 胞核内用于病毒RNA合成。抗HA蛋白的抗体通过中和病毒感染性来 预防病毒感染，而抗NA蛋白的抗体介导其对病毒复制早期步骤的作用。

Crawford等(1999)公开了流感病毒HA在杆状病毒感染的昆虫细 胞中的表达。所表达的蛋白质被描述为能够预防由禽类H5和H7流感 亚型引起的致命性流感疾病。Johansson等(1999)教导了杆状病毒表 达的流感病毒HA和NA蛋白在动物中诱导了优于常规疫苗所诱导之应 答的免疫应答。杆状病毒表达的马流感病毒血凝素的免疫原性和效力可 与同源DNA候选疫苗相比较(Olsen等，1997)。总之，这些数据表明， 使用多种实验方法以及在不同动物模型中，可利用重组HA或NA蛋白 诱导针对流感病毒攻击的高度保护。

由于先前的研究已显示表面流感病毒糖蛋白HA和NA是用于诱导 针对流感病毒之保护性免疫的主要靶标，并且M1提供了用于流感病毒 之细胞免疫的保守性靶标，所以新的候选疫苗可作为蛋白质大分子颗粒 (例如病毒样颗粒(VLP))包含这些病毒抗原。作为疫苗产品，VLP 提供了如下优点：比亚基或重组抗原具有更强的免疫原性，能刺激体液 和细胞免疫应答(Grgacic和Anderson，2006)。此外，含有这些流感抗 原的颗粒可展示出构象表位，其诱导针对多种流感病毒株的中和抗体。

生产用于疫苗目的的非感染性流感病毒株是避免发生意外感染的 一种方法。作为替代，已研究出用作培养病毒之替代物的病毒样颗粒 (VLP)。VLP模拟病毒衣壳的结构，但缺少基因组，因此不能复制或 提供二次感染的机会。

一些研究表明，使用哺乳动物表达质粒或杆状病毒载体，重组流感 病毒蛋白在细胞培养物中自组装成VLP(Gomez-Puertas等，1999； Neumann等，2000；Latham和Galarza，2001)。Gomez-Puertas等(1999) 公开了流感病毒VLP的有效形成取决于几种病毒蛋白质的表达水平。 Neumann等(2000)建立了基于哺乳动物表达质粒的系统，其用于完 全从克隆cDNA产生感染性流感病毒样颗粒。Latham和Galarza(2001) 报道了在用共表达HA、NA、M1和M2基因的重组杆状病毒感染的昆 虫细胞中形成流感病毒VLP。这些研究表明，流感病毒体蛋白质可在真 核细胞中共表达后进行自组装。

Gomez-Puertas等(2000)教导，除了血凝素(HA)以外，流感病 毒的基质蛋白(M1)对于VLP从昆虫细胞出芽也是必需的。然而，Chen 等(2007)教导了M1可能不是VLP形成所需的，并观察到M1和VLP 的有效释放需要存在HA和由NA提供的唾液酸酶活性。NA切割产生 VLP之细胞表面上的糖蛋白的唾液酸，并将VLP释放到介质中。

Quan等(2007)教导了在杆状病毒表达系统(昆虫细胞)中产生 的VLP疫苗诱导针对某些流感病毒株(A/PR8/34(H1N1))的保护性 免疫。经观察，Quan所研究的VLP从质膜出芽，并被认为具有合适的 大小和形态，与在哺乳动物系统(MDCK细胞)中得到的相似。

PCT公开WO2004/098530和WO2004/098533教导了在培养的转 化NT-1(烟草)细胞中表达新城疫病毒HN或禽流感病毒A/火鸡/威斯 康星/68(H5N9)。包含植物细胞培养物所表达多肽的组合物可在兔和鸡 中诱发不同的免疫应答。

包膜病毒可在从感染细胞“出芽”时获得脂质包膜，并且从质膜获得 膜，或者从内部细胞器的质膜获得膜。流感病毒颗粒和VLP从宿主细 胞的质膜出芽。例如，在哺乳动物或杆状病毒细胞系统中，流感病毒从 质膜出芽(Quan等，2007)。已知仅有少数包膜病毒感染植物(例如， 番茄斑萎病毒属(Topovirus)和弹状病毒属(Rhabdovirus)的成员)。在 已知的植物包膜病毒中，它们的特征在于从宿主细胞的内膜出芽，而不是 从质膜出芽。虽然已在植物宿主中产生了少数的重组VLP，但是它们均非 源自质膜，于是提出了这样的问题——是否可以在植物中生产质膜来源的 VLP(包括流感病毒VLP)。

目前的流感病毒VLP生产技术依赖于多种病毒蛋白质的共表达，这种 依赖性代表了这些技术的缺点，这是因为在全世界大流行和每年流行的情 形中，响应时间对于疫苗接种来说是至关重要的。例如，依赖于表达一种 或很少病毒蛋白且不需要表达病毒非结构蛋白的更为简单的VLP生产系 统对加快疫苗的开发来说是有必要的。

为了保护全世界人口免于患流感并且击退将来的大流行，疫苗生产 商需要开发有效的、快速的生产疫苗制剂的方法。目前使用受精的蛋生 产疫苗不能满足需求，并且生产过程长。

发明内容

本发明的一个目的是提供改进的流感病毒样颗粒(VLP)。

本发明提供了核酸，其包含编码来自包膜病毒之抗原的核苷酸序 列，所述核苷酸序列与在植物中有活性的调控区有效连接。所述抗原可 以是流感病毒血凝素(HA)。

所述HA可包含天然或非天然的信号肽；所述非天然的信号肽可以 是蛋白质二硫键异构酶信号肽。

所述核酸编码的HA可以是A型流感病毒、B型流感病毒或者是A 型流感病毒的亚型，其选自包含H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16的组。在本发明的一些方 面中，由所述核酸编码的HA可来自A型流感病毒，并选自包含H1、H2、 H3、H5、H6、H7和H9的组。

本发明还提供了在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其 包括：

a)将与在植物中有活性的调控区有效连接的、编码来自包膜病毒 之抗原(例如流感病毒血凝素(HA))的核酸导入植物或其部分中，以 及

b)在允许表达所述核酸的条件下培养所述植物或其部分，从而产 生VLP。

所述方法还可包括收获所述植物以及从所述植物组织中纯化或分 离VLP的步骤。

所述方法还可在导入步骤(步骤a)中包含含有编码一种或多种伴 侣蛋白之核苷酸序列的核酸。

所述一种或多种伴侣蛋白可选自包含Hsp40和Hsp70的组。

本发明包括上述方法，其中在导入步骤(步骤a)中，所述核酸可在 植物中瞬时表达或在植物中稳定表达。此外，可使用体积排阻色谱对VLP 进行纯化。

根据本发明的另一方面，提供了在植物中生产流感病毒样颗粒 (VLP)的方法，其包括提供了包含如下核酸的植物或植物部分，所述 核酸包含与在植物中有活性的调控区有效连接的、编码来自包膜病毒之 抗原的核苷酸序列，并在允许表达所述核酸的条件下培养所述植物或其 部分，从而产生VLP。

所述方法还可包括收集植物以及从植物组织中纯化或分离VLP的 步骤。

本发明包括上述方法，其中在提供步骤后，导入这样的核酸，其包含 与在植物中有活性的调控区有效连接的、编码一种或多种伴侣蛋白的核 苷酸序列；以及在允许表达所述核酸的条件下培养所述植物或植物部 分，从而产生VLP。

所述一种或多种伴侣蛋白可选自包含Hsp40和Hsp70的组。

本发明包括上述方法，其中在导入步骤(步骤a)中，所述编码HA 的核酸在植物中稳定表达。此外，可使用体积排阻色谱对VLP进行纯化。

本发明还提供了病毒样颗粒(VLP)，其包含流感病毒HA蛋白以及一 种或多种源自植物的脂质。

所述VLP的HA蛋白可以来自A型流感病毒、B型流感病毒或者是A 型流感病毒HA的亚型，其选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、 H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。在本发明的一些方面中， 所述HA来自A型流感病毒，并选自包含H1、H2、H3、H5、H6、H7和 H9的组。

此外，本发明还涉及包含有效剂量之VLP的组合物，该VLP包含流 感病毒HA蛋白、一种或多种植物脂质以及可药用载体。

本发明还涉及在植物中形成VLP的HA蛋白片段或部分。

本发明还涉及包含具有植物特异性N-聚糖或经修饰N-聚糖之流感病 毒HA的VLP。所述VLP的HA蛋白可以来自A型流感病毒、B型流感 病毒或者是A型流感病毒HA的亚型，其选自H1、H2、H3、H4、H5、 H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。在本发 明的一些方面中，所述HA来自A型流感病毒，并选自包含H1、H2、H3、 H5、H6、H7和H9的组。

所述VLP可包含一种或多种亚型的HA蛋白，包括H1、H2、H3、 H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16 或者其片段或部分。含有这些HA蛋白的亚型的实例包括A/新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)、A/印度尼西亚/5/2006(H5N1)、A/鸡/纽约/1995、A/银鸥 /DE/677/88(H2N8)、A/得克萨斯/32/2003、A/绿头鸭/MN/33/00、A/鸭/上 海/1/2000、A/针尾鸭/TX/828189/02、A/火鸡/安大略/6118/68(H8N4)、A/ 琵嘴鸭/伊朗/G54/03、A/鸡/德国/N/1949(H10N7)、A/鸭/英格兰/56 (H11N6)、A/鸭/阿尔伯达/60/76(H12N5)、A/鸥/马里兰/704/77(H13N6)、 A/绿头鸭/Gurjev/263/82、A/鸭/澳大利亚/341/83(H15N8)、A/红嘴鸥/瑞典 /5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/约翰内斯堡/66、A/波多黎各/8/34(H1N1)、 A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/布里斯 班10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、B/马来西亚/2506/2004、 B/佛罗里达/4/2006、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/ 越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/马/布拉格/56 (H7N7)、A/香港/1073/99(H9N2)。

在本发明的一个方面中，所述HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、H6、 H7或H9亚型。在另一方面中，所述H1蛋白可来自A/新喀里多尼亚/20/99 (H1N1)、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)或 A/所罗门群岛3/2006(H1N1)株。所述H3蛋白可来自A/布里斯班10/2007 (H3N2)或A/威斯康星/67/2005(H3N2)株。在本发明的又一方面中， 所述H2蛋白可来自A/新加坡/1/57(H2N2)株。所述H5蛋白可来自A/ 安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)或A/印度尼西亚/5/2005 株。在本发明的一个方面中，所述H6蛋白可来自A/水鸭/香港/W312/97 (H6N1)株。所述H7蛋白可来自A/马/布拉格/56(H7N7)株。在本发 明的一个方面中，所述H9蛋白来自A/香港/1073/99(H9N2)株。在本发 明的又一方面中，所述HA蛋白可来自可以是B型病毒的流感病毒，包括 B/马来西亚/2506/2004或B/佛罗里达/4/2006。来自H1、H2、H3、H5、 H6、H7、H9或B亚型的HA蛋白的氨基酸序列的实例包括SEQ ID NO： 48-59。

所述流感病毒HA蛋白可以是H5(印度尼西亚)。

本发明还提供了包含编码HA蛋白之序列的核酸分子。所述核酸分子 还可包含与所述编码HA蛋白之序列有效连接的一个或多个调控区。所述 核酸分子可包含编码H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、 H11、H12、H13、H14、H15、H16、B或C亚型的序列。在本发明的另 一个方面中，由所述核酸分子编码的HA蛋白可以是H1、H2、H3、H5、 H6、H7、H9或B亚型。所述核酸分子编码的H1蛋白来自A/新喀里多尼 亚/20/99(H1N1)、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1) 或A/所罗门群岛3/2006(H1N1)株。在本发明的一个方面中，所述核酸 分子编码的H3蛋白可来自A/布里斯班10/2007(H3N2)或A/威斯康星 /67/2005(H3N2)株。在本发明的又一方面中，所述核酸分子编码的H2 蛋白可来自A/新加坡/1/57(H2N2)株。所述核酸分子编码的H5蛋白可 来自A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)或A/印度尼西亚 /5/2005株。在本发明的一个方面中，所述核酸分子编码的H6蛋白可来自 A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)株。所述核酸分子编码的H7蛋白可来自 A/马/布拉格/56(H7N7)株。另外，所述核酸分子编码的H9蛋白可来自 A/香港/1073/99(H9N2)株。所述核酸编码的B亚型HA蛋白可来自B/ 佛罗里达/4/2006或B/马来西亚/2506/2004株。编码来自H1、H2、H3、 H5、H6、H7、H9或B亚型的这些HA蛋白的核酸分子序列的实例包括 SEQ ID NO：36-47和60-73。

所述核酸序列可编码流感病毒HA蛋白H5(印度尼西亚)。

可与编码HA蛋白之序列有效连接的调控区包括在植物细胞、昆虫细 胞或酵母细胞中可操作的调控区。这样的调控区可包括质体蓝素调控区、 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose1，5-bisphosphate  carboxylase/oxygenase，RuBisCO)调控区、叶绿素a/b结合蛋白(CAB)、 ST-LS1、多角体蛋白调控区或gp64调控区。其它调控区包括5’UTR、 3’UTR或终止子序列。所述质体蓝素调控区可以是苜蓿质体蓝素调控区； 所述5’UTR、3’UTR或终止子序列也可以是苜蓿序列。

还提供了诱导对象中针对流感病毒感染之免疫的方法，该方法包括施 用含有流感病毒HA蛋白、一种或多种植物脂质和可药用载体的病毒样颗 粒。所述病毒样颗粒可经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下 施用给对象。

本发明还涉及病毒样颗粒(VLP)，其包含源于选自流感病毒、麻疹病 毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒和HIV病毒之病毒的一种或多种蛋白质，以 及源于非唾液酸化宿主生产细胞的一种或多种脂质。所述HIV蛋白可以是 p24、gp120或gp41；所述埃博拉病毒蛋白可以是VP30或VP35；所述马 尔堡病毒蛋白可以是Gp/SGP；所述麻疹病毒蛋白可以是H蛋白或F蛋白。

另外，本发明涉及含有流感病毒HA蛋白和一种或多种宿主脂质的病 毒样颗粒(VLP)。例如，如果宿主是昆虫，那么所述病毒样颗粒(VLP) 可包含流感病毒HA蛋白和一种或多种昆虫脂质，或者，如果宿主是酵母， 那么所述病毒样颗粒(VLP)可包含流感病毒HA蛋白和一种或多种酵母 脂质。

本发明还涉及组合物，其包含两种或更多种流感毒株或亚型的VLP。 所述两种或更多种亚型或毒株可选自：A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、 A/印度尼西亚/5/2006(H5N1)、A/鸡/纽约/1995、A/银鸥/DE/677/88(H2N8)、 A/得克萨斯/32/2003、A/绿头鸭/MN/33/00、A/鸭/上海/1/2000、A/针尾鸭 /TX/828189/02、A/火鸡/安大略/6118/68(H8N4)、A/琵嘴鸭/伊朗/G54/03、 A/鸡/德国/N/1949(H10N7)、A/鸭/英格兰/56(H11N6)、A/鸭/阿尔伯达/60/76 (H12N5)、A/鸥/马里兰/704/77(H13N6)、A/绿头鸭/Gurjev/263/82、A/ 鸭/澳大利亚/341/83(H15N8)、A/红嘴鸥/瑞典/5/99(H16N3)、B/Lee/40、 C/约翰内斯堡/66、A/波多黎各/8/34(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、 A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/布里斯班10/2007(H3N2)、A/威斯康 星/67/2005(H3N2)、B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006、A/新加 坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)、 A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/马/布拉格/56(H7N7)或A/香港/1073/99 (H9N2)。所述两种或更多种亚型或毒株的VLP可以大致相等的量存在； 或者，一种或多种亚型或毒株可以占所存在毒株或亚型的大部分。

本发明涉及诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染之免疫的方法， 其包括施用含有一种或多种VLP的有效剂量疫苗，所述VLP是利用非唾 液酸化宿主(例如植物宿主、昆虫宿主或酵母宿主)生产的。所述疫苗可 经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。所述靶标生物可 选自人、灵长类、马、猪、鸟(禽)类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家 禽、鸡、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石 貂、雪貂、宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等。

本发明提供了用于在能够生产VLP的合适宿主(例如植物、昆虫或酵 母)中生产含有来自不同流感毒株之血凝素(HA)的VLP的方法。在植 物中生产的VLP含有植物来源的脂质，在昆虫细胞中生产的VLP含有来 自昆虫细胞质膜的脂质(通常称为“昆虫脂质”)，在酵母中生产的VLP含 有来自酵母细胞质膜的脂质(通常称为“酵母脂质”)。

本发明还涉及包含如下核酸的植物、植物组织或植物细胞，所述核 酸包含与在植物中有活性的调控区有效连接的、编码来自包膜病毒之抗 原的核苷酸序列。所述抗原可以是流感病毒血凝素(HA)。

所述植物还可包含这样的核酸，其包含与在植物中有活性的调控区有 效连接的、编码一种或多种伴侣蛋白的核苷酸序列。所述一种或多种伴 侣蛋白可选自包含Hsp40和Hsp70的组。

与在昆虫细胞培养物中生产VLP相比，在植物中生产这些颗粒具有若 干优点。植物脂质可刺激特定免疫细胞并增强所诱导的免疫应答。植物的 膜由脂质、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)组成，并且还含有 植物以及某些细菌和原生动物所特有的鞘糖脂。鞘脂类之所以不常见的原 因是，它们不是甘油酯(例如PC或PE)，而是由与含有18个以上碳的脂 肪酸链形成酰胺连接的长链氨基醇组成。PC和PE以及鞘糖脂可结合哺乳 动物免疫细胞(例如抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞和巨噬细胞) 和另一些细胞(包括胸腺和肝脏中的B淋巴细胞和T淋巴细胞))中表达 的CD1分子(Tsuji M，.2006)。此外，除了植物脂质的存在具有潜在的佐 剂作用以外，植物N-聚糖促进抗原呈递细胞捕获糖蛋白抗原的能力 (Saint-Jore-Dupas，2007)也可能是在植物中生产VLP的优点。

不希望受理论限制，预计由植物生产的VLP会比在其它生产体系中制 得的VLP诱导出更强的免疫反应，并且与由活的或减毒的全病毒疫苗诱导 的免疫反应相比，由这些植物生产的VLP诱导的免疫反应会更强。

与由全病毒制得的疫苗相比，VLP具有优势，这是因为它们无感染性， 因此限制性生物防范问题不再像使用感染性全病毒时那么重要，并且不是 生产所必需的。由植物生产的VLP的另一优点是，允许表达系统生长在温 室或田间，从而具有更显著的经济效益并适于扩大规模。

另外，植物不含有参与合成唾液酸残基以及将唾液酸残基添加到蛋白 质中的酶。VLP的生产可以不需要神经氨酸酶(NA)，并且不需要共表达 NA或者用唾液酸酶(神经氨酸酶)处理生产细胞或提取物以确保在植物 中生产VLP。

根据本发明生产的VLP不包含已知与RNA结合的M1蛋白。RNA是 VLP制备物中的污染物，其在VLP产品获得监管部门审批时是不期望的。

所述发明内容不必然描述本发明的所有特征。

附图说明

通过以下描述以及参考附图，本发明的这些和其它特征会更加明显， 其中：

图1A显示根据本发明的一个实施方案用于表达来自A/新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)株之H1的基于苜蓿质体蓝素之表达盒的序列(SEQ ID NO： 8)。下划线标示蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI) 信号肽。粗体显示用于克隆的BglII(AGATCT)和SacI(GAGCTC)限 制性位点。图1B显示流感病毒血凝素的功能结构域的示意图。切割HA0 后，HA1和HA2片段仍通过二硫桥结合在一起。

图2A显示被组装用于表达来自A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)株之 HA的H1亚型的质粒540的示意图。图2B显示被组装用于表达来自A/ 印度尼西亚/5/2005(H5N1)株之HA的H5亚型的质粒660的示意图。

图3显示来自产生血凝素H1或H5的叶的蛋白质提取物的体积排阻色 谱。图3A显示Blue Dextran2000(三角形)和蛋白质(菱形)的洗脱模 式。图3B显示在体积排阻色谱(S500HR珠)后H1(A/新喀里多尼亚/20/99 (H1N1))洗脱级分的免疫检测(Western印迹；抗H1抗体)。图3C显 示H5的洗脱模式；Blue Dextran2000(三角形)和蛋白质(菱形)。图3D 显示在体积排阻色谱(S500HR珠)后H5(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)) 洗脱级分的免疫检测(Western印迹；抗H5抗体)。

图4A显示编码H1(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))N末端片段 的序列(SEQ ID NO：1)。图4B显示编码H1(A/新喀里多尼亚/20/99 (H1N1))C末端片段的序列(SEQ ID NO：2)。

图5显示编码H1(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))的HA0的全长 序列(SEQ ID NO：28)。

图6显示编码H5(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))的序列，其侧翼 为紧邻起始ATG上游的HindIII位点以及紧邻终止密码子(TAA)下游的 SacI位点(SEQ ID NO：3)。

图7A显示引物Plasto-443c的序列(SEQ ID NO：4)。图7B显示引物 SpHA(Ind)-Plasto.r的序列(SEQ ID NO：5)。图7C显示引物 Plasto-SpHA(Ind).c的序列(SEQ ID NO：6)。图7D显示引物HA(Ind)-Sac.r 的序列(SEQ ID NO：7)。

图8A显示H1(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))肽序列的氨基酸序 列(SEQ ID NO：9)。图8B显示H5(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))肽 序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。粗体指示天然信号肽。

图9显示A型流感病毒H7亚型的HA核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。

图10A显示A型流感病毒HA的H2亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 12)。图10B显示A型流感病毒HA的H3亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 13)。图10C显示A型流感病毒HA的H4亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 14)。图10D显示A型流感病毒HA的H5亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 15)。图10E显示A型流感病毒HA的H6亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 16)。图10F显示A型流感病毒HA的H8亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 17)。图10G显示A型流感病毒HA的H9亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 18)。图10H显示A型流感病毒HA的H10亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 19)。图10I显示A型流感病毒HA的H11亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 20)。图10J显示A型流感病毒HA的H12亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 21)。图10K显示A型流感病毒HA的H13亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 22)。图10L显示A型流感病毒HA的H14亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 23)。图10M显示A型流感病毒HA的H15亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 24)。图10N显示A型流感病毒HA的H16亚型核苷酸序列(SEQ ID NO： 25)。图10O显示B型流感病毒的HA核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。 图10P显示C型流感病毒的HA核苷酸序列(SEQ ID NO：27)。图10Q 显示引物XmaI-pPlas.c的核苷酸序列(SEQ ID NO：29)。图10R显示 引物SacI-ATG-pPlas.r的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。图10S显示引 物SacI-PlasTer.c的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)。图10T显示引物 EcoRI-PlasTer.r的核苷酸序列(SEQ ID NO：32)。

图11显示本文使用的几种构建体的示意图。构建体660包含与质体蓝 素启动子(Plasto)和终止子(Pter)有效连接的编码HA之H5亚型(A/ 印度尼西亚/5/2005(H5N1))的核苷酸序列；构建体540包含编码HA 的H1亚型(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))连同苜蓿蛋白质二硫键异 构酶信号肽(SP PDI)的核苷酸序列，并且其与质体蓝素启动子(Plasto) 和终止子(Pter)有效连接；构建体544被组装用于表达HA的H1亚型 (A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))，编码H1的核苷酸序列与苜蓿蛋白 质二硫键异构酶信号肽(SP PDI)和GCN4pII亮氨酸拉链(替代H1的跨 膜结构域和胞质尾)相组合并与质体蓝素启动子(Plasto)和终止子(Pter) 有效连接；用于表达流感A/PR/8/34之M1编码区的构建体750与烟草蚀 纹病毒(tobacco etch virus，TEV)的5’UTR相组合，并与双35S启动子 和Nos终止子有效连接。

图12显示使用抗H5(越南)抗体对用构建体660转化的本塞姆氏烟 草(N.benthamiana)叶蛋白质提取物中的H5(A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))进行免疫检测(泳道3)。使用来自流感病毒A/越南/1203/2004 的市售H5作为检测的阳性对照(泳道1)，用空载体转化的叶蛋白质提取 物用作阴性对照(泳道2)。

图13显示通过体积排阻色谱对血凝素结构进行表征。利用S-500HR 通过凝胶过滤分离来自产生H5(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))、H1(A/ 新喀里多尼亚/20/99(H1N1))、可溶性H1或H1以及M1之各生物质 的蛋白质提取物。还对市售的玫瑰花结形式的H1(A/新喀里多尼亚/20/99 (H1N1))进行分级分离(H1玫瑰花结)。图13A显示用于分析相对蛋 白质含量的洗脱级分(相对蛋白质水平——显示生物质分级分离的标准蛋 白质洗脱模式)。标出了Blue Dextran2000(2MDa标准参照物)的洗脱 峰。图13B显示通过使用抗H5(越南)抗体(针对H5)进行免疫印迹用 于分析洗脱级分中的血凝素存在情况。图13C显示用于分析针对H1之抗 A型流感病毒抗体的洗脱级分。图13D显示用于分析针对可溶性H1之抗 A型流感病毒抗体的洗脱级分。图13E显示用于分析针对H1玫瑰花结之 抗A型流感病毒抗体的洗脱级分。图13F显示用于分析针对H1+M1之抗 A型流感病毒抗体的洗脱级分。

图14显示通过蔗糖梯度离心浓缩流感病毒H5(A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))结构以及对血凝素浓缩级分进行电子显微镜检查。图14A显 示由蔗糖密度梯度离心得到的级分的表征。通过利用抗H5(越南)抗体 进行免疫印迹(上图)分析每一级分中H5的存在情况及其相对蛋白质含 量和血细胞凝集能力(曲线图)。图14B显示来自蔗糖梯度离心的合并级 分17、18和19的负染色透射电子显微镜检查。比例尺表示100nm。

图15显示流感病毒H5VLP的纯化。图15A显示澄清步骤和胎球蛋 白亲和纯化步骤中用考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析蛋白质含量。在澄清 步骤中，泳道1，粗提物；泳道2，pH6经调节提取物；泳道3，经热处理 的提取物；泳道4，经DE过滤的提取物；在胎球蛋白亲和纯化步骤中， 泳道5，加样；泳道6，穿透液(flowthrough)；泳道7，洗脱(10倍浓缩)。 图15B显示对纯化的H5VLP样品的负染色透射电子显微镜检查。比例尺 表示100nm。图15C显示放大的经分离H5VLP以显示结构细节。图15D 显示利用考马斯染色的还原型SDS-PAGE(泳道A)以及利用针对来自 A/越南/1203/2004毒株(H5N1)的HA产生的兔多克隆抗体进行的Western 印迹(泳道B)显示的H5VLP产物。

图16显示A型流感病毒(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))血凝素(HA) 基因全长cds的核苷酸序列。GenBank登录号AY289929(SEQ ID NO：33)。

图17显示紫花苜蓿(Medicagosativa)的蛋白质二硫键异构酶mRNA 的核苷酸序列。GenBank登录号Z11499(SEQ ID NO：34)。

图18显示A型流感病毒(A/波多黎各/8/34(H1N1))区段7全长序 列的核苷酸序列。GenBank登录号NC_002016.1(SEQ ID NO：35)。

图19显示正染色透射电子显微镜所观察的产生H5之组织的VLP累 积定位。CW：细胞壁，ch：叶绿体，pm：质膜，VLP：病毒样颗粒。比 例尺表示100nm。

图20显示在用植物生产的流感病毒H5VLP(A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))或重组可溶性H5(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))接种的 Balb/c小鼠中加强后14天诱导的血清抗体应答。图20(A)通过肌内注射 免疫的小鼠的抗体应答。图20(B)通过鼻内施用免疫的小鼠的抗体应答。 测量针对失活的H5N1全病毒(A/印度尼西亚/5/05)的抗体应答。GMT： 几何平均效价。数值是每组中五只小鼠的终点效价倒数的GMT(ln)。短 线表示平均偏差。与重组可溶性H5相比，*p＜0.05。

图21显示在用植物生产的流感病毒H5VLP(A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))或重组可溶性H5(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))接种的 Balb/c小鼠中加强后14天的血细胞凝集抑制(hemagglutination inhibition， HAI)抗体应答。图21(A)通过肌内注射免疫的小鼠的抗体应答。图21 (B)通过鼻内施用免疫的小鼠的抗体应答。使用失活的H5N1全病毒(A/ 印度尼西亚/5/05)测量HAI抗体应答。GMT：几何平均效价。数值是每 组中五只小鼠的终点效价倒数的GMT(ln)。短线表示平均偏差。与重组 可溶性H5相比，*p＜0.05，**p＜0.01。

图22显示佐剂对Balb/c小鼠中VLP免疫原性的作用。图22(A)明 矾对通过肌内注射免疫之小鼠的作用。图22(B)壳聚糖对通过鼻内施用 免疫之小鼠的作用。使用失活的H5N1全病毒(A/印度尼西亚/5/05)测量 HAI抗体应答。GMT：几何平均效价。数值是每组中五只小鼠的终点效 价倒数的GMT(ln)。短线表示平均偏差。与相应的重组可溶性H5相比， *p＜0.05。

图23显示施用H5VLP(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))的抗体应 答。图23(A)通过肌内施用接种的小鼠加强后30天的抗印度尼西亚/5/05 免疫球蛋白同种型。数值是每组中五只小鼠的终点效价倒数的GMT (log₂)。使用失活H5N1(A/印度尼西亚/5/2005)全病毒作为涂覆剂进行 ELISA。短线表示平均偏差。与相应的重组可溶性H5(A/印度尼西亚/5/2005 (H5N1))相比，*p＜0.05，**p＜0.001。图23(B)针对失活全病毒(A/ 印度尼西亚/5/2005(H5N1)和A/越南/1194/04(H5N1))的抗体效价。 所有组均与阴性对照具有统计学差异。

图24显示初次剂量后14天后(第2周)、加强后14天(第5周)或 加强后30天(第7周)，用H5VLP(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))免 疫的Balb/c小鼠针对同源失活全病毒(A/印度尼西亚/5/05)的抗体效价。 GMT：几何平均效价。数值是每组中五只小鼠的终点效价倒数的GMT (ln)。与重组可溶性H5相比，*p＜0.05。

图25显示来自用H5VLP(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))免疫的 Balb/c小鼠加强后30天的血清抗体的体外交叉反应性。(A)针对失活全 病毒的抗体效价。(B)针对多种失活全病毒的血细胞凝集抑制效价。数值 是每组中五只小鼠的终点效价倒数的GMT(ln)。短线表示平均偏差。所 有组均与阴性对照具有统计学差异。与相应的重组可溶性H5相比，* p＜0.05。所有小于10的数值被赋予任意值5(其ln值为1.6)，并认为其是 阴性的。

图26显示由植物生产的H5VLP(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)) 的效力。(A)用1000倍LD₅₀(4.09×10⁶CCID₅₀)的流感毒株A/土耳其/582/06 (H5N1)攻击后小鼠的存活率。(B)攻击后免疫小鼠的体重。数值是存 活小鼠的平均体重。

图27显示植物来源的流感病毒VLP的来源。(A)纯化的流感病毒 VLP的极性脂质组成。将包含在相当于40μg蛋白质中的脂质从上述VLP 中提取出来，通过HP-TLC进行分离，并与从高度纯化的烟草质膜(PM) 中分离的脂质的迁移模式进行比较。脂质缩写如下：DGDG，双半乳糖二 酰甘油；gluCER，葡萄糖神经酰胺；PA，磷酸；PC，磷脂酰胆碱；PE， 磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；PI，磷酯酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸； SG，类固醇糖苷(Steryl-glycoside)。(B)纯化的流感病毒VLP的中性脂 质组成。将包含在相当于20μg蛋白质中的脂质从上述VLP中提取出来， 通过HP-TLC进行分离，并与谷固醇的迁移进行比较。(C)对纯化的VLP、 来自烟草叶的高度纯化PM(PM_L)和BY2烟草细胞的高度纯化PM (PM_BY2)中质膜标志物质子泵ATP酶(PMA)进行免疫检测。在每一泳 道中加入18μg蛋白质。

图28显示克隆774的DraIII至SacI位点之间的序列——A/布里斯班 /59/2007(H1N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：36)。所述编码序列的侧翼 是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密 码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划 线标出。

图29显示克隆775的DraIII至SacI位点之间的序列——A/所罗门群 岛3/2006(H1N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：37)。所述编码序列的侧 翼是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止 密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下 划线标出。

图30显示克隆776的DraIII至SacI位点之间的序列——A/布里斯 班10/2007(H3N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO：38)。所述编码序列的侧 翼是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止 密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下 划线标出。

图31显示克隆777的DraIII至SacI位点之间的序列——A/威斯康星 /67/2005(H3N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO：39)。所述编码序列的侧翼 是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密 码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划 线标出。

图32显示克隆778的DraIII至SacI位点之间的序列——B/马来西亚 /2506/2004的核苷酸序列(SEQ ID NO：40)。所述编码序列的侧翼是在5’ 端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和 SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。

图33显示克隆779的DraIII至SacI位点之间的序列——B/佛罗里达 /4/2006的核苷酸序列(SEQ ID NO：41)。所述编码序列的侧翼是在5’端 以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码子和 SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线标出。

图34显示克隆780的DraIII至SacI位点之间的序列——A/新加坡 /1/57(H2N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO：42)。所述编码序列的侧翼是 在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码 子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线 标出。

图35显示克隆781的DraIII至SacI位点之间的序列——A/安徽 /1/2005(H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：43)。所述编码序列的侧翼 是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密 码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划 线标出。

图36显示克隆782的DraIII至SacI位点之间的序列——A/越南 /1194/2004(H5N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：44)。所述编码序列的侧 翼是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止 密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下 划线标出。

图37显示克隆783的DraIII至SacI位点之间的序列——A/水鸭/ 香港/W312/97(H6N1)的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)。所述编码序列 的侧翼是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的 终止密码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并 用下划线标出。

图38显示克隆784的DraIII至SacI位点之间的序列——A/马/布拉 格/56(H7N7)的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。所述编码序列的侧翼是 在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密码 子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划线 标出。

图39显示克隆785的DraIII至SacI位点之间的序列——A/香港 /1073/99(H9N2)的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)。所述编码序列的侧翼 是在5’端以DraIII限制性位点起始的质体蓝素调控区，以及3’端的终止密 码子和SacI位点。限制性位点用下划线标出；ATG以粗体表示并用下划 线标出。

图40A显示由克隆774(A/布里斯班/59/2007(H1N1))翻译的多肽 的氨基酸序列(SEQ ID NO：48)。克隆774的开放阅读框从图28中所示 的ATG开始。图40B显示由克隆775(A/所罗门群岛3/2006(H1N1)) 翻译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：49)。克隆775的开放阅读框从图 29中所示的ATG开始。

图41A显示由克隆776(A/布里斯班/10/2007(H3N2))翻译的多肽 的氨基酸序列(SEQ ID NO：50)。克隆776的开放阅读框从图30中所示 的ATG开始。图41B显示由克隆777(A/威斯康星/67/2005(H3N2))翻 译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：51)。克隆777的开放阅读框从图31 中所示的ATG开始。

图42A显示由克隆778(B/马来西亚/2506/2004)翻译的多肽的氨基 酸序列(SEQ ID NO：52)。克隆778的开放阅读框从图32中所示的ATG 开始。图42B显示由克隆779(B/佛罗里达/4/2006)翻译的多肽的氨基酸 序列(SEQ ID NO：53)。克隆779的开放阅读框从图33中所示的ATG开 始。

图43A显示由克隆780(A/新加坡/1/57(H2N2))翻译的多肽的氨 基酸序列(SEQ ID NO：54)。克隆780的开放阅读框从图34中所示的ATG 开始。图43B显示由克隆781(A/安徽/1/2005(H5N1))翻译的多肽的氨 基酸序列(SEQ ID NO：55)。克隆781的开放阅读框从图35中所示的ATG 开始。

图44A显示由克隆782(A/越南/1194/2004(H5N1))翻译的多肽的 氨基酸序列(SEQ ID NO：56)。克隆782的开放阅读框从图36中所示的 ATG开始。图44B显示由克隆783(A/水鸭/香港/W312/97(H6N1))翻 译的多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)。克隆783的开放阅读框从图37 中所示的ATG开始。

图45A显示由克隆784(A/马/布拉格/56(H7N7))翻译的多肽的氨 基酸序列(SEQ ID NO：58)。克隆784的开放阅读框从图38中所示的ATG 开始。图45B显示由克隆785(A/香港/1073/99(H9N2))翻译的多肽的氨 基酸序列(SEQ ID NO：59)。克隆785的开放阅读框从图39中所示的ATG 开始。

图46显示在体积排阻色谱之后对由植物生产的VLP的7-17洗脱级 分进行免疫检测(Western印迹)。BlueDextran的洗脱峰(级分10)用箭 头标出。显示了血凝素亚型H1、H2、H3、H5、H6和H9。在级分7-14 中检出血凝素，其对应于VLP洗脱物。

图47显示来自年度流行毒株的一系列血凝素之表达的免疫印迹分 析。将针对表达来自不同流感病毒株之HA(标示于免疫印迹上部)的植 物的10μg和20μg叶蛋白质提取物分别加至泳道1和2中。

图48A显示来自潜在大流行毒株的一系列H5血凝素之表达的免疫 印迹分析。将10μg和20μg蛋白质提取物分别加至泳道1和2中。图48B 显示来自选定流感毒株的H2、H7和H9血凝素之表达的免疫印迹分析。 将10μg和20μg蛋白质提取物分别加至泳道1和2中。

图49显示来自利用AGL1/660农杆菌渗入的烟草(Nicotiana  tabacum)叶之蛋白质提取物中A/印度尼西亚/5/2005毒株H5的免疫印迹。 对两株植物(植物1和植物2)进行渗入，并将10μg和20μg提取自各植 物的可溶性蛋白质分别加至泳道1和2中。

图50显示血清抗体的体外交叉反应性。用植物生产的流感病毒H5 VLP(A/印度尼西亚/5/2005(H5N1))(A)第一次免疫后14天以及(B) 第二次加强后14天，雪貂血清中的血细胞凝集抑制(HI)效价。使用下 述失活H5N1全病毒测量HAI抗体应答：A/火鸡/土耳其/1/05、A/越南 /1194/04、A/安徽/5/05以及同源株A/印度尼西亚/5/05。数值是每组中五只 雪貂的终点效价倒数的GMT(log₂)。斜条纹—A/印度尼西亚/6/06(进化 枝2.1.3)；方格图案—A/火鸡/土耳其/1/05(进化枝2.2)；白柱—A/越南 /1194/04(进化枝1)；黑柱—A/安徽/5/05。标出了响应者。短线表示平均 偏差。

图51显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：60)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/印度尼西亚/5/2005(构建体#660)的 H5的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图52显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：61)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/新喀里多尼亚/20/1999(构建体#540) 的H1的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图53显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：62)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/布里斯班/59/2007(构建体#774)的 H1的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图54显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：63)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)(构建体# 775)的H1的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图55显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：64)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/新加坡/1/57(H2N2)(构建体#780) 的H2的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图56显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：65)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/安徽/1/2005(H5N1)(构建体#781) 的H5的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图57显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：66)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/越南/1194/2004(H5N1)(构建体#782) 的H5的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图58显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：67)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)(构建体 #783)的H6的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图59显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：68)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/香港/1073/99(H9N2)(构建体#785) 的H9的血凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图60显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：69)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/布里斯班/10/2007(H3N2)的H3的血 凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图61显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：70)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/威斯康星/67/2005(H3N2)的H3的血 凝素编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图62显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：71)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自A/马/布拉格/56(H7N7)的H7的血凝素 编码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图63显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：72)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自B/马来西亚/2506/2004的HA的血凝素编 码序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图64显示HA表达盒的核酸序列(SEQ ID NO：73)，其含有苜蓿 质体蓝素启动子和5’UTR、来自B/佛罗里达/4/2006的HA的血凝素编码 序列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列。

图65显示A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)(由SEQ ID NO：33编码)、 A/布里斯班/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO：48)、A/所罗门群岛/3/2006 (H1N1)(SEQ ID NO：49)的HA与SEQ ID NO：9的共有氨基酸序列 (SEQ ID NO：74)。X1(第3位)是A或V；X2(第52位)是D或N； X3(第90位)是K或R；X4(第99位)是K或T；X5(第111位)是 Y或H；X6(第145位)是V或T；X7(第154位)是E或K；X8(第 161位)是R或K；X9(第181位)是V或A；X10(第203位)是D或 N；X11(第205位)是R或K；X12(第210位)是T或K；X13(第225 位)是R或K；X14(第268位)是W或R；X15(第283位)是T或N； X16(第290位)是E或K；X17(第432位)是I或L；X18(第489位) 是N或D。

图66显示由SEQ ID NO：33编码的H1(新喀里多尼亚) (AAP34324.1)的氨基酸序列(SEQ ID NO：75)。

图67显示由SEQ ID NO：35编码的H1(波多黎各)(NC_0409878.1) 的氨基酸序列(SEQ ID NO：76)。

图68显示828#表达盒之一部分(从PacI(启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。CPMV HT5’UTR序列与经突变 ATG用下划线标出。ApaI限制性位点(紧邻待表达之蛋白质(在该情形 中为C5-1κ轻链)编码序列的ATG上游)。

图69显示663#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中， 质体蓝素启动子的上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子的下游))的核酸 序列。下划线标示H5(来自A/印度尼西亚/5/2005)编码序列与PDI SP 融合。

图70显示787#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中， 质体蓝素启动子的上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子的下游))的核酸 序列。下划线标示H1(来自A/布里斯班/59/2007)编码序列与PDI SP融 合。

图71显示790#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中， 质体蓝素启动子的上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子的下游))的核酸 序列。下划线标示H3(来自A/布里斯班/10/2007)编码序列与PDI SP融 合。

图72显示798#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中， 质体蓝素启动子的上游)至EcoRI(紧邻质体蓝素终止子的下游))的核酸 序列。下划线标示HA(来自B/佛罗里达/4/2006)编码序列与PDI SP融 合。

图73显示580#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示H1(来自A/新喀里 多尼亚/20/1999)编码序列与PDI SP融合。

图74显示685#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示H5(来自A/印度尼 西亚/5/2005)编码序列。

图75显示686#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示H5(来自A/印度尼 西亚/5/2005)编码序列与PDI SP融合。

图76显示732#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示H1(来自A/布里斯 班/59/2007)编码序列。

图77显示733#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示H1(来自A/布里斯 班/59/2007)编码序列与PDI SP融合。

图78显示735#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示H3(来自A/布里斯 班/10/2007)编码序列。

图79显示736#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示H3(来自A/布里斯 班/10/2007)编码序列与PDI SP融合。

图80显示738#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示HA(来自B/佛罗里 达/4/2006)编码序列。

图81显示739#构建体之一部分(从PacI(35S启动子上游)至AscI (紧邻NOS终止子下游))的核酸序列。下划线标示HA(来自B/佛罗里 达/4/2006)编码序列与PDI SP融合。

图82显示编码Msj1的核酸序列(SEQ ID NO：114)。

图83显示R850#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中， 启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游))的核酸序列。下划线 标示HSP40编码序列。

图84显示R860#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中， 启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游))的核酸序列。下划线 标示HSP70编码序列。

图85显示R870#构建体之一部分(从HindIII(在多克隆位点中， 启动子上游)至EcoRI(紧邻NOS终止子的下游))的核酸序列。HSP40 编码序列用下划线加斜体标示，HSP70编码序列用下划线标示。A)1-5003 位核苷酸；B)5004-9493位核苷酸。

图86显示构建体R472的示意图。

图87显示使用来自苜蓿蛋白质二硫键异构酶之信号肽的HA的表达 的免疫印迹分析。将获得自3株单独植物的20μg叶蛋白质提取物加至 SDS-PAGE，而对于H1(A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)来说使用5μg。 所示对照(同源毒株的失活全病毒(whole inactivated virus，WIV))以5 或20μg被掺入经模拟渗入的植物中。a)来自A/新喀里多尼亚/20/99之 H1的表达，b)来自A/布里斯班/59/2007之H1的表达，c)来自A/布里 斯班/10/2007之H3的表达，d)来自A/印度尼西亚/5/2005之H5的表达， e)来自B/佛罗里达/4/2006之HA的表达。箭头表示对应于HA0的免疫条 带。SP WT：天然的信号肽，PS PDI：苜蓿PDI信号肽。

图88显示通过对叶蛋白质提取物进行免疫印迹分析来对HA表达策 略进行比较。使用基于质体蓝素或基于CPMV-HT的盒产生HA。对于 CPMV-HT而言，还比较了野生型HA信号肽与来自苜蓿PDI的信号肽。 对于所分析的HA亚型来说，将20μg的蛋白质提取物加样至SDS-PAGE， 而对于H1(新喀里多尼亚)来说加样5μg蛋白质。a)来自A/新喀里多 尼亚/20/1999之H1的表达，b)来自A/布里斯班/59/2007之H1的表达，c) 来自A/布里斯班/10/2007之H3的表达，d)来自A/印度尼西亚/5/2005之 H5的表达，e)来自B/佛罗里达/4/2006之B型的表达。箭头表示对应于 HA0的免疫条带。包含用于HA表达之特异性载体的特异性农杆菌属菌株 在泳道上方示出。

图89显示当与HSP40和HSP70共表达时HA累积的免疫印迹。H1 (新喀里多尼亚)(AGL1/540)和H3(布里斯班)(AGL1/790)单独表 达或者与AGL1/R870共表达。通过对来自经渗入叶的蛋白质提取物进行 免疫印迹分析来评估HA累积水平。毒株A/新喀里多尼亚/20/99或布里斯 班/10/2007的失活全病毒(WIV)用作对照。

具体实施方式

本发明涉及病毒样颗粒的生产。更具体而言，本发明涉及含有流感 病毒抗原的病毒样颗粒的生产。

下面的描述是优选的实施方案。

本发明提供了含有编码来自包膜病毒的抗原(例如流感血凝素 (HA))之核苷酸序列的核酸，其与在植物中有活性的调控区有效连接。

此外，本发明提供了在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。所 述方法包括将编码抗原并与在植物中有活性之调控区有效连接的核酸导 入所述植物或其部分中，以及在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物 或其部分，从而产生VLP。

VLP可由流感病毒制得，然而，VLP还可由其它质膜来源的病毒制 得，包括但不限于麻疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒和HIV。

本发明包括可感染人的所有类型流感病毒的VLP，包括例如但不限 于非常流行的A型(H1N1)亚型(例如A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1))、 A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1)(SEQ ID NO：60)以及较不常见的B型 (例如SEQ ID NO：26，图10O)、C型(SEQ ID NO：27，图10P)以及从 其它流感病毒亚型得到的HA。本发明中其它流感病毒亚型的VLP还包括 例如A/布里斯班/59/2007(H1N1；SEQ ID NO：48)、A/所罗门群岛/3/2006 (H1N1；SEQ ID NO：49)、A/新加坡/1/57(H2N2；SEQ ID NO：54)、A/安 徽/1/2005(H5N1；SEQ ID NO：55)、A/越南/1194/2004(H5N1；SEQ ID  NO：56)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1；SEQ ID NO：57)、A/香港/1073/99 (H9N2；SEQ ID NO：59)、A/布里斯班/10/2007(H3N2；SEQ ID NO：50)、 A/威斯康星/67/2005(H3N2；SEQ ID NO：51)、A/马/布拉格/56(H7N7；SEQ  ID NO：58)、B/马来西亚/2506/2004(SEQ ID NO：52)或B/佛罗里达/4/2006 (SEQ ID NO：53)。

本发明还涉及感染其它哺乳动物或宿主动物的流感病毒，所述哺乳 动物或宿主动物为例如人、灵长类、马、猪、鸟类、禽类、水禽、候鸟、 鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、 麝猫、水貂、石貂、雪貂、宠物、家畜、小鼠、大鼠、海豹、鲸等。

可在质膜来源的病毒中表达的其它抗原的非限制性实例包括HIV的 衣壳蛋白p24；包膜蛋白gp120、gp41；结构蛋白VP30和VP35；丝状病 毒(例如埃博拉病毒或马尔堡病毒)的Gp/SGP(糖基化内膜蛋白)，或副 粘病毒(例如麻疹病毒)的H蛋白以及F蛋白。

本发明还包括但不限于从细胞质膜获得脂质包膜的流感病毒来源的 VLP，所述VLP蛋白在所述细胞中表达。例如，如果VLP在基于植物的 系统中表达，那么VLP可从该细胞的质膜获得脂质包膜。

一般而言，术语“脂质”是指脂溶性的(亲脂性的)天然分子。更具 体地，该术语还用于指脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯和甘 油单酯以及磷脂)以及其它脂溶性的含固醇的代谢物或固醇类。磷脂连同 糖脂、固醇和蛋白质是所有生物膜的主要组分。磷脂的实例包括磷脂酰乙 醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油等。固醇的 实例包括动物固醇(例如胆固醇)和植物固醇(例如谷甾醇)以及固醇糖 苷。已经在多种植物中鉴定了超过200种的植物固醇，最常见的有菜油固 醇、豆固醇、麦角固醇、菜子固醇、Δ-7-豆固醇、Δ-7-燕麦固醇、胡萝卜 固醇(daunosterol)、谷固醇、24-甲基胆固醇、胆固醇或β-谷固醇。本领 域技术人员应当理解，细胞质膜的脂质组成可随细胞或获得细胞之生物体 的培养或生长条件而变化。

细胞膜通常包含脂双层以及各种功能的蛋白质。在脂双层中可发现 局部浓缩的特定脂质，称为“脂质筏”。不希望受理论限制，脂质筏可在内 吞和胞吐作用、病毒或其它感染原的进入或逸出、细胞间信号转导、与细 胞或生物体的其它结构组分(例如细胞内和细胞外基质)相互作用中起重 要作用。

针对流感病毒，本文所用的术语“血凝素”或“HA”是指存在于流感病 毒颗粒外部的糖蛋白。HA是同三聚体I型膜糖蛋白，通常含有信号肽、 HA1结构域和HA2结构域，所述HA2结构域含有C端的跨膜锚定位点以 及小的胞质尾(图1B)。编码HA的核苷酸序列是公知的并且是可获得的， 参见例如BioDefence Public Health base(流感病毒；参见 URL：biohealthbase.org)或美国国立生物技术信息中心(参见 URL：ncbi.nlm.nih.gov)，其均通过引用并入本文。

术语“同三聚体”或“同三聚体的”表示寡聚体由三个HA蛋白分子形 成。不希望受理论限制，HA蛋白是作为约75kDa的单体前体蛋白(HA0) 合成的，其在表面处组装成长形的三聚体蛋白。在三聚化发生之前，前体 蛋白在保守的活化切割位点(也称为“融合肽”)处被切割成2条通过二硫 键连接的多肽链——HA1和HA2(包含跨膜区)。HA1区段的长度可以为 328个氨基酸，HA2区段的长度可以为221个氨基酸。尽管该切割对于病 毒感染性可能是重要的，但是其对于蛋白质三聚化却不是必需的。HA插 入宿主细胞的内质网(ER)膜内，信号肽切割和蛋白质糖基化是共翻译事 件。正确的HA重折叠需要蛋白质糖基化以及形成6个链内二硫键。HA 三聚体在顺式-和反式-高尔基体复合物内组装，跨膜结构域在三聚化加工 中起作用。经菠萝蛋白酶处理的HA蛋白(缺少跨膜结构域)的晶体结构 显示在流感毒株之间具有高度保守的结构。还已明确，HA在感染过程中 发生重大的构象变化，这需要将前体HA0切割成2条多肽链(HA1和 HA2)。HA蛋白可被加工(即包含HA1和HA2结构域)，或者可以不进 行加工(即包含HA0结构域)。

本发明涉及包含跨膜结构域并包含HA1和HA2结构域的HA蛋白 的用途，例如所述HA蛋白可以是HA0，或是包含HA1和HA2的经加工 HA。所述HA蛋白可用于利用植物、植物细胞或表达系统生产或形成VLP。

本发明的HA可得自任意亚型。例如，HA可以是H1、H2、H3、 H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16 亚型或B型流感病毒。本发明的重组HA还可包含基于本领域公知的任意 血凝素序列的氨基酸序列——参见例如BioDefence Public Health base(流 感病毒；参见URL：biohealthbase.org)或者美国国立生物技术信息中心(参 见URL：ncbi.nlm.nih.gov)。此外，HA可基于从一种或多种新发现的或新 鉴定出的流感病毒中分离出的血凝素的序列。

本发明还包括VLP，其包含得自一种或多种流感病毒亚型的HA。 例如，VLP可包含来自以下亚型的一种或多种HA：H1(由SEQ ID NO：28 编码)、H2(由SEQ ID NO：12编码)、H3(由SEQ ID NO：13编码)、 H4(由SEQ ID NO：14编码)、H5(由SEQ ID NO：15编码)、H6(由SEQ  ID NO：16编码)、H7(由SEQ ID NO：11编码)、H8(由SEQ ID NO：17 编码)、H9(由SEQ ID NO：18编码)、H10(由SEQ ID NO：19编码)、 H11(由SEQ ID NO：20编码)、H12(由SEQ ID NO：21编码)、H13(由 SEQ ID NO：27编码)、H14(由SEQ ID NO：23编码)、H15(由SEQ ID  NO：24编码)、H16(由SEQ ID NO：25编码)或B型流感病毒(由SEQ ID  NO：26编码)，或其组合。来自一种或多种流感病毒亚型的一种或多种 HA可以在植物或昆虫细胞内共表达，以确保所述一种或多种HA的合成 导致形成含有得自一种或多种流感病毒亚型之HA组合的VLP。对HA之 组合的选择可通过由VLP制得之疫苗的目的用途来确定。例如，用于接种 鸟类的疫苗可包含HA亚型的任意组合，而用于接种人的VLP可包含一种 或多种H1、H2、H3、H5、H7、H9、H10、N1、N2、N3和N7亚型。然 而，也可根据接种用途来制备其它HA亚型的组合。

因此，本发明涉及含有一种或多种HA亚型的VLP，例如两个、三 个、四个、五个、六个或更多HA亚型。

本发明还提供了编码血凝素的核酸，当其在植物中表达时形成VLP。

示例性核酸可包含来自选定流感病毒亚型毒株的血凝素的核苷酸序 列。例如，A(H1N1)亚型例如A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)(SEQ ID  NO：33)、A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1)(包含构建体#660；SEQ ID NO： 60)以及较不常见的B型(例如SEQ ID NO：26，图10O)和C型(SEQ ID  NO：27，图10P)，以及从其它流感病毒亚型获得的HA。本发明中其它流 感病毒亚型的VLP还包括例如A/布里斯班/59/2007(H1N1；SEQ ID  NO：36)、A/所罗门群岛/3/2006(H1N1；SEQ ID NO：37)、A/新加坡/1/57 (H2N2；SEQ ID NO：42)、A/安徽/1/2005(H5N1；SEQ ID NO：43)、A/越 南/1194/2004(H5N1；SEQ ID NO：44)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1；SEQ  ID NO：45)、A/香港/1073/99(H9N2；SEQ ID NO：47)、A/布里斯班/10/2007 (H3N2；SEQ ID NO：38)、A/威斯康星/67/2005(H3N2；SEQ ID NO：39)、 A/马/布拉格/56(H7N7；SEQ ID NO：46)、B/马来西亚/2506/2004(SEQ ID  NO：40)或B/佛罗里达/4/2006(SEQ ID NO：41)。

血凝素的正确折叠对蛋白质稳定性、多聚体形成、VLP形成和HA 之功能(血细胞凝集能力)等流感病毒血凝素特性可以是重要的。蛋白质 折叠可受一个或多个因素影响，包括但不限于：蛋白质序列，蛋白质相对 丰度，细胞内拥挤程度，可与折叠的、部分折叠的或未折叠的蛋白质结合 或瞬时缔合的辅因子的利用度，一种或多种伴侣蛋白的存在情况等。

热休克蛋白(Hsp)或应激蛋白是伴侣蛋白的实例，其可参与多种 细胞过程包括蛋白质合成、细胞内运输、防止错误折叠、防止蛋白质凝集、 蛋白质复合物的组装和去组装、蛋白质折叠以及蛋白质解聚。这样的伴侣 蛋白的实例包括但不限于Hsp60、Hsp65、Hsp70、Hsp90、Hsp100、 Hsp20-30、Hsp10、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、TF55、FKBP、 亲环蛋白(cyclophilin)、ClpP、GrpE、泛素、钙联接蛋白(calnexin) 和蛋白质二硫键异构酶。参见，例如Macario，A.J.L.，Cold Spring Harbor  Laboratory Res.25：59-70.1995；Parsell，D.A.& Lindquist，S.Ann.Rev. Genet.27：437-496(1993)；美国专利No.5,232,833。在一些实例中，特定组 的伴侣蛋白包括Hsp40和Hsp70。

Hsp70的实例包括来自哺乳动物细胞的Hsp72和Hsc73、来自细菌 特别是分枝杆菌(如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆 菌(Mycobacterium tuberculosis)和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例 如Bacille-Calmette Guerin，本文中称为Hsp71))的DnaK。来自大肠杆 菌、酵母和其它原核生物的DnaK、以及来自真核生物(例如拟南芥)的 BiP和Grp78(Lin等，2001(Cell Stress and Chaperones6：201-208))。 Hsp70的一个具体实例是拟南芥Hsp70(由SEQ ID NO：122或SEQ ID NO： 123编码)。Hsp70能够特异性地结合ATP以及未折叠多肽和肽，从而参 与蛋白质折叠和解折叠以及参与蛋白质复合物的组装和去组装。

Hsp40的实例包括来自原核生物(例如大肠杆菌和分枝杆菌)的 DnaJ以及来自真核生物(例如苜蓿(Frugis等，1999.Plant Molecular  Biology40：397-408))的HSJ1、HDJ1和Hsp40。Hsp40的一个具体实例 是紫花苜蓿(M.sativa)MsJ1(由SEQ ID NO：121、123或114编码)。 Hsp40在蛋白质折叠、耐热性和DNA复制等细胞活动中作为分子伴侣起 作用。

在各Hsp中，Hsp70及其辅伴侣蛋白(co-chaperone)Hsp40与合 成完成前还在翻译的新合成多肽的稳定性相关。不希望受理论的限制， Hsp40与未折叠(新生或新转移的)多肽的疏水片区结合，因而有利于 Hsp70-ATP复合物与该多肽的相互作用。ATP水解导致多肽、Hsp70和 ADP之间形成稳定的复合物并释放Hsp40。Hsp70-ADP复合物与多肽之 疏水片区的缔合阻止其与其它疏水片区相互作用，并防止不正确折叠以及 与其它蛋白质形成凝集体(综述见于Hartl，FU.1996.Nature 381：571-579)。

同样不希望受理论限制，随着重组蛋白质表达系统中蛋白质的产生 增加，重组蛋白质表达的拥挤效应可能导致由于错误折叠之多肽发生降解 导致的重组蛋白质的凝集和/或累积减少。天然的伴侣蛋白能够有利于低水 平重组蛋白质的正确折叠，然而当表达水平增加时，天然伴侣蛋白可变为 限制因素。经农杆菌渗入之叶中血凝素的高水平表达可导致血凝素多肽在 胞质溶胶中累积，而与一种或多种伴侣蛋白(例如Hsp70、Hsp40或者 Hsp70及Hsp40两者)可提高表达该多肽之细胞的胞质溶胶中的稳定性， 因而减少错误折叠或凝集之血凝素多肽的水平，并增加作为稳定血凝素 (其呈现允许发生血细胞凝集和/或病毒样颗粒形成的三级和四级结构特 征)之多肽累积物的数目。

因此，本发明还提供了在植物中生产流感病毒VLP的方法，其中将 编码流感病毒HA的第一核酸与编码伴侣蛋白的第二核酸共表达。所述第 一核酸和第二核酸可在同一步骤中导入植物，或者可先后导入植物。本发 明还提供了在植物中生产流感病毒VLP的方法，其中所述植物包含所述第 一核酸，所述第二核酸随后被导入。

本发明还提供了包含编码一种或多种流感病毒血凝素之核酸以及编 码一种或多种伴侣蛋白之核酸的植物。

已提出，在流感病毒血凝素表达和/或分泌过程中加工N端信号肽 (SP)序列对折叠过程起作用。术语“信号肽”一般是指通常见于血凝素 多肽N端的短(约5～30个氨基酸)氨基酸序列，其可指导新翻译之多肽 转运至特定细胞器或者辅助多肽特定结构域的定位。血凝素的信号肽将该 蛋白质的转运靶向至内质网中，并已提出其辅助新生血凝素多肽相对于近 N端结构域之膜锚定结构域的定位，以辅助成熟血凝素的切割和折叠。除 去信号肽(例如，通过信号肽酶)可需要精确的切割以及去除信号肽以提 供成熟血凝素——这一精确切割可取决于若干因素中的任意因素，包括信 号肽的一部分还是全部、切割位点侧翼的氨基酸序列、信号肽的长度，或 者这些因素的组合，并且并非所有因素均适用于任一给定序列。

信号肽可以是所表达之血凝素天然存在的，或者重组血凝素包含来 自第一流感病毒类型、亚型或毒株的信号肽，而其余部分来自第二流感病 毒类型、亚型或毒株。例如，HA亚型H1、H2、H3、H5、H6、H7、H9 或B型流感病毒的天然信号肽可用于在植物系统中表达HA。

信号肽还可以是非天然的，例如来自结构蛋白或非流感病毒之病毒 的HA，或者来自植物、动物或细菌多肽。示例性信号肽是苜蓿蛋白质二 硫键异构酶(PDISP)(登记号Z11499的32-103位核苷酸；SEQ ID NO： 34；图17；氨基酸序列MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE)。

本发明还提供了包含天然或非天然信号肽的流感病毒血凝素以及编 码此类血凝素的核酸。

流感病毒HA蛋白在分子量、等电点、大小、聚糖成分等方面表现 出一系列相似之处和不同之处。各种血凝素的物理化学性质可用于区分在 植物、昆虫细胞或酵母系统中表达的HA，并且当多于一种HA在单一系 统中共表达时其可具有特殊用途。所述物理化学性质的实例示于表1中。

本发明还包括分别编码H1、H5或H7之HA的核苷酸序列SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11。本发明还包括在严格杂交条件下 与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11杂交的核苷酸序列。本 发明还包括在严格的杂交条件下与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：3、SEQ ID  NO：1互补序列杂交的核苷酸序列。与SEQ ID杂交或与SEQ ID互补序 列杂交的这些核苷酸序列编码当表达时形成VLP的血凝素蛋白，并且当施 用给对象时所述VLP诱导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内 表达形成VLP，所述VLP可用于产生能结合HA(包括一种或多种流感病 毒类型或亚型的成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体。当施用给对象时， 所述VLP诱导免疫应答。

本发明还包括核苷酸序列SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID  NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO： 18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、 SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ  ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID  NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、 SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID  NO：46或SEQ ID NO：47。本发明还包括在严格杂交条件下与下列序列杂 交的核苷酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ  ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO： 19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、 SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ  ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID  NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、 SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ  ID NO：47。本发明还包括在严格杂交条件下与下列序列之互补序列杂交的 核苷酸序列：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID  NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO： 19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、 SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ  ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID  NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、 SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ  ID NO：47。与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO： 19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、 SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ  ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID  NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、 SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ  ID NO：47杂交或者与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、 SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ  ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO： 23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、 SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ  ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID  NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46 或SEQ ID NO：47之互补序列杂交的这些核苷酸序列编码当表达时形成 VLP的血凝素蛋白，并且当施用给对象时所述VLP诱导抗体产生。例如， 所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成VLP，所述VLP可用于产生能结 合HA(包括一种或多种流感病毒类型或亚型的成熟HA、HA0、HA1或 HA2)的抗体。当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。

在一些实施方案中，本发明还包括核苷酸序列SEQ ID NO：33、SEQ  ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID  NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、 SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47，其编 码来自A型流感病毒之H1、H2、H3、H5、H7或H9亚型的HA或者来 自B型流感病毒的HA。本发明还包括在严格杂交条件下与SEQ ID NO： 33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、 SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID  NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47 杂交的核苷酸序列。本发明还包括在严格杂交条件下与SEQ ID NO：33、 SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ  ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID  NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47 之互补序列杂交的核苷酸序列。与SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ  ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ IDNO：41、SEQ IDNO：42、SEQ IDNO：43、SEQ IDNO：44、 SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47杂交或者与SEQ ID NO： 33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、 SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID  NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47 之互补序列杂交的核苷酸序列编码当表达时形成VLP的血凝素蛋白，并且 当施用给对象时所述VLP诱导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细 胞内表达形成VLP，所述VLP可用于产生能结合HA(包括一种或多种流 感病毒类型或亚型的成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体。当施用给对 象时，所述VLP诱导免疫应答。

在严格杂交条件下杂交是本领域公知的(参见例如Current  Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编，1995及增刊；Maniatis等， Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor  Laboratory，1982；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory  Manual，第3版，2001；所有这些均通过引用并入本文)。所述严格杂交条 件的一个实例可以是在65℃下于4×SSC中杂交约16～20小时，然后在 65℃下于0.1×SSC中清洗1小时，或在65℃下于0.1×SSC中清洗两次(每 次20或30分钟)。或者，一个示例性的严格杂交条件可以是在42℃下于 50％甲酰胺、4×SSC中过夜(16～20小时)，然后在65℃下于0.1×SSC中 清洗1小时，或在65℃下于0.1×SSC中清洗2次(每次20或30分钟或者 过夜(16～20小时))，或者在65℃下于Church水性磷酸盐缓冲液(7％ SDS；0.5M NaPO₄缓冲液pH7.2；10mM EDTA)中杂交，在50℃下于 0.1×SSC、0.1％SDS中清洗2次(每次20或30分钟)，或者在65℃下于 2×SSC、0.1％SDS中清洗2次(每次20或30分钟)。

此外，本发明包括特征在于与编码H1(SEQ ID NO：28)、H5(SEQ  ID NO：3)或H7(SEQ ID NO：11)之HA的核苷酸序列具有约70％、75 ％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、100％或其间任意量的序列同一性或序列相似性的核苷 酸序列，其中所述核苷酸序列编码当表达时形成VLP的血凝素蛋白，并且 所述VLP诱导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成 VLP，所述VLP可用于产生能结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或 HA2)的抗体。当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。

此外，本发明包括特征在于与核苷酸序列SEQ ID NO：12、SEQ ID  NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO： 17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、 SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ  ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO： 36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、 SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID  NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有约70％、75％、80％、85 ％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、 99％、100％或其间任意量的序列同一性或序列相似性的核苷酸序列，其中 所述核苷酸序列编码当表达时形成VLP的血凝素蛋白，并且所述VLP诱 导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成VLP，所述 VLP可用于产生能结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗体。 当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。

此外，本发明包括特征在于与核苷酸序列SEQ ID NO：33、SEQ ID  NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、 SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID  NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47具有约70％、 75％、80％、85％、87％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％、100％或其间任意量的序列同一性或序列相似性的核苷 酸序列，其中所述核苷酸序列编码当表达时形成VLP的血凝素蛋白，并且 所述VLP诱导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成 VLP，所述VLP可用于产生能结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或 HA2)的抗体。当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。

类似地，本发明包括与下述亚型相关的HA：H1(由SEQ ID NO：28 编码)、H2(由SEQ ID NO：12编码)、H3(由SEQ ID NO：13编码)、H4 (由SEQ ID NO：14编码)、H5(由SEQ ID NO：15编码)、H6(由SEQ ID  NO：16编码)、H7(由SEQ ID NO：11编码)、H8(由SEQ ID NO：17编码)、 H9(由SEQ ID NO：18编码)、H10(由SEQ ID NO：19编码)、H11(由 SEQ ID NO：20编码)、H12(由SEQ ID NO：21编码)、H13(由SEQ ID  NO：27编码)、H14(由SEQ ID NO：23编码)、H15(由SEQ ID NO：24 编码)、H16(由SEQ ID NO：25编码)或B型流感病毒(由SEQ ID NO：26 编码)，参见图10A至10O，以及特征在于与H1(SEQ ID NO：28)、H2 (SEQ ID NO：12)、H3(SEQ ID NO：13)、H4(SEQ ID NO：14)、H5 (SEQ ID NO：15)、H6(SEQ ID NO：16)、H7(SEQ ID NO：11)、H8 (SEQ ID NO：17)、H9(SEQ ID NO：18)、H10(SEQ ID NO：19)、H11 (SEQ ID NO：20)、H12(SEQ ID NO：21)、H13(SEQ ID NO：27)、H14 (SEQ ID NO：23)、H15(SEQ ID NO：24)、H16(SEQ ID NO：25)具有 约70～100％或其间任意量、80～100％或其间任意量、90～100％或其间 任意量或者95～100％或其间任意量的序列同一性的核苷酸序列，其中所 述核苷酸序列编码当表达时形成VLP的血凝素蛋白，并且所述VLP诱 导抗体产生。例如，所述核苷酸序列在植物细胞内表达形成VLP，所述 VLP可用于产生能结合HA(包括成熟HA、HA0、HA1或HA2)的抗 体。当施用给对象时，所述VLP诱导免疫应答。

“免疫应答”一般是指获得性免疫系统的应答。所述获得性免疫系统 通常包括体液应答和细胞介导的应答。体液应答是由B淋巴细胞谱系的细 胞(B细胞)中产生的由分泌型抗体所介导的免疫方面。分泌型抗体结合 入侵微生物(例如病毒或细菌)表面上的抗原，标示它们以进行破坏。体 液免疫一般用于指抗体产生和伴随抗体产生的过程，以及抗体的效应器功 能，包括Th2细胞活化和细胞因子产生、记忆细胞形成、调理素促进吞噬 作用、病原体清除等。术语“调节”等是指根据通常知晓或使用的任意几种 测定方法(其中一些在本文中举例说明)测定的特定应答或参数的升高或 降低。

细胞介导的应答是这样的免疫应答，其不涉及抗体，而涉及巨噬细 胞、自然杀伤细胞(NK)、抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的活化，以及 多种细胞因子响应于抗原而释放。细胞介导的免疫一般用于指某些Th细 胞的活化、Tc细胞的活化以及T细胞介导的应答。细胞介导的免疫在响应 于病毒感染中尤为重要。

例如，可使用ELISPOT测定来测量对抗原特异性CD8⁺T淋巴细胞 的诱导；可使用增殖测定来测量对CD4⁺T淋巴细胞的刺激。可使用ELISA 测定来定量抗流感病毒抗体的效价；还可使用抗同种型抗体的抗体(例如 抗IgG的抗体、抗IgA的抗体、抗IgE的抗体或抗IgM的抗体)来测量 抗原特异性或交叉反应性抗体的同种型。实施这些测定的方法和技术是本 领域中熟知的。

血细胞凝集抑制(HI或HAI)测定也可用于证明由疫苗或疫苗组合 物所诱导的抗体效力可抑制由重组HA所致的血红细胞(RBC)凝集。血 清样品的血细胞凝集抑制性抗体效价可利用微量滴定HAI来评估 (Aymard等，1973)。可使用来自任意几个物种的红细胞，例如马、火鸡、 鸡等。该测定给出有关HA三聚体在VLP表面上组装的间接信息，证实了 HA抗原位点的正确展示。

交叉反应性HAI滴定还可用于证明免疫应答对与疫苗亚型相关的其 它病毒株的效力。例如，来自用第一毒株的疫苗组合物(例如A/印度尼西 亚5/05的VLP)免疫之对象的血清可用于利用第二株全病毒或病毒颗粒 (例如A/越南/1194/2004)的HAI测定中，并且可测定HAI效价。

还可对细胞因子的存在或水平进行定量。例如，利用ELISA(例如 BD Biosciences OptEIA试剂盒)测量IFN-γ和IL-4分泌细胞来表征T辅 助细胞应答(Th1/Th2)。可培养从对象得到的外周血单核细胞(PBMC) 或脾细胞，并分析上清。还可使用标志物特异性荧光标记和本领域公知的 方法通过荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)对 T淋巴细胞定量。

还可进行微量中和测定来表征对象中的免疫应答，参见例如Rowe 等，1973的方法。可通过几种方法得到病毒中和效价，包括1)：在对细胞 进行结晶紫固定/着色之后，计数裂解斑(空斑测定)；2)显微镜观察培养 物中的细胞裂解；3)对NP病毒蛋白(与病毒感染宿主细胞有关)进行 ELISA和分光光度检测。

序列同一性或序列相似性可利用核苷酸序列比较程序来确定，例如 DNASIS所提供的(例如，使用但不限于下述参数：空隙罚分5、顶部对 角线数(# of top diagonal)5、固定的空隙罚分10、k元祖2、游隙10， 窗口大小5)。然而，其它用于比较的序列比对方法是本领域熟知的，例如 Smith & Waterman算法(1981，Adv.Appl.Math.2：482)、Needleman &  Wunsch算法(J.Mol.Biol.48：443，1970)、Pearson & Lipman算法(1988， Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444)，以及这些算法的计算机化执行(例 如GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST)或者人工比对和目视检查。

术语“血凝素结构域”是指含有HA0结构域或者HA1及HA2结构域 (或者称为HA1和HA2片段)的肽。HA0是HA1和HA2片段的前体。 HA单体通常可分为2个功能性结构域——茎结构域和球状头(或“头结构 域”)。所述茎结构域通过构象改变而涉及病毒的感染性和致病性，所述构 象改变可在暴露于酸性pH时发生。所述茎结构域可进一步细分为4个亚 结构域或片段——融合亚结构域或肽(在酸性pH构象状态下参与与宿主 之膜融合的疏水氨基酸区段)、茎亚结构域(其可提供两种或更多种构象)、 跨膜结构域或亚结构域(TmD)(涉及HA与脂质筏的亲和力)以及胞质 尾(胞质尾亚结构域)(Ctail)(参与HA分泌)。所述球状头部分为2个 亚结构域——RB亚结构域和退化的酯酶结构域(E)。所述E亚结构域可 部分或全部被掩盖并且不暴露于球状头部表面，因此针对HA产生的一些 抗体结合RB亚结构域。

术语“病毒样颗粒(VLP)”是指自组装并且含有结构蛋白(例如流 感病毒HA蛋白)的结构。VLP通常在形态上和抗原性上与感染中产生的 病毒体相似，但是缺少足以进行复制的遗传信息，因此是不具有感染性的。 在一些实例中，VLP可含有一种蛋白质或多于一种蛋白质。对于含有多于 一种蛋白质的VLP而言，所述蛋白质种类可来自同种病毒，或者可包含来 自不同种、属、亚科或科之病毒的蛋白质(如ICTV命名法所指定)。在另 一些实例中，可对VLP包含的一种或多种蛋白质的天然序列进行修饰。 VLP可以在合适的宿主细胞(包括植物和昆虫宿主细胞)中产生。在从宿 主细胞中提取、分离以及在合适条件下进一步纯化之后，VLP可作为完整 结构被纯化。

根据本发明，由流感病毒来源的蛋白质产生的VLP不含有M1蛋白。 已知M1蛋白结合RNA(Wakefield和Brownlee，1989)，而RNA是VLP 制备物中的污染物。当获得VLP产品的监管部门审批时，不期望存在 RNA，因此不含RNA的VLP制备物可以是有利的。

本发明的VLP可以在特征在于缺少使蛋白质唾液酸化之能力的宿 主细胞中产生，所述宿主细胞例如植物细胞、昆虫细胞、真菌和其它生物 (包括海绵动物、腔肠动物、环节动物、节肢动物、软体动物、线形动物 (nemathelminthea)、担轮动物(trochelmintes)、扁形动物、毛颚动物、 触手动物、衣原体、螺旋体、革兰氏阳性细菌、蓝细菌、古细菌等。参见 例如Glycoforum(URL：glycoforum.gr.jp/science/word/ evolution/ES-A03E.html)或者Gupta等，1999.Nucleic Acids Research 27：370-372；或Toukach等，2007.Nucleic Acids Research35：D280-D286； 或URL：glycostructures.jp(Nakahara等，2008.Nucleic Acids Research 36：D368-D371；2007年10月11日在线公开doi：10.1093/NAR/gkm833)。 如本文所述生产的VLP通常不含有神经氨酸酶(NA)。然而，如果需要包 含HA和NA的VLP，可以将NA与HA共表达。

根据本发明的一些方面，在植物中生产的VLP可与植物来源的脂质 复合。所述VLP可包含HA0、HA1或HA2肽。所述植物来源的脂质可以 是脂双层形式，并且还可包含围绕VLP的包膜。所述植物来源的脂质可包 含产生VLP之植物的质膜脂质组分，包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)、磷 脂酰乙醇胺(PE)、鞘糖脂、植物固醇或其组合。植物来源的脂质还可称 为“植物脂质”。植物固醇的实例是本领域公知的，包括例如豆固醇、谷固 醇、24-甲基胆固醇和胆固醇，参见例如Mongrand等，2004。

可通过例如血细胞凝集测定、电子显微镜或体积排阻色谱来评估 VLP的结构和大小。

对于体积排阻色谱而言，可通过以下方法从植物组织中提取全部可 溶性蛋白质：将冷冻粉碎的植物材料样品在提取缓冲液中匀浆(Polytron)， 并通过离心除去不溶性的物质。利用PEG沉淀也可以是有益的。对可溶 性蛋白质定量，并将提取物通过Sephacryl^TM柱。Blue Dextran2000可用 作校准标准。实施色谱之后，可通过免疫印迹进一步分析级分以确定所述 级分中蛋白质成分。

不希望受理论限制，HA结合来自不同动物之RBC的能力是由HA 对唾液酸α2，3或α2，3的亲和力以及RBC表面上存在这些唾液酸来驱动的。 马和禽类的流感病毒HA使来自所有几个物种(包括火鸡、鸡、鸭、豚鼠、 人、绵羊、马和牛)的红细胞凝集；而人HA将结合火鸡、鸡、鸭、豚鼠、 人和绵羊的红细胞(还参见Ito T.等，1997，Virology，卷227，493-499页；以 及Medeiros R等，2001，Virology，卷289，74-85页)。不同流感株的HA的 物种反应性实例显示在表2A和2B中。

表2A：所选的季节性流感株之HA所结合RBC的物种

表2B：所选的大流行流感株之HA所结合RBC的物种

蛋白质、融合蛋白或多肽的片段或部分包括含有特定蛋白质或多肽 之一部分氨基酸组成的肽或多肽，前提是当表达时所述片段可形成VLP。 所述片段可以例如包含抗原区域、应激响应诱导区域或含有该蛋白质或多 肽之功能结构域的区域。所述片段还可包含同一家族的蛋白质共有的区域 或结构域，或者所述片段可包含足以特异性鉴别其来源的全长蛋白质的氨 基酸序列。

例如，片段或部分可包含蛋白质全长的约60％至约100％或其间任 意量，前提是当表达时该片段可形成VLP。例如，蛋白质全长的约60％至 约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、 约95％至约100％，或其间任意量。或者，片段或部分可以取决于HA为 约150至约500个氨基酸或其间任意量，前提是当表达时所述片段可形成 VLP。例如，片段或部分可以取决于HA为约150至约500个氨基酸或其 间任意量、约200至约500个氨基酸或其间任意量、约250至约500个氨 基酸或其间任意量、约300至约500个氨基酸或其间任意量、约350至约 500个氨基酸或其间任意量、约400至约500个氨基酸或其间任意量、约 450至约500个氨基酸或其间任意量，前提是当表达时所述片段可形成 VLP。例如，可从HA蛋白的C端、N端或者N和C端去除约5、10、20、 30、40或50个氨基酸或其间任意量，前提是当表达时所述片段可形成VLP。

任意给定序列中的氨基酸编号是相对于该特定序列而言的，然而， 本领域技术人员可根据结构和/或序列容易地确定序列中特定氨基酸的“等 同性”。例如，如果当为了结晶而构建克隆时去除了6个N端氨基酸，那 么这将改变氨基酸的具体编码标识(例如，相对于蛋白质全长而言)，但 是不会改变氨基酸在所述结构中的相对位置。

可使用BLAST算法(Altschul等，1990，J.Mol Biol215：403-410)进 行序列比较。BLAST检索允许将查询序列与特定的序列或序列组进行比 较，或者与较大的序列文库或数据库(例如GenBank或GenPept)进行 比较，并且不但鉴定具有100％同一性的序列，还鉴定同一性程度较低的 序列。可使用BLAST算法比较核酸或氨基酸序列。此外，两个或更多个 序列之间的同一性可通过将序列一起比对并测定序列间的同一性百分比 来确定。可使用BLAST算法(例如可利用GenBank，URL： ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/，使用默认的参数：程序：blastn；数据库： nr；期望值10；过滤：默认；比对：成对比对；查询序列的遗传密码：标准 (1)；或者通过EMBL(URL：embl-heidelberg.de/Services/index.html)利 用BLAST2，使用默认的参数：Matrix BLOSUM62；过滤：默认；回声过 滤(echofilter)：打开；期望值：10；临界值：默认；链：两者；描述：50； 比对：50；或利用FASTA，使用默认的参数)或人工比较序列进行比对并 计算同一性百分比。

本发明描述了(但不限于)将编码HA的核酸克隆到植物表达载体 中，并从适于生产疫苗的植物中生产流感病毒VLP。所述核酸的实例包括 例如但不限于：流感病毒A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒HA(例如 SEQ ID NO：61)、来自A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1)的HA(例如SEQ  ID NO：60)、来自A/布里斯班/59/2007(H1N1)的HA(例如SEQ ID NO： 36、48、62)、来自A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)的HA(例如SEQ ID NO： 37、49、63)、来自A/新加坡/1/57(H2N2)的HA(例如SEQ ID NO：42、 54、64)、来自A/安徽/1/2005(H5N1)的HA(例如SEQ ID NO：43、55、 65)、来自A/越南/1194/2004(H5N1)的HA(例如SEQ ID NO：44、56、 66)、来自A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)的HA(例如SEQ ID NO：45、 57、67)、来自A/香港/1073/99(H9N2)的HA(例如SEQ ID NO：47、59、 68)、来自A/布里斯班/10/2007(H3N2)的HA(例如SEQ ID NO：38、50、 69)、来自A/威斯康星/67/2005(H3N2)的HA(例如SEQ ID NO：39、51、 70)、来自A/马/布拉格/56(H7N7)的HA(例如SEQ ID NO：46、58、71)、 来自B/马来西亚/2506/2004的HA(例如SEQ ID NO：40、52、72)、来自 B/佛罗里达/4/2006的HA(例如SEQ ID NO：41、53、73)。这些毒株的对 应克隆或构建体编号提供在表1中。对应于SEQ ID NO：36-47的核酸序列 包含质体蓝素启动子，其位于每个类型或亚型HA编码序列的上游并与其 有效连接，如图28-39所示。对应于SEQ ID NO：60-73的核酸序列包含 HA表达盒，其含有苜蓿质体蓝素启动子和5’UTR、HA的血凝素编码序 列、苜蓿质体蓝素3’UTR和终止子序列，如图51-64所示。

所述VLP还可用于生产由重组流感病毒结构蛋白组成的试剂，其在 经转化的宿主细胞(例如植物细胞或昆虫细胞)中自组装成功能性和免疫 原性的同型大分子蛋白质结构(包括流感亚病毒颗粒和流感病毒VLP)。

因此，本发明提供了VLP以及通过表达单一包膜蛋白在植物表达系 统中生产病毒VLP的方法。所述VLP可以是流感病毒VLP，或者是由其 它质膜来源的病毒(包括但不限于麻疹病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒 和HIV)产生的VLP。

还可使用本领域技术人员公知的来自其它包膜病毒的蛋白质，所述 包膜病毒例如但不限于：丝状病毒科(例如埃博拉病毒、马尔堡病毒等)、 副粘病毒科(例如麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、肺病毒等)、 逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒-1、人类免疫缺陷病毒-2、人T细 胞白血病病毒-1等)、黄病毒科(例如西尼罗河脑炎、登革病毒、丙型肝 炎病毒、黄热病毒等)、布尼病毒科(例如汉坦病毒等)、冠状病毒科(例 如冠状病毒、SARS等)。可在质膜来源的病毒中表达之抗原的非限制性实 例包括：HIV衣壳蛋白p24；HIV糖蛋白gp120或gp41；丝状病毒蛋白质， 包括埃博拉病毒的VP30或VP35，或马尔堡病毒的Gp/SGP，或麻疹副粘 病毒的H蛋白或F蛋白。例如，HIV的P24(例如GenBank编号gi： 19172948)是对HIV病毒基因组gag序列(例如GenBank编号gi：9629357) 进行翻译和切割而得到的蛋白质；HIV的gp120和gp41是对由HIV病毒 基因组的env编码的gp160蛋白(例如GenBank编号gi：9629363)进行翻 译和切割而得到的糖蛋白。埃博拉病毒的VP30(GenPept编号gi： 55770813)是对埃博拉病毒基因组的vp30序列(例如GenBank编号 gi：55770807)进行翻译而得到的蛋白质；埃博拉病毒的VP35(GenPept 编号gi：55770809)是对埃博拉病毒基因组的vp35序列进行翻译而得到的 蛋白质。马尔堡病毒的Gp/SGP(GenPept编号gi：296965)是对马尔堡病 毒基因组序列(GenBank编号gi：158539108)进行翻译而得到的蛋白质。 H蛋白(GenPept编号gi：9626951)是麻疹病毒基因组的H序列(GenBank 编号gi：9626945)的蛋白质；F蛋白(GenPept编号gi：9626950)是麻疹 病毒基因组的F序列的蛋白质。

然而，本发明方法中也可使用本领域技术人员已知的其它包膜蛋白。

因此，本发明提供了包含编码HIV-p24、HIV-gp120、HIV-gp41、 埃博拉病毒-VP30、埃博拉病毒-VP35、马尔堡病毒Gp/SGP、麻疹病毒-H 蛋白或-F蛋白之序列的核酸分子。所述核酸分子可与在昆虫、酵母或植物 细胞中或在特定植物组织中有活性的调控区有效连接。

本发明还提供了将编码HA(例如但不限于人流感病毒A/印度尼西 亚/5/05病毒(H5N1)的HA)的核酸克隆到植物或昆虫表达载体(例如 杆状病毒表达载体)中，并在经转化的植物细胞或经转化的昆虫细胞中产 生流感候选疫苗或试剂，所述疫苗或试剂包含自组装成功能性和免疫原性 同型大分子蛋白质结构(包括流感亚病毒颗粒和流感病毒VLP)的重组流 感病毒结构蛋白。

可例如使用杆状病毒表达系统在合适的细胞系(例如草地贪夜蛾 (Spodopterafrugiperda)细胞(如Sf-9细胞系；ATCC PTA-4047))中表 达编码流感病毒亚型之HA的核酸，所述流感亚型例如但不限于A/新喀里 多尼亚/20/99(H1N1)、A/印度尼西亚/5/05亚型(H5N1)、A/布里斯班 /59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)、A/新加坡/1/57(H2N2)、 A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97 (H6N1)、A/香港/1073/99(H9N2)、A/布里斯班/10/2007(H3N2)、A/威 斯康星/67/2005(H3N2)、A/马/布拉格/56(H7N7)、B/马来西亚/2506/2004、 B/佛罗里达/4/2006。还可使用其它昆虫细胞系。

或者，编码HA的核酸可在植物细胞或植物中表达。可使用HA RNA 通过逆转录和聚合酶链反应(PCR)来合成编码HA的核酸。例如，所述 RNA可从人流感病毒A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒或人流感病毒 A/印度尼西亚/5/05(H5N1)病毒或其它流感病毒(例如A/布里斯班/59/2007 (H1N1)、A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安 徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97 (H6N1)、A/香港/1073/99(H9N2)、A/布里斯班/10/2007(H3N2)、A/威 斯康星/67/2005(H3N2)、A/马/布拉格/56(H7N7)、B/马来西亚/2506/2004， B/佛罗里达/4/2006)中分离，或者从被流感病毒感染的细胞中分离。对于 逆转录和PCR而言，可使用特异性针对HA RNA的寡核苷酸引物，所述 HA例如但不限于人流感病毒A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)病毒的HA序 列，或人流感病毒A/印度尼西亚/5/05(H5N1)病毒的HA0序列，或来自 流感病毒亚型A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)、 A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/越南/1194/2004(H5N1)、 A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/香港/1073/99(H9N2)、A/布里斯班/ 10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、A/马/布拉格/56(H7N7)、 B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006的HA序列。另外，可使用本 领域技术人员已知的方法来化学合成编码HA的核酸。

根据宿主表达系统的要求，可将这些基因所得的cDNA拷贝克隆进 合适的表达载体中。以下描述了用于植物的合适表达载体的实例，或者说， 可利用已知的方法以及制造商说明书中提供的信息，使用杆状病毒表达载 体(例如pFastBacl(InVitrogen))得到基于pFastBacl的质粒，。

本发明还涉及包含编码HA之核酸的基因构建体，如上所述，其与 在植物中可用的调控元件有效连接。在植物细胞中有效并可用在本发明中 的调控元件的实例包括但不限于质体蓝素调控区(US7,125,978；其通过 引用并入本文)或核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO；US 4,962,028；其通过引用并入本文)、叶绿素a/b结合蛋白(CAB；Leutwiler 等；1986；其通过引用并入本文)、ST-LS1(与光系统II的放氧复合物相 关，并描述于Stockhaus等1987、1989中；其通过引用并入本文)的调控 区。质体蓝素调控区的实例是包含SEQ ID NO：36的第10～85位核苷酸 或SEQ ID NO：37～47任一序列中的相似区域的序列。调控元件或调控区 可增强与其有效连接之核苷酸序列的翻译，所述核苷酸序列可编码蛋白质 或多肽。调控区的另一实例是源自豇豆花叶病毒(Cowpea Mosaic Virus， CPMV)非翻译区的调控区，其可用于优先翻译与其有效连接的核苷酸序 列。这一CPMV调控区包含CMPV-HT系统，参见例如Sainsbury等，2008， Plant Physiology148：1212-1218。

如果构建体在昆虫细胞中表达，在昆虫细胞中可用的调控元件的实 例包括但不限于多角体蛋白启动子(Possee和Howard1987.Nucleic Acids  Research15：10233-10248)、gp64启动子(Kogan等，1995.J Virology 69：1452-1461)等。

因此，本发明的一个方面提供了包含调控区和编码流感病毒HA之 序列的核酸。所述调控区可以是质体蓝素调控元件，所述流感病毒HA可 选自包含以下的流感毒株或亚型：A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/印 度尼西亚/5/05亚型(H5N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群 岛/3/2006(H1N1)、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/ 越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/香港/1073/99 (H9N2)、A/布里斯班/10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、 A/马/布拉格/56(H7N7)、B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗里达/4/2006。本 文中通过SEQ ID NO：36～47举例说明了包含质体蓝素调控元件和流感病 毒HA的核酸序列。

已知，当在蛋或哺乳动物细胞(例如MDCK细胞)中培养流感病毒 时，或者当从被感染的对象中分离流感病毒时，流感病毒血凝素的氨基酸 序列或编码它们的核酸序列可存在序列差异。这样的差异的非限制性实例 在本文中举例说明，包括实施例18。此外，本领域技术人员应当认识到， 由于另外的突变继续出现，因此可在来自新毒株的流感病毒血凝素中观察 到其它变异。由于不同流感病毒血凝素之间的已知序列变异，本发明包括 可利用任意流感病毒血凝素制备的VLP，前提是当如本文所述在宿主中表 达时流感病毒血凝素形成VLP。

可使用本领域中已知的几种软件包中的任意一种例如MULTALIN (F.CORPET，1988，Nucl.Acids Res.，16(22)，10881-10890)来确定序列比 对和共有序列，或者可人工比对序列并测定序列之间的相似性和差异。

已深入研究了血凝素的结构，并且已知所述结构是高度保守的。在 将血凝素的结构进行重叠时，观察到高度的结构保守性(rmsd＜2A)。即 使某些位置中的氨基酸序列可改变，仍可观察到这种结构保守性(参见例 如Skehel和Wiley，2000Ann Rev Biochem69：531-69；Vaccaro等2005)。 血凝素的区域也是非常保守的，例如：

结构域：HA0多肽被切割以提供成熟的HA。HA是同三聚体，其中 每个单体包含通过一个二硫键连接的受体结合结构域(HA1)和膜锚定结 构域(HA2)；HA2亚基的N端20个残基还称为“HA融合结构域(或序 列)”。还存在“尾”区域(被膜内部)。每种血凝素均包含这些区域或结构 域。各区域或结构域的长度通常是保守的。

所有血凝素含有相同数目和位置的分子内和分子间二硫桥。参与二硫 桥网络之半胱氨酸的氨基酸序列的数目和位置在HA中是保守的。举例说 明特征性分子内和分子间二硫桥和其它保守氨基酸及其相对位置之结构 的实例描述于例如Gamblin等2004(Science303：1838-1842)中。示例性 结构和序列包括1RVZ、1RVX、1RVT、1RV0、1RUY、1RU7，其可从蛋 白质数据库(Berman等2003.Nature Structural Biology10：980；URL： rcsb.org)获取。

胞质尾—大多数血凝素在保守位置包含3个半胱氨酸。作为翻译后修 饰，这些半胱氨酸中的一个或多个可被棕榈酸化。

流感病毒的血凝素可容忍氨基酸变异。该变异提供了不断鉴定出的 新毒株。所述新毒株之间的感染性可以不同。然而，保持了血凝素三聚体 的形成，其随后形成VLP。因此，本发明提供了血凝素氨基酸序列或编码 血凝素氨基酸序列的核酸，其在植物中形成VLP，并包括已知的序列及其 可能出现的变异序列。

图65举例说明这些已知变异的实例。该图显示下述H1N1毒株之 HA的共有氨基酸序列(SEQ ID NO：74)：

A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)(由SEQ ID NO：33编码)、A/布里斯 班/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO：48)、A/所罗门群岛/3/2006(H1N1)(SEQ  ID NO：49)以及SEQ ID NO：9。X1(第3位)是A或V；X2(第52位) 是D或N；X3(第90位)是K或R；X4(第99位)是K或T；X5(第 111位)是Y或H；X6(第145位)是V或T；X7(第154位)是E或 K；X8(第161位)是R或K；X9(第181位)是V或A；X10(第203 位)是D或N；X11(第205位)是R或K；X12(第210位)是T或K； X13(第225位)是R或K；X14(第268位)是W或R；X15(第283 位)是T或N；X16(第290位)是E或K；X17(第432位)是I或L； X18(第489位)是N或D。

作为这种变异的另一实例，A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)(由SEQ  ID NO：33编码)、A/布里斯班/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO：48)、A/所 罗门群岛/3/2006(H1N1)(SEQ ID NO：49)、A/波多黎各/8/34(H1N1) 之HA和SEQ ID NO：9的序列比对和共有序列示于如下表3中。

表3：所选H1N1毒株之HA的序列比对和共有序列

共有序列中大写字母表示所有序列在指定位置处共有的氨基酸；小写 字母表示至少一半或大部分序列共有的氨基酸；符号“！”是I或V中任意 一个；符号“$”是L或M中任意一个；符号“％”是F或Y中任意一个，符 号“#”是N、D、Q、E、B或Z中任意一个；符号“.”是无氨基酸(例如缺 失)；第3位的X是A或V中任意一个；第52位的X是E或N中任意一 个；第90位的X是K或R；第99位的X是T或K；第111位的X是Y 或H中任意一个；第145位的X是V或T中任意一个；第157位的X是 K或E；第162位的X是R或K；第182位的X是V或A；第203位的 X是N或D；第205位的X是R或K；第210位的X是T或K；第225 位的X是K或Y；第333位的X是H或缺失；第433位的X是I或L； 第49位的X是N或D。

作为这种变异的另一实例，A/安徽/1/2005(H5N1)(SEQ ID NO：55)、 A/越南/1194/2004(H5N1)和A/印度尼西亚/5/2006(H5N1)(SEQ ID NO： 10)之HA的序列比对和共有序列示于如下表4中。

表4：所选H1N1毒株之HA的序列比对和共有序列

共有序列中大写字母表示所有序列在指定位置处共有的氨基酸；小写 字母表示至少一半或大部分序列共有的氨基酸；符号“！”是I或V中任意 一个；符号“$”是L或M中任意一个；符号“％”是F或Y中任意一个，符 号“#”是N、D、Q、E、B或Z中任意一个；第102位的X是T、V或A； 第110位的X是S、D或N；第156位的X是S、K或T。

以上例举和描述的比对和共有序列是血凝素氨基酸序列中变异的非 限制性实例，所述氨基酸序列可用于本发明多个实施方案中以在植物中生 产VLP。

可容易地测定编码氨基酸序列的核酸，因为每种氨基酸的密码子是 本领域公知的。因此，提供氨基酸序列则可得出编码它的简并核酸序列。 因此，本发明提供了编码本文所述的流感毒株和亚型(例如A/新喀里多尼 亚/20/99(H1N1)、A/印度尼西亚/5/2006(H5N1)、A/鸡/纽约/1995、A/银 鸥/DE/677/88(H2N8)、A/得克萨斯/32/2003、A/绿头鸭/MN/33/00、A/鸭/ 上海/1/2000、A/针尾鸭/TX/828189/02、A/火鸡/安大略/6118/68(H8N4)、 A/琵嘴鸭/伊朗/G54/03、A/鸡/德国/N/1949(H10N7)、A/鸭/英格兰/56 (H11N6)、A/鸭/阿尔伯达/60/76(H12N5)、A/鸥/马里兰/704/77(H13N6)、 A/绿头鸭/Gurjev/263/82、A/鸭/澳大利亚/341/83(H15N8)、A/红嘴鸥/瑞 典/5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/约翰内斯堡/66、A/波多黎各/8/34(H1N1)、 A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/布里斯 班10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、B/马来西亚/2506/2004、 B/佛罗里达/4/2006、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/ 越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/马/布拉格/56 (H7N7)、A/香港/1073/99(H9N2))之血凝素的核酸序列以及编码上述 血凝素的简并序列。

此外，可容易地测定核酸编码的氨基酸序列，因为每种氨基酸的密 码子是公知的。因此，提供核酸则可得出其编码的氨基酸序列。因此，本 发明提供了本文所述的流感毒株和亚型(例如A/新喀里多尼亚/20/99 (H1N1)、A/印度尼西亚/5/2006(H5N1)、A/鸡/纽约/1995、A/银鸥 /DE/677/88(H2N8)、A/得克萨斯/32/2003、A/绿头鸭/MN/33/00、A/鸭/上 海/1/2000、A/针尾鸭/TX/828189/02、A/火鸡/安大略/6118/68(H8N4)、A/ 琵嘴鸭/伊朗/G54/03、A/鸡/德国/N/1949(H10N7)、A/鸭/英格兰/56 (H11N6)、A/鸭/阿尔伯达/60/76(H12N5)、A/鸥/马里兰/704/77(H13N6)、 A/绿头鸭/Gurjev/263/82、A/鸭/澳大利亚/341/83(H15N8)、A/红嘴鸥/瑞 典/5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/约翰内斯堡/66、A/波多黎各/8/34(H1N1)、 A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/布里斯 班10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、B/马来西亚/2506/2004、 B/佛罗里达/4/2006、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/ 越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/马/布拉格/56 (H7N7)、A/香港/1073/99(H9N2))之血凝素的氨基酸序列。

在植物中，流感病毒VLP从质膜中出芽(参见实施例5和图19)， 因此，VLP的脂质组成反映了其来源。根据本发明生产的VLP包含一种 或多种类型或亚型流感病毒的HA，其与植物来源的脂质复合。植物脂质 可刺激特异性免疫细胞以及增强所诱导的免疫应答。植物的膜包含脂质、 磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)，并且还包含鞘糖脂、皂苷和植 物固醇。此外，植物质膜中还存在脂质筏—这些微小区域富含鞘脂和固醇。 在植物中，已知存在多种植物固醇，包括豆固醇、谷固醇、24-甲基胆固醇 和胆固醇(Mongrand等，2004)。

PC和PE以及鞘糖脂可结合哺乳动物免疫细胞表达的CD1分子， 所述免疫细胞例如抗原呈递细胞(APC)(例如树突状细胞和巨噬细胞) 以及其它细胞包括胸腺和肝脏中的B淋巴细胞和T淋巴细胞(Tsuji M，. 2006)。CD1分子在结构上与主要组织相容性复合体（MHC）I类分子相 似，其作用是将糖脂抗原呈递给NKT细胞(自然杀伤T细胞)。活化后， NKT细胞激活先天免疫细胞(例如NK细胞和树突状细胞)并且还激活获 得性免疫细胞(例如产生抗体的B细胞和T细胞)。

在质膜中可发现多种植物固醇—该特异性组成可因物种、生长条件、 营养源或病原体状态而异(以上因素仅为举例说明)。一般而言，β-谷固醇 是最丰富的植物固醇。

存在于与脂双层(例如质膜来源的包膜)复合的流感病毒VLP中的 植物固醇可提供有利的疫苗组合物。不希望受理论限制，与脂双层(例如 质膜来源的包膜)复合的由植物生产的VLP可诱导比在其它表达系统中制 得的VLP更强的免疫反应，并且可与由活的或减毒的全病毒疫苗诱导的免 疫反应相似。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了与植物来源之脂双层复合 的VLP。在一些实施方案中，所述植物来源的脂双层可包含VLP的包膜。

在植物内生产的VLP可包括含有植物特异性N-聚糖的HA。因此， 本发明还提供了包含具有植物特异性N-聚糖之HA的VLP。

此外，植物中N-聚糖的修饰是公知的(参见例如U.S.60/944,344， 其通过引用并入本文)，并且可产生含有经修饰N-聚糖的HA。可得到包 含经修饰糖基化模式(例如岩藻糖基化减少、木糖基化减少、或二者均减 少)之N-聚糖的HA，或者可得到含有经修饰糖基化模式的HA，其中蛋 白质缺少岩藻糖基化、木糖基化或两者皆缺少，并包含增加的半乳糖基化。 此外，与表达HA的野生型植物相比，翻译后修饰的调节(例如末端添加 半乳糖)可导致所表达HA的岩藻糖基化和木糖基化降低。

例如(但不视为限制)，合成具有经修饰糖基化模式的HA可通过使 目的蛋白质与编码β-1，4-半乳糖基转移酶(GalT)(例如但不限于哺乳动物 GalT或人GalT，然而，也可以使用其它来源的GalT)的核苷酸序列共表 达来实现。还可将GalT的催化结构域与N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶 (GNT1)的CTS结构域(即胞质尾、跨膜结构域、主干区)融合以产生 GNT1-GalT杂合酶，并且该杂合酶可与HA共表达。HA还可与编码N- 乙酰氨基葡萄糖基转移酶III(GnT-III)(例如但不限于哺乳动物GnT-III 或人GnT-III，还可使用其它来源的GnT-III)的核苷酸序列共表达。另外， 还可使用包含与GnT-III融合的GNT1之CTS的GNT1-GnT-III杂合酶。

因此，本发明还包括含有HA的VLP，所述HA具有经修饰的N- 聚糖。

不希望受理论限制，HA上存在植物N-聚糖可通过促进抗原呈递细 胞与HA的结合来刺激免疫应答。Saint-jore-Dupas等(2007)已提出使 用植物N-聚糖来刺激免疫应答。此外，VLP的构象对于抗原呈递可以是 有利的，并且当与植物来源的脂质层复合时增强VLP的佐剂作用。

“调控区”、“调控元件”或“启动子”意指通常(但不总是)位于基因 的蛋白质编码区上游的一部分核酸，其可包括DNA或RNA或者DNA和 RNA两者。当调控区有活性并与目的基因有效结合或有效连接时，可导致 所述目的基因的表达。调控元件可以介导器官特异性，或控制发育基因或 时序基因的活化。“调控区”包括启动子元件、表现出启动子基础活性的核 心启动子元件、可响应于外部刺激而诱导的元件、介导启动子活性的元件 (例如负调控元件或转录增强子)。本文所用的“调控区”还包括在转录后具 有活性的元件，例如调节基因表达的调控元件(例如翻译增强子和转录增 强子、翻译抑制子和转录抑制子)、上游激活序列以及mRNA不稳定性决 定子(mRNA instability determinant)。这后几种元件中有几种可位于编 码区附近。

在本公开内容中，术语“调控元件”或“调控区”一般是指通常(但不 总是)位于结构基因编码序列上游(5’)的DNA序列，其通过识别RNA 聚合酶和/或转录所需的其它因子来控制编码区在特定位点起始表达。然 而，应当理解的是，位于内含子中或序列3’端的其它核苷酸序列也可有助 于调节目的编码区的表达。识别RNA聚合酶或其它转录因子以确保在特 定位点起始的调控元件的一个实例是启动子元件。大多数(但不是全部) 真核生物启动子元件包含TATA盒，其是由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成 的保守核酸序列，通常位于转录起始位点上游约25个碱基对处。启动子元 件包含负责起始转录的基础启动子元件以及修饰基因表达的其它调控元 件(如上文所述)。

存在几种类型的调控区，包括受发育调节的、诱导型的或组成型的 调控区。受发育调节的调控区或对所控制基因的差异性表达进行控制的调 控区在特定器官或器官之组织中、在发育过程中的特定时间在所述器官或 组织中被活化。然而，受发育调节的一些调控区也可偏好性地在某些器官 或组织的特定发育阶段具有活性，它们还可以以受发育调节的方式具有活 性，或在所述植物的其它器官或组织内具有基础水平的活性。组织特异性 调控区(例如参见特异性调控区)的实例包括napin启动子和cruciferin 启动子(Rask等，1998，J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau等，1994， Plant Cell14：125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体蓝素启动子(图 1b或SEQ ID NO：23)，US7,125,978，其通过引用并入本文。

诱导型调控区是能够响应于诱导物而直接或间接激活一种或多种 DNA序列或基因之转录的调控区。当不存在诱导物时，所述DNA序列或 基因不会被转录。通常，特异性结合诱导型调控区以激活转录的蛋白因子 可以无活性形式存在，然后通过诱导物直接或间接转化成活性形式。然而， 也可以不存在蛋白因子。所述诱导物可以是化学剂，例如蛋白质、代谢物、 生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过加热、致冷、盐或毒性元素直 接施加的生理胁迫；或通过病原体或致病剂(例如病毒)的作用间接产生 的生理胁迫。可通过向细胞或植物外部施加诱导物(例如通过喷雾、浇水、 加热或类似方法)使含有诱导型调控区的植物细胞暴露于诱导物。诱导型 调控元件可来源于植物基因或非植物基因(例如Gatz，C.和Lenk，I.R.P.， 1998，Trends Plant Sci.3，352-358，其通过引用并入本文)。可能的诱导型 启动子的实例包括但不限于四环素诱导型启动子(Gatz，C.，1997，Ann.Rev. Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48，89-108，其通过引用并入本文)、类固醇 诱导型启动子(Aoyama，T.和Chua，N.H.，1997，Plant J.2，397-404，其通过 引用并入本文)和乙醇诱导型启动子(Salter，M.G.等，1998，Plant Journal 16，127-132；Caddick，M.X.等，1998，Nature Biotech.16，177-180，其通过引 用并入本文)、细胞分裂素诱导型IB6和CKI1基因(Brandstatter，I.和 Kieber，J.J.，1998，Plant Cell10，1009-1019；Kakimoto，T.，1996，Science 274，982-985，其通过引用并入本文)以及生长素诱导型元件DR5(Ulmasov， T.等，1997，Plant Cell9，1963-1971，其通过引用并入本文)。

组成型调控区指导基因在植物各部分以及整个植物发育过程中持续表 达。已知的组成型调控元件的实例包括与以下转录物相关的启动子：CaMV 35S转录物(Odell等，1985，Nature，313：810-812)、水稻肌动蛋白1(Zhang 等，1991，Plant Cell，3：1155-1165)、肌动蛋白2(An等，1996，Plant J.，10： 107-121)或tms2(U.S.5,428,147，其通过引用并入本文)以及磷酸丙糖 异构酶1基因(Xu等，1994，Plant Physiol.106：459-467)、玉米泛素1基 因(Cornejo等，1993，Plant Mol.Biol.29：637-646)、拟南芥泛素1和6基 因(Holtorf等，1995，Plant Mol.Biol.29：637-646)、烟草翻译起始因子4A 基因(Mandel等，1995，Plant Mol.Biol.29：995-1004)。本文所用的术语“组 成型”不一定是指受所述组成型调控区控制的基因在所有细胞类型中以相 同水平表达，而是指所述基因在多种细胞类型中表达，即使常常观察到不 同的丰度。组成型调控元件可与另一些序列偶联以进一步增强与其有效连 接之核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，CMPV-HT系统(Sainsbury等， 2008，Plant Physiology148：1212-1218)源自豇豆花叶病毒(COMV)的非 翻译区，并显示增强相关编码序列的翻译。

“天然”意指核酸或氨基酸序列是天然存在的，或称“野生型”。

“有效连接”意指特定序列(例如调控元件与目的编码区)直接或间 接地相互作用以实现预定功能(例如介导或调节基因表达)。有效连接的 序列之间的相互作用可例如通过与所述有效连接之序列相互作用的蛋白 质来介导。

本发明的一种或多种核苷酸序列可在由本发明的核苷酸序列、构建 体或载体转化的任意合适的植物宿主中表达。合适宿主的实例包括但不限 于农作物，包括苜蓿、油菜、芸苔属物种、玉米、烟草属物种、苜蓿、马 铃薯、人参、豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、向日葵和棉花等。

本发明的一种或多种嵌合基因构建体还可包含3’非翻译区。3’非翻 译区是指这样的基因部分，其包含含有多腺苷酸化信号和能够影响mRNA 加工或基因表达之任意其它调控信号的DNA区段。所述多腺苷酸化信号 的特征一般在于向mRNA前体的3’端添加多腺苷酸链。多腺苷酸化信号 常通过存在经典形式的5’AATAAA-3’同源物来鉴定，但是也会出现变异。 需要时，本发明的一种或多种嵌合基因构建体还可包含另外的增强子(翻 译增强子或转录增强子)。这些增强子区域是本领域技术人员公知的，并 且可包括ATG起始密码子和邻近序列。所述起始密码子必须在编码序列 的读码框内，以确保翻译出完整序列。

合适的3’区的非限制性实例是含有以下基因的多腺苷酸化信号的3’ 经转录的非翻译区：农杆菌致瘤(Ti)质粒基因(例如胭脂碱合酶(Nos 基因))以及植物基因(例如大豆贮藏蛋白基因)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化 酶的小亚基基因(ssRUBISCO；US4,962,028，其通过引用并入本文)、用 于调节质体蓝素表达的启动子(Pwee和Gray1993，其通过引用并入本 文)。质体蓝素启动子的实例描述于US7,125,978(其通过引用并入本文) 中。

如本文所述，已发现包含增强子(经证实其在叶表达中具有效力) 序列的启动子在瞬时表达中有效。不希望受理论限制，通过将光合作用基 因的上游调控元件与核基质结合可介导强的表达。例如，可使用豌豆质体 蓝素基因的翻译起始位点至-784位来介导强的报告基因表达。

为了帮助鉴定转化植物细胞，可进一步处理本发明的构建体使其包 含植物选择标记。可用的选择标记包括提供针对化学品(例如抗生素，如 庆大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草剂，如膦丝菌素(phosphinothrycin)、 草甘膦、氯磺隆等)之抗性的酶。类似地，可使用产生可通过颜色变化进 行鉴定之化合物的酶(例如GUS(β-葡萄糖醛酸酶))或化学发光的酶(萤 光素酶或GFP)。

本发明还涉及包含本发明的嵌合基因构建体的转基因植物、植物细 胞或种子。由植物细胞再生完整植物的方法也是本领域公知的。一般而言， 将转化植物细胞培养在合适的培养基中，所述培养基可包含选择剂(例如 抗生素)，其中选择标记有利于鉴定转化植物细胞。愈伤组织一经形成， 可根据已知的方法应用合适的植物激素来促进芽的形成，并将芽移至生根 培养基中用于再生植物。然后，通过种子或利用植物无性繁殖技术，所述 植物可反复用于形成子代。也可以不使用组织培养物来形成转基因植物。

本发明还涉及包含嵌合基因构建体的转基因植物、树木、酵母、细 菌、真菌、昆虫和动物细胞，所述嵌合基因构建体含有编码用于根据本发 明产生VLP之重组HA0的核酸。

为了在一系列可用于转化或瞬时表达的宿主生物中表达，可以将本 发明的调控元件与目的编码区相组合。这样的生物包括但不限于植物(单 子叶植物和双子叶植物)，例如但不限于玉米、谷类植物、小麦、大麦、 燕麦、烟草属物种、芸苔属物种、大豆、豌豆、苜蓿、马铃薯、番茄、人 参和拟南芥。

用于稳定转化以及再生这些生物的方法已在本领域中建立并且是本 领域技术人员公知的。获得转化植物和再生植物的方法对本发明来说不是 关键性的。

“转化”意指表现为基因型、表型或二者兼有的遗传信息在种间的稳 定转移。遗传信息从嵌合构建体向宿主进行种间转移可以是可遗传的，认 为所述遗传信息的转移是稳定的；或者，所述转移可以是瞬时的，这时所 述遗传信息是不可遗传的。

术语“植物物质”意指来源于植物的任何材料。植物物质可包括完整 植株、组织、细胞或其任意部分。此外，植物物质可包括细胞内植物组分、 细胞外植物组分、植物的液体或固体提取物，或者其组合。此外，植物物 质可包括来自植物叶、茎、果实、根或其组合的植物、植物细胞、组织、 液体提取物或其组合。植物物质可包括未进行任何处理步骤的植物或其部 分。植物的一部分可包含植物物质。然而，还应当考虑的是，可对所述植 物材料施加下文定义的最低限度处理步骤或更严格的处理，包括使用本领 域公知的技术(包括但不限于色谱、电泳等)进行部分或大量蛋白质纯化。

术语“最低限度处理”意指部分纯化包含目的蛋白的植物物质(例如 植物或其部分)以得到植物提取物、匀浆、植物匀浆的级分等(即最低限 度处理)。部分纯化可包括但不限于破坏植物细胞结构从而产生含有可溶 性植物组分和不溶性植物组分的组合物，所述不溶性植物组分可通过例如 但不限于离心、过滤或其组合进行分离。在此方面，使用真空或离心提取 可容易地获得分泌到叶或其它组织的细胞外空间内的蛋白质，或可以利用 通过滚轴或研磨等在压力下进行组织提取从而将所述蛋白从细胞外空间 中挤压或释放。最低限度处理还可包括制备可溶性蛋白质的粗提物，因为 这些制备物中将含有可忽略不计的来自次植物产物的污染。另外，最低限 度处理可包括从叶中用水性溶液提取可溶性蛋白质，然后用任意合适的盐 进行沉淀。其它方法可包括大规模的浸渍和汁液提取，从而允许直接使用 所述提取物。

可将植物物质(采取植物材料或组织的形式)经口递送给对象。所 述植物物质可作为膳食补充剂的一部分与其它食物一起施用，或者被装入 胶囊中。植物物质或组织还可以被浓缩以改善或增进适口性，或者在需要 时与其它材料、成分或药物赋形剂一起提供。

可施用本发明VLP的对象或目标生物的实例包括但不限于人、灵长 类、鸟类、水禽、候鸟、鹌鹑、鸭、鹅、家禽、鸡、猪、绵羊、马科动物、 马、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、虎、豹、麝猫、水貂、石貂、 雪貂、宠物、家畜、兔、小鼠、大鼠、豚鼠或其它啮齿动物、海豹、鲸等。 这些目标生物是示例性的，并且不视为限制本发明的应用和用途。

根据需要和情形，可以考虑以多种方式将含有目的蛋白的植物或表 达含有目的蛋白之VLP的植物施用给对象或目标生物。例如，在使用之前， 得自所述植物的目的蛋白可以粗提物、部分纯化或纯化的形式被提取。如 果对蛋白质进行纯化，那么所述蛋白可以在可食用植物或不可食用植物中 产生。此外，如果经口施用蛋白质，则可以收集所述植物组织并直接向对 象饲喂，或者可在饲喂之前进行干燥，或者可以不预先收集而使动物在所 述植物上进食。本发明还涉及将收集的植物组织作为动物饲料的食物补充 剂。如果向动物饲喂的植物组织不进行或几乎不进行进一步处理的话，则 优选所施用的植物组织是可食用的。

转录后基因沉默(PTGS)可参与限制转基因在植物中的表达，来自 马铃薯Y病毒的沉默抑制子(HcPro)的共表达可用于抵抗转基因mRNA 的特异性降解(Brigneti等，1998)。可替代的沉默抑制子是本领域熟知的 并且可如本文所述使用(Chiba等，2006，Virology346：7-14，其通过引用并 入本文)，例如但不限于TEV-p1/HC-Pro(烟草蚀纹病毒-p1/HC-Pro)、 BYV-p21、番茄丛矮病毒的p19(TBSV p19)、番茄皱缩病毒的衣壳蛋白 (TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯X病毒的p25 (PVX-p25)、马铃薯M病毒的p11(PVM-p11)、马铃薯S病毒的p11 (PVS-p11)、蓝莓枯黄病毒的p16(BScV-p16)、柑橘衰退病毒(Citrus  tristexa virus)的p23(CTV-p23)、葡萄卷叶相关病毒-2的p24(GLRaV-2 p24)、葡萄病毒A的p10(GVA-p10)、葡萄病毒B的p14(GVB-p14)、 白芷潜伏性病毒(Heracleum latent virus)的p10(HLV-p10)或大蒜普通 潜伏性病毒的p16(GCLV-p16)。因此，沉默抑制子(例如但不限于HcPro、 TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、 PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、 HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10)可与编码目的蛋白的核酸序列共表达 以进一步确保在植物中生产高水平蛋白质。

此外，可生产含有多种HA亚型之组合的VLP。例如，VLP可包含 来自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、 H14、H15、H16亚型、B型或其组合的一种或多种HA。HA组合的选择 可由VLP制得之疫苗的目的用途来确定。例如，用于接种鸟的疫苗可包含 HA亚型的任意组合，而用于接种人的VLP可包含H1、H2、H3、H5、 H6、H7、H9亚型或B型的一种或多种亚型。然而，根据VLP的用途， 也可制备其它的HA亚型组合。为了生产含有HA亚型组合的VLP，可将 期望的HA亚型在同一细胞(例如植物细胞)中共表达。

此外，如本文所述生产的VLP不包含神经氨酸酶(NA)。然而，如 果含有HA和NA的VLP是所期望，则可将NA与HA共表达。

此外，本发明还包括合适的载体，其含有适用于稳定或瞬时表达系 统中的嵌合构建体。所述遗传信息还可提供在一种或多种构建体中。例如， 可将编码目的蛋白的核苷酸序列引入一种构建体中，可将编码修饰目的蛋 白糖基化之蛋白质的第二核苷酸序列引入单独的构建体中。然后，可将这 些核苷酸序列在植物中共表达。然而，也可使用包含编码目的蛋白和修饰 目的蛋白糖基化之蛋白质的核苷酸序列的构建体。在此情形中，所述核苷 酸序列将包含第一序列和第二序列，所述第一序列包含与启动子或调控区 有效连接的编码目的蛋白的第一核酸序列，所述第二序列包含与启动子或 调控区有效连接的编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的第二核酸序列。

“共表达”意指两种或两种以上核苷酸序列大致同时在植物中以及在 植物的同一组织中表达。然而，所述核苷酸序列不必严格地同时表达。而 是说，所述两种或更多种核苷酸序列的表达使得所编码产物有机会相互作 用。例如，所述修饰目的蛋白糖基化的蛋白质可在目的蛋白表达前或表达 期间表达，以允许发生对目的蛋白的糖基化修饰。可使用瞬时表达系统共 表达两种或两种以上的核苷酸序列，其中所述两种或更多种序列大致同 时在适于这两种序列表达的条件下被导入植物中。或者，可以用所述核 苷酸序列之一(例如，编码目的蛋白的序列)以瞬时或稳定方式转化含 有编码修饰所述目的蛋白糖基化之蛋白质的序列的平台植物(platform  plant)。在此情形中，编码修饰目的蛋白糖基化之蛋白质的序列可在期 望的发育阶段表达在期望的组织内，或者可使用诱导型启动子诱导其表 达，而编码目的蛋白的其它序列可在相似条件下在同一组织内表达，以 确保所述核苷酸序列的共表达。

可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注 射、电穿孔、渗入等将本发明的构建体导入植物细胞中。这些技术的综述 参见例如Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology， Academy Press，纽约VIII，421-463页(1988)；Geierson和Corey，Plant  Molecular Biology，第2版(1988)以及Miki和Iyer，Fundamentals of GeneTransfer in Plants.Plant Metabolism，第2版，DT.Dennis，DH Turpin，DD  Lefebrve，DB Layzell(编)，Addison Wesly，Langmans Ltd.London， 561-579页(1997)。其它的方法包括直接DNA摄入、使用脂质体、电穿孔 (例如使用原生质体)、显微注射、微弹(microprojectile)或whisker以 及真空渗入。参见例如Bilang等(Gene100：247-250(1991))、Scheid等 (Mol.Gen.Genet.228：104-112，1991)、Guerche等(Plant Science52： 111-116，1987)、Neuhause等(Theor.Appl Genet.75：30-36，1987)、Klein 等，Nature327：70-73(1987)、Howell等(Science208：1265，1980)、Horsch 等(Science227：1229-1231，1985)、DeBlock等，Plant Physiology91： 694-701，1989)，Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach和 Weissbach编，Academic Press Inc.，1988)、Methods in Plant Molecular  Biology(Schuler和Zielinski编，Academic Press Inc.，1989)、Liu和 Lomonossoff(J.Virol Meth，105：343-348，2002)；美国专利No.4,945,050； 5,036,006；5,100,792；6,403,865；5,625,136)(所有这些文献均通过引用并入 本文)。

可使用瞬时表达法表达本发明的构建体(参见Liu和Lomonossoff， 2002，Journal of Virological Methods，105：343-348，其通过引用并入本文)。 或者，可使用基于真空的瞬时表达法，如Kapila等1997(其通过引用并 入本文)所述。这些方法可包括例如但不限于农杆菌接种法或农杆菌渗入 法，然而，也可使用其它瞬时方法，如上文所述。使用农杆菌接种法或农 杆菌渗入法时，含有期望核酸的农杆菌混合物进入组织(例如叶)的细胞 间隙、植物的地上部分(包括茎、叶和花)、植物的其它部分(茎、根、 花)或整个植株中。穿过表皮后，所述农杆菌感染细胞并将t-DNA拷贝移 至细胞中。所述t-DNA以附加体形式转录并且其mRNA被翻译，导致在 感染细胞中产生目的蛋白，然而，t-DNA在细胞核内的这种传递是瞬时的。

如果目的核苷酸序列编码的产物对所述植物具有直接或间接的毒 性，则通过使用本发明的方法可降低对整株植物的毒性，其通过在期望的 组织中或者在期望的植物发育阶段中选择性表达目的核苷酸序列来实现。 此外，当在植物中制备毒性产物时，由瞬时表达导致的有限表达时间也可 降低所述作用。可使用诱导型启动子、组织特异性启动子或细胞特异性启 动子来选择性指导目的序列的表达。

本发明VLP的重组HA可与现有的流感病毒疫苗组合使用，以补充 所述疫苗，使它们更加有效，以及降低所需的施用剂量。如本领域技术人 员所公知地，疫苗可针对一种或多种流感病毒。合适的疫苗的实例包括但 不限于Sanofi-Pasteur、ID Biomedical、Merial、Sinovac、Chiron、Roche、 MedImmune、GlaxoSmithKline、Novartis、Sanofi-Aventis、Serono、Shire  Pharmaceuticals等市售的疫苗。

需要时，可将本发明的VLP与本领域技术人员公知的合适佐剂混 合。此外，VLP可用于疫苗组合物中，其含有用于治疗靶标生物的有效剂 量VLP，如上文所述。此外，根据本发明生产的VLP可与使用不同流感 病毒蛋白质(例如神经氨酸酶(NA))得到的VLP相组合。

因此，本发明提供了用于诱导动物或靶标生物中针对流感病毒感染 之免疫的方法，其包括施用有效剂量的疫苗，所述疫苗含有一种或多种 VLP。所述疫苗可经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用。

根据本发明生产的VLP的施用描述于实施例6中。与施用可溶性 HA相比，施用由植物生产的H5VLP产生显著更高的应答(参见图21A 和21B)。

如图26A和26B所示，施用A/印度尼西亚/5/05H5VLP的对象产生 了针对流感病毒A/土耳其/582/06(H5N1；“土耳其H5N1”)攻击的交叉 保护。在攻击之前施用印度尼西亚H5VLP不导致体重的任何减轻。然而， 未施用H5VLP但用土耳其H5N1攻击的对象表现出显著的体重减轻，并 且有几只对象死亡。

因此，这些数据表明由植物生产的含有H5血凝素病毒蛋白的流感 病毒VLP诱导特异性针对病原性流感毒株的免疫应答，并且该病毒样颗粒 可从植物质膜出芽。

因此，本发明提供了包含含有流感病毒HA蛋白的有效剂量VLP、 一种或多种植物脂质以及可药用载体的组合物。所述流感病毒HA蛋白可 以是H5印度尼西亚/5/2006、A/布里斯班50/2007、A/所罗门群岛3/2006、 A/布里斯班10/2007、A/威斯康星/67/2005、B/马来西亚/2506/2005、B/佛罗 里达/4/2006、A/新加坡/1/57、A/安徽/1/2005、A/越南/1194/2004、A/水鸭/ 香港/W312/97、A/马/布拉格/56或A/香港/1073/99。还提供了诱导对象中 针对流感病毒感染之免疫的方法。该方法包括施用含有流感病毒HA蛋白 的病毒样颗粒、一种或多种的植物脂质以及可药用载体。所述病毒样颗粒 可经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮下施用给对象。

本发明多个实施方案的组合物可包含两种或更多种流感毒株或亚型 的VLP。“两种或更多种”是指两种、三种、四种、五种、六种、七种、八 种、九种、十种或更多种毒株或亚型。所示毒株或亚型可以是单一亚型(例 如，所有都为H1N1，或所有都为H5N1)，或者可以是亚型的组合。示例 性的亚型和毒株包括但不限于本文所述的那些，例如A/新喀里多尼亚 /20/99(H1N1)、A/印度尼西亚/5/2006(H5N1)、A/鸡/纽约/1995、A/银鸥 /DE/677/88(H2N8)、A/得克萨斯/32/2003、A/绿头鸭/MN/33/00、A/鸭/上 海/1/2000、A/针尾鸭/TX/828189/02、A/火鸡/安大略/6118/68(H8N4)、A/ 琵嘴鸭/伊朗/G54/03、A/鸡/德国/N/1949(H10N7)、A/鸭/英格兰/56 (H11N6)、A/鸭/阿尔伯达/60/76(H12N5)、A/鸥/马里兰/704/77(H13N6)、 A/绿头鸭/Gurjev/263/82、A/鸭/澳大利亚/341/83(H15N8)、A/红嘴鸥/瑞典 /5/99(H16N3)、B/Lee/40、C/约翰内斯堡/66、A/波多黎各/8/34(H1N1)、 A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/所罗门群岛3/2006(H1N1)、A/布里斯 班10/2007(H3N2)、A/威斯康星/67/2005(H3N2)、B/马来西亚/2506/2004、 B/佛罗里达/4/2006、A/新加坡/1/57(H2N2)、A/安徽/1/2005(H5N1)、A/ 越南/1194/2004(H5N1)、A/水鸭/香港/W312/97(H6N1)、A/马/布拉格/56 (H7N7)、A/香港/1073/99(H9N2)。

对毒株和亚型之组合的选择可取决于可能暴露于流感病毒之对象的 地区；动物物种(例如水禽类、农业动物(例如猪)等)与待免疫人群的 接近程度以及所述动物物种携带、暴露或可能暴露的毒株；对亚型或毒株 内抗原漂移的预测；或者这些因素的组合。过去几年所使用的组合的实例 可见于URL：who.int/csr/dieease/influenza/vaccine recommendations1/en。 可将这些毒株中的某些或全部应用于所示组合中，或产生疫苗组合物的其 它组合中。

更特别地，示例性组合可包括来自两种或更多种选自以下的毒株或 亚型的VLP：A/布里斯班/59/2007(H1N1)、A/布里斯班/59/2007(H1N1) 样病毒、A/布里斯班/10/2007(H3N2)、A/布里斯班/10/2007(H3N2)样 病毒、B/佛罗里达/4/2006或B/佛罗里达/4/2006样病毒。

另一示例性组合可包括来自两种或更多种选自以下的毒株或亚型的 VLP：A/印度尼西亚/5/2005、A/印度尼西亚/5/2005样病毒、A/越南 /1194/2004、A/越南/1194/2004样病毒、A/安徽/1/05、A/安徽/1/05样病毒、 A/鹅/贵阳/337/2006、A/鹅/最阳/337/2006样病毒、A/鸡/山西/2/2006或A/ 鸡/山西/2/2006样病毒。

另一示例性组合可包括A/鸡/意大利/13474/99(H7型)或A/鸡/英属 哥伦比亚省/04(H7N3)流感毒株的VLP。

另一示例性组合可包括A/鸡/香港/G9/97或A/香港/1073/99的VLP。 另一示例性组合可包括A/所罗门群岛/3/2006的VLP。另一示例性组合可 包括A/布里斯班/10/2007的VLP。另一示例性组合可包括A/威斯康星 /67/2005的VLP。另一示例性组合可包括B/马来西亚/2506/2004、B/佛罗 里达/4/2006或B/布里斯班/3/2007毒株或亚型的VLP。

所述两种或更多种VLP可单独表达，随后将纯化的或半纯化的VLP 相组合。或者，VLP可在同一宿主(例如植物)中共表达。VLP可以期望 的比例(例如大致相等的比例)组合或生产，或者可以组合以使一种亚型 或毒株占组合物中VLP的大部分。

因此，本发明提供了包含两种或更多种毒株或亚型之VLP的组合 物。

包膜病毒的VLP通常从它们出芽时所穿过的膜获得它们的包膜。植 物质膜具有可具有免疫刺激作用的植物固醇成分。为了研究该可能性，在 存在或不存在佐剂的情形下将由植物生产的H5VLP施用给动物并测定 HAI(血细胞凝集抑制抗体反应)(图22A、22B)。在未添加佐剂的情形 中，由植物产生的H5VLP表现出显著的HAI，这表示对施用抗原的全身 免疫应答。此外，在存在或不存在佐剂的情形中，所施用VLP的抗体同种 型谱相似(图23A)。

表5列出了本发明多个实施方案中提供的序列。

表5：针对序列标识的序列描述

本发明将通过仅参考下述非限制性实施例的方式进行详述。

方法和材料

1.针对天然HA的基于质体蓝素的表达盒的组装

使用Sambrook和Russell(2001；其通过参考并入本文)的一般分 子生物学操作方法完成所有操作。第一个克隆步骤是组装受体质粒，其包 含苜蓿质体蓝素基因的上游和下游调控元件。使用寡核苷酸引物 XmaI-pPlas.c(SEQ ID NO：29；图10Q)和SacI-ATG-pPlas.r(SEQ ID NO： 30；图10R)从苜蓿基因组DNA中扩增质体蓝素启动子和5’UTR序列。 所得扩增产物用XmaI和SacI消化并与预先用同样的酶进行消化的 pCAMBIA2300(Cambia，Canberra，Australia)连接以形成 pCAMBIApromoPlasto。类似地，使用引物SacI-PlasTer.c(SEQ ID NO：31； 图10S)和EcoRI-PlasTer.r(SEQ ID NO：32；图10T)从苜蓿基因组DNA 中扩增质体蓝素基因的3’UTR序列和终止子，所得产物用SacI和EcoRI 消化，然后插入到pCAMBIApromoPlasto的同样位点中以形成 pCAMBIAPlasto。

利用Epoch Biolabs(Sugar Land，TX，USA)合成编码流感毒株A/ 印度尼西亚/5/05(H5N1；登录号LANL ISDN125873)之血凝素的片段。 所产生的片段示于SEQ ID NO：3(图6)中，其包含H5全长编码区，所 述全长编码区包含天然信号肽，其侧翼为紧邻起始ATG上游的HindIII 位点以及紧邻终止密码子(TAA)下游的SacI位点。通过Darveau等(1995) 中所示的基于PCR的连接方法将H5编码区克隆到基于质体蓝素的表达盒 中。简言之，使用引物Plato-443c(SEQ ID NO：4；图7A)和 SpHA(Ind)-Plasto.r(SEQ ID NO：5；图7B)，以pCAMBIA promoPlasto 作为模板进行第一次PCR扩增。平行地，使用引物Plasto-SpHA(Ind).c (SEQ ID NO：6；图7C)和HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO：7；图7D)，以 H5编码片段作为模板进行第二次扩增。将由上述两个反应得到的扩增物 混合，将所得混合物作为模板，使用Plato-443c(SEQ ID NO：4；图7A) 和HA(Ind)-Sac.r(SEQ ID NO：7；图7D)作为引物进行第三次反应(组 装反应)。用BamHI(在质体蓝素启动子中)和SacI(在所述片段的3’端) 消化所得片段并将其克隆到先前用同样的酶进行消化的pCAMBIAPlasto 中。所得质粒称为660，其示于图2B中(还参见图11)。

774#至785#血凝素表达盒如下组装。所合成的合成片段包含3′侧 翼为苜蓿质体蓝素基因序列(对应于质体蓝素ATG上游前的84个核苷酸， 并以DraIII限制性位点结束)全长血凝素编码序列(从ATG至终止子)。 所述合成片段还包含紧邻终止密码子之后的SacI位点。

合成的血凝素片段通过Top Gene Technologies(Montreal，QC， Canada)和Epoch Biolabs(Sugar Land，TX，USA)来合成。所合成的片 段示于图28至39中，并对应于SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：47。为了 组装全长表达盒，用DraIII和SacI消化合成片段，并克隆至预先用同样 的酶消化的pCAMBIAPlasto中。表6示出用相应的HA得到的盒以及文 中的其它参考。

表6：从DraIII-SacI合成片段组装的血凝素表达盒

基于质体蓝素的PDISP/HA融合表达盒的组装

H1A/新喀里多尼亚/20/99(构建体#540)

将流感毒株A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)之H1基因的开放阅读 框作为两个片段来合成(Plant Biotechnology Institute，National Research  Council，Saskatoon，Canada)。所合成的第一片段对应于缺少了5’端信号 肽编码序列和3’端跨膜结构域编码序列的野生型H1编码序列(GenBank 登录号AY289929；SEQ ID NO：33；图16)。将BglII限制性位点添加在编 码序列的5’端，将SacI/StuI双位点添加在紧邻该片段3’端终止密码子下 游，得到SEQ ID NO：1(图5A)。还合成了编码H1蛋白C端(包含跨膜 结构域和胞质尾)的第二片段，其从KpnI位点至终止密码子，并且其3’ 侧翼是SacI/StuI限制性位点(SEQ ID NO.2；图5B)。

所述第一H1片段用BglII和SacI消化，并克隆到含有质体蓝素启 动子和5’UTR之二元载体(pCAMBIAPlasto)的同样位点中，并与苜蓿 蛋白质二硫键异构酶(PDI)基因(32-103位核苷酸；登录号Z11499；SEQ  ID NO：34；图17)的信号肽融合得到PDI-H1嵌合基因，该嵌合基因位于 质体蓝素调控元件的下游。含有PDI信号肽的基于质体蓝素的盒序列示于 图1中(SEQ ID NO：8)。所得质粒包含与PDI信号肽融合的H1编码区， 并且侧翼为质体蓝素调控元件。通过将预先用KpnI和SacI消化的合成片 段(SEQ ID NO：2；图5B)插入到H1表达质粒中来添加C端编码区(编 码跨膜结构域和胞质尾)。所得质粒称为540，其示于图11中(还参见图 2A)。

H5A/印度尼西亚/5/2005(构建体#663)

如下将苜蓿蛋白质二硫键异构酶(PDISP)的信号肽(32-103位核 苷酸；登录号Z11499；SEQ ID NO：34；图17)与来自A/印度尼西亚/5/2005 之H5的HA0编码序列连接。使用构建体#660(SEQ ID NO：60；图51) 作为模板，用引物SpPDI-HA(Ind).c(SEQ ID NO：82)和HA(Ind)-SacI.r (SEQ ID NO：7；图7D)扩增H5编码序列。所得片段是5′侧翼为编码 PDISP之最后几位核苷酸(包括BglII限制性位点)而3′侧翼为SacI限制 性位点的H5编码序列。用BglII和SacI消化所述片段，并克隆至预先用 同样的限制性酶消化的构建体#540(SEQ ID NO：61；图52)中。最终的 盒(称为“构建体#663(SEQ ID NO：83))示于图69中。

H1A/布里斯班/59/2007(构建体787)

如下将苜蓿蛋白质二硫键异构酶(PDISP)的信号肽(32-103位核 苷酸；登录号Z11499；SEQ ID NO：34；图17)与来自A/布里斯班/59/2007 之H1的HA0编码序列连接。使用构建体774(SEQ ID NO：62；图53) 作为模板，用引物SpPDI-H1B.c(SEQ ID NO：84)和SacI-H1B.r(SEO ID  NO：85)扩增H1编码序列。所得片段是5′侧翼为编码PDISP之最后几位 核苷酸(包括BglII限制性位点)而3′侧翼为SacI限制性位点的H1编码 序列。用BglII和SacI消化所述片段，并克隆至预先用同样的限制性酶消 化的构建体#540(SEQ ID NO：61；图52)中。最终的盒(称为“构建体 #787(SEQ ID NO：86))示于图70中。

H3A/布里斯班/10/2007(构建体#790)

如下将苜蓿蛋白质二硫键异构酶(PDISP)的信号肽(32-103位核 苷酸；登录号Z11499；SEQ ID NO：34；图17)与来自A/布里斯班/10/2007 之H3的HA0编码序列连接。通过基于PCR的连接方法(DarVeau等， Methods in Neuroscience26：77-85(1995))将PDISP与H3编码序列连接。 在第一轮PCR中，使用构建体540(SEQ ID NO：61；图52)作为模板， 用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：4；图7A)和H3B-SpPDI.r(SEQ ID  NO：87)扩增与PDISP融合的质体蓝素启动子区段。平行地，使用构建体 776(SEQ ID NO：69；图60)作为模板，用引物SpPDI-H3B.c(SEQ ID  NO：88)和H3(A-Bri).982r(SEQ ID NO：89)扩增含有H3A/布里斯班 /10/2007(从密码子17至SpeI限制性位点)之一部分的另一片段。然后， 混合扩增产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：4；图7A)和 H3(A-Bri).982r(SEQ ID NO：89)之第二轮扩增(组装反应)的模板。所 得片段用BamHI(在质体蓝素启动子中)和SpeI(在H3编码序列中)消 化，并克隆至预先用同样的限制性酶消化的构建体#776(SEQ ID NO：69； 图60)中，得到构建体#790(SEQ ID NO：90)。该构建体示于图71中。 HA B/佛罗里达/4/2006(构建体#798)

通过基于PCR的连接方法(Darveau等，Methods in Neuroscience26： 77-85(1995))，将苜蓿蛋白质二硫键异构酶(PDISP)的信号肽(32-103 位核苷酸；登录号Z11499；SEQ ID NO：34；图17)与来自B/佛罗里达 /4/2006之HA的HA0编码序列连接。在第一轮扩增中，使用构建体#540 (SEQ ID NO：61；图52)作为模板，用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：4； 图7A)和HBF-SpPDI.r(SEQ ID NO：91)扩增与PDISP融合的质体蓝素 启动子部分。平行地，使用构建体#779(SEQ ID NO：73；图64)作为模 板，用引物SpPDI-HBF.c(SEQ ID NO：92)和Plaster80r(SEQ ID NO：93) 扩增含有与质体蓝素终止子融合之HB B/佛罗里达编码序列的一部分的另 一片段。然后，混合PCR产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO： 4；图7A)和Plaster80r(SEQ ID NO：93)之第二轮扩增(组装反应)的 模板。所得片段用BamHI(在质体蓝素启动子中)和AflII(在HA B/佛 罗里达/4/2006编码序列中)消化，并克隆至预先用同样的限制性酶消化的 构建体#779(SEQ ID NO：73；图64)中，得到构建体#798(SEQ ID  NO：94)。所得表达盒示于图72中。

基于CPMV-HT之表达盒的组装

CPMV-HT表达盒使用35S启动子来控制包含目的编码序列之 mRNA的表达，所述目的编码序列的5′侧翼为来自豇豆花叶病毒(CPMV) RNA2的1-512位核苷酸(其在115和161位具有突变的ATG)并且3′ 侧翼为来自CPMV RNA2的3330-3481位核苷酸(对应于3′UTR)和其 后的NOS终止子。使用质粒pBD-C5-1LC(Sainsbury等，2008；Plant  Biotechnology Journal6：82-92以及PCT公开WO2007/135480)来组装 基于CPMV-HT的血凝素表达盒。使用基于PCR的连接方法(Darveau 等，Methods in Neuroscience26：77-85(1995))实现CPMV RNA2第115 和161位ATG的突变。使用pBD-C5-1LC作为模板进行两个单独的PCR。 用于第一扩增的引物是pBinPlus.2613c(SEQ ID NO：77)和Mut-ATG115.r (SEQ ID NO：78)。用于第二扩增的引物是Mut-ATG161.c(SEQ ID NO： 79)和LC-C5-1.110r(SEQ ID NO：80)。然后，将获得的两片段混合， 并用作使用引物pBinPlus.2613c(SEQ ID NO：77)和LC-C5-1.110r(SEQ  ID NO：80)之第三扩增的模板。所得片段用PacI和ApaI消化，并克隆 至用同样的酶消化的pBD-C5-1LC中。所得到的表达盒序列(称为828) 示于图68中(SEQ ID NO：81)。

将SpPDI-H1A/新喀里多尼亚/20/99组装进CPMV-HT表达盒(构建体# 580)

如下将编码苜蓿PDI信号肽的序列与来自A/新喀里多尼亚/20/99之 H1的HA0融合，并克隆至CPMV-HT中。通过使用构建体#540(SEQ ID  NO：61；图52)作为模板，用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：95)和 StuI-H1(A-NC).r(SEQ ID NO：96)进行PCR扩增，从而将限制性位点 ApaI(紧邻初始ATG上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至血凝 素编码序列中。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样 的酶消化的构建体#828(SEQ ID NO：81)中。所得的盒称为“构建体# 580”(SEQ ID NO：97)。

将H5A/印度尼西亚/5/2005组装进CPMV-HT表达盒(构建体#685)

如下将来自A/印度尼西亚/5/2005之H5的编码序列克隆进 CPMV-HT中。通过使用构建体#660(SEQ ID NO：60；图51)作为模板， 用引物ApaI-H5(A-Indo).1c(SEQ ID NO：98)和H5(A-Indo)-StuI.1707r (SEQ ID NO：99)进行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG 上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片 段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体#828 (SEQ ID NO：81)中。所得的盒称为“构建体#685”(SEQ ID NO：100)。 将SpPDI-H5A/印度尼西亚/5/2005组装进CPMV-HT表达盒(构建体# 686)

如下将编码苜蓿PDI信号肽的序列与来自A/印度尼西亚/5/2005之 H5的HA0融合，并克隆至CPMV-HT中。通过使用构建体#663(SEQ ID  NO：83)作为模板，用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：95)和H5 (A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO：99)进行PCR扩增，从而将限制性位 点ApaI(紧邻ATG上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至血凝素 编码序列中。所得片段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的 酶消化的构建体#828(SEQ ID NO：81)中。所得的盒称为“构建体#686” (SEQ ID NO：101)。

将H1A/布里斯班/59/2007组装进CPMV-HT表达盒(构建体#732)

如下将来自A/布里斯班/59/2007之H1的HA的编码序列克隆进 CPMV-HT中。通过使用构建体#774(SEQ ID NO：62；图53)作为模板， 用引物ApaI-H1B.c(SEQ ID NO：102)和StuI-H1B.r(SEQ ID NO：103) 进行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG上游)和StuI(紧 邻终止密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片段用ApaI和StuI 限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体#828(SEQ ID NO：81) 中。所得的盒称为“构建体#732”(SEQ ID NO：104)。

将SpPDI-H1A/布里斯班/59/2007组装进CPMV-HT表达盒(构建体#733)

如下将编码苜蓿PDI信号肽的序列与来自A/布里斯班/59/2007之 H1的HA0融合，并克隆至CPMV-HT中。通过使用构建体#787(SEQ ID  NO：86)作为模板，用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：95)和StuI-H1B.r (SEQ ID NO：103)进行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG 上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片 段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体#828 (SEQ ID NO：81)中。所得的盒称为“构建体#733”(SEQ ID NO：105)。 将H3A/布里斯班/10/2007组装进CPMV-HT表达盒(构建体#735)

如下将来自A/布里斯班/10/2007之H3的HA编码序列克隆进 CPMV-HT中。通过使用构建体#776(SEQ ID NO：69)作为模板，用引 物ApaI-H3B.c(SEQ ID NO：106)和StuI-H3B.r(SEQ ID NO：107)进 行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG上游)和StuI(紧邻 终止密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片段用ApaI和StuI限 制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体#828(SEQ ID NO：81) 中。所得的盒称为“构建体#735”(SEQ ID NO：108)。

将SpPDI-H3A/布里斯班/10/2007组装进CPMV-HT表达盒(构建体#736)

如下将编码苜蓿PDI信号肽的序列与来自A/布里斯班/10/2007之 H3的HA0融合，并克隆至CPMV-HT中。通过使用构建体#790(SEQ ID  NO：90)作为模板，用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：95)和StuI-H3B.r (SEQ ID NO：107)进行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG 上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片 段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体#828 (SEQ ID NO：81)中。所得的盒称为“构建体#736”(SEQ ID NO：109)。 将HA B/佛罗里达/4/2006组装进CPMW-HT表达盒(构建体#738)

如下将来自B/佛罗里达/4/2006的HA编码序列克隆进CPMV-HT 中。通过使用构建体#779(SEQ ID NO：73；图64)作为模板，用引物 ApaI-HBF.c(SEQ ID NO：110)和StuI-HBF.r(SEQ ID NO：111)进行 PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG上游)和StuI(紧邻终止 密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片段用ApaI和StuI限制性 酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体#828(SEQ ID NO：81)中。 所得的盒称为“构建体#738”(SEQ ID NO：112)。

将SpPDI-HA B/佛罗里达/4/2006组装进CPMV-HT表达盒（构建体#739)

如下将编码苜蓿PDI信号肽的序列与来自B/佛罗里达/4/2006的 HA0融合，并克隆至CPMV-HT中。通过使用构建体#798(SEQ ID  NO：94)作为模板，用引物ApaI-SpPDI.c(SEQ ID NO：95)和StuI-HBF.r (SEQ ID NO：111)进行PCR扩增，从而将限制性位点ApaI(紧邻ATG 上游)和StuI(紧邻终止密码子下游)添加至血凝素编码序列中。所得片 段用ApaI和StuI限制性酶消化，并克隆至用同样的酶消化的构建体#828 (SEQ ID NO：81)中。所得的盒称为“构建体#739”(SEQ ID NO：113)。

组装伴侣蛋白表达盒

组装了两种热休克蛋白(Hsp)表达盒。在第一种盒中，拟南芥(哥 伦比亚生态型)胞质HSP70(在Lin等(2001)Cell Stress and Chaperones6： 201-208中的“Athsp70-1”)的表达受到苜蓿亚硝酸还原酶(Nir)和苜蓿 质体蓝素启动子的嵌合启动子组合元件(Nir/Plasto)的控制。还组装了第 二种盒，其包含嵌合Nir/Plasto启动子控制下的苜蓿胞质HSP40(MsJ1； Frugis等(1999)Plant Molecular Biology40：397-408)编码区。

首先，组装在植物二元载体中含有苜蓿亚硝酸还原酶(Nir)、GUS 报告基因和NOS终止子的接纳质粒(acceptor plasmid)。用HindIII和 EcoRI消化质粒pNir3K51(先前描述于美国专利No.6,420,548中)。将 所得片段克隆进用同样的限制性酶消化的pCAMBIA2300(Cambia， Canberra，Australia)中，得到pCAMBIA-Nir3K51。

通过基于PCR的连接方法(Darveau等，Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))，将Hsp70和Hsp40的编码序列分别克隆进接纳质粒 pCAMBIANir3K51中。

对于Hsρ40而言，通过RT-PCR从苜蓿(Rangelander生态型)叶 总RNA中扩增Msj1编码序列(SEQ ID NO：114)，其使用引物 Hsp40Luz.1c(SEQ ID NO：115)和Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO： 116)。使用构建体660(SEQ ID NO：60；图51)作为模板，用引物Plasto-443c (SEQ ID NO：4；图7A)和Hsρ40Luz-Plasto.r(SEQ ID NO：117)进行第二 扩增。然后混合PCR产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：4；图 7A)和Hsp40Luz-SacI.1272r(SEQ ID NO：116)之第三扩增(组装反应)的 模板。所得片段用HpaI(在质体蓝素启动子中)消化，并克隆进预先用 HpaI(在Nir启动子中)和SacI消化并用T4DNA聚合酶产生平末端的 pCAMBIANir3K51中。对所得克隆筛选正确取向，并测序以检验序列完 整性。所得质粒(称为R850)示于图83中(SEQ ID NO：121)。使用引物 Hsp70Ara.1c(SEQ ID NO：118)和Hsp70Ara-SacI.1956r(SEQ ID NO： 119)，通过RT-PCR从拟南芥叶RNA中扩增Athsp70-1的编码区。使用 构建体660(SEQ ID NO：60；图51)作为模板，用引物Plato-443c(SEQ ID  NO：4；图7A)和Hsp70Ara-Plasto.r(SEQ ID NO：120)进行第二扩增。然 后混合PCR产物，并作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：4；图7A)和 Hsp70ARA-SacI.1956r(SEQ ID NO：119)之第三扩增(组装反应)的模板。 所得片段用HpaI(在质体蓝素启动子中)消化，并克隆进用HpaI(在Nir 启动子中)和SacI消化并用T4DNA聚合酶产生平末端的 pCAMBIANir3K51中。对所得克隆筛选正确取向，并测序以检验序列完 整性。所得质粒(称为R860)示于图84中(SEQ ID NO：122)。

如下组装双Hsp表达质粒。R860用BsrBI(NOS终止子下游)消 化，用T4DNA聚合酶处理以产生平末端，并用SbfI(嵌合NIR/Plasto启 动子的上游)消化。将所得片段(嵌合Nir/Plasto启动子-HSP70编码序列 -Nos终止子)克隆进预先用SbfI和SmaI(均位于嵌合Nir/Plasto启动子 上游的多克隆位点中)消化的R850中。所得质粒(称为“R870”)示于 图85中(SEQ ID NO：123)。

组装另一些表达盒

可溶性H1表达盒

通过用编码亮氨酸拉链GCN4pII变体的片段替换编码540中跨膜 结构域和胞质尾的区域来制备编码可溶形式H1的盒(Harbury等，1993， Science1993；262：1401-1407)。将该片段合成成侧翼具有KpnI和SacI位 点以促进克隆。由该替换得到的质粒称为544，该表达盒示于图11中。

M1A/波多黎各/8/34表达盒

合成马铃薯蚀纹病毒(TEV)5’UTR与流感病毒A/PR/8/34M1基 因(登录号NC_002016)开放阅读框的融合蛋白，其在终止密码子下游加 入了侧翼SacI位点。该片段用SwaI(在TEV5’UTR中)和SacI消化， 并克隆到pCAMBIA二元质粒中基于2X35S/TEV的表达盒中。所得质粒 具有受控于2X35S/TEV启动子的M1编码区和5’UTR以及NOS终止子 (构建体750；图11)。

HcPro表达盒

如Hamilton等(2002)所述制备HcPro构建体(35HcPro)。对所 有克隆进行测序以证实构建体的完整性。所述质粒用于通过电穿孔转化根 瘤农杆菌(AGL1；ATCC，Manassas，VA20108，USA)(Mattanovich等， 1989)。通过限制性酶切图谱证实所有根瘤农杆菌株的完整性。

P19表达盒

通过基于PCR的连接方法(Darveau等，Methods in Neuroscience26： 77-85(1995))，将番茄丛矮病毒(tomato bushy stunt virus，TBSV)之p19 蛋白的编码序列与苜蓿质体蓝素表达盒连接。在第一轮PCR中，使用构 建体660(SEQ ID NO：60；图51)作为模板，用引物Plasto-443c(SEQ ID  NO：4；图7A)和supP19-plasto.r(SEQ ID NO：124)扩增质体蓝素启动子的 一个区段。平行地，使用构建体35S：p19(如Voinnet等，The Plant Journal  33：949-956(2003)所述)作为模板，用引物supP19-1c(SEQ ID NO：125) 和SupP19-SacI.r(SEQ ID NO：126)扩增含有p19编码序列的另一片段。 然后混合扩增产物，并用作使用引物Plasto-443c(SEQ ID NO：4；图7A) 和SupP19-SacI.r(SEQ ID NO：126)之第二轮扩增(组装反应)的模板。 所得片段用BamHI(在质体蓝素启动子中)和SacI(在p19编码序列结 尾处)消化，并克隆进预先用同样的限制性酶消化的构建体#660(SEQ ID  NO：60；图51)中，得到构建体#R472。质粒R472示于图86中。

3.植物生物质的准备、接种、农杆菌渗入和收获

在填装市售的泥炭基质的平地中用种子培养本塞姆氏烟草或普通烟 草(Nicotiana tabacum)。使植物生长在温室中，16/8光照周期，温度采用 白天25℃/晚上20℃。播种3周后，挑出各株幼苗，移栽到盆中，并在同 样的环境条件下在温室中再生长3周。转化前，在不同时间通过掐掉植物 的芽或通过化学处理植物而除去顶芽和腋芽。

在补充有10mM2-[N-吗啉]乙磺酸(MES)、20μM乙酰丁香酮、 50μg/ml卡那霉素和25μg/ml羧苄青霉素的YEB培养基(pH5.6)中培 养用每种构建体转染的农杆菌，直至其OD₆₀₀为0.6～1.6。使用前将农杆 菌混悬液离心并重悬在渗入培养基(10mM MgCl₂和10mM MES，pH5.6) 中。如Liu和Lomonossoff(2002，Journal of Virological Methods， 105：343-348)所述进行注射器渗入。对于真空渗入而言，将根瘤农杆菌混 悬液离心，重悬在渗入培养基中，并储存在4℃过夜。在渗入当天，将分 批培养物稀释成2.5倍培养物体积并在使用前温热。在20-40托真空下， 使本塞姆氏烟草或普通烟草的整个植株倒置于气密性不锈钢罐中的细菌 混悬液中2分钟。注射器或真空渗入后，将植株移回温室中培养4-5天直 至收获。除非另有指明，否则所有渗入均通过与AGL1/35S-HcPro以1∶1 共渗入来进行，具有CPMV-HT盒的毒株除外(其与毒株AGL1/R472以 1∶1共渗入)。

4.叶片取样和总蛋白质提取

培养后，收获植株的地上部分，冷冻在-80℃，进行破碎。通过将每 个冷冻破碎植物材料的样品在3倍体积的冷的50mM Tris(pH7.4)、0.15 M NaCl和1mM苯甲基磺酰氟中匀浆(Polytron)来提取总的可溶性蛋白 质。匀浆后，于4℃下以20,000g对浆液离心20分钟，将这些澄清的粗提 物(上清)用于分析。使用牛血清白蛋白作为参照标准，通过Bradford 测定(Bio-Rad，Hercules，CA)来测定经纯化粗提物的总蛋白质含量。

5.蛋白质提取物的体积排阻色谱

填装有32ml Sephacryl^TMS-500高分辨率珠(S-500HR：GE  Healthcare，Uppsala，Sweden，货号17-0613-10)的体积排阻色谱(SEC) 柱用平衡/洗脱缓冲液(50mM的Tris(pH8)，150mM NaCl)平衡。将 1.5mL粗蛋白质提取物加到该柱上，然后用45mL平衡/洗脱缓冲液进行 洗脱。以1.5mL级分收集洗脱液，洗脱级分的相对蛋白质含量通过将10μL 级分与200μL稀释的Bio-Rad蛋白染色试剂(Bio-Rad，Hercules，CA)混 合来监测的。用2倍柱体积的0.2N NaOH清洗该柱，然后用10倍柱体积 的50mM Tris(pH8)、150mM NaCl和20％乙醇溶液清洗。每次分离之 后用Blue Dextran2000(GE Healthcare Bio-Science Corp.，Piscataway，NJ， USA)校准所述柱。在每次分离之间对Blue Dextran2000和宿主可溶性蛋 白质的洗脱曲线进行比较，以确保所用柱之间的洗脱曲线的一致性。

6.蛋白质分析与免疫印迹

通过BCA蛋白质测定(Pierce Biochemicals，Rockport IL)来测定 蛋白质浓度。在还原条件下通过SDS-PAGE分离蛋白质，并用考马斯蓝染 色。对经染色的凝胶进行扫描，并使用ImageJ Software(NIH)进行密度 分析。

用丙酮沉淀来自SEC洗脱级分的蛋白质(Bollag等，1996)，重悬在 1/5体积的平衡/洗脱缓冲液中，在还原条件下通过SDS-PAGE分离并电转 移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis， IN)上用于免疫检测。在免疫印迹之前，用Tris缓冲盐水(TBS-T)中5 ％脱脂奶和0.1％Tween-20在4℃下封闭所述膜16～18小时。

通过用2μg/ml合适的抗体(表6)(在2％脱脂奶、0.1％TBS-Tween 20溶液中)孵育进行免疫印迹。用于化学发光检测的第二抗体示于表4中， 如所示在2％脱脂奶、0.1％TBS-Tween20溶液中稀释。使用luminol(Roche  Diagnostics Corporation)作为底物，通过化学发光检测免疫反应性复合物。 使用EZ-Link活化辣根过氧化物酶缀合试剂盒(Pierce，Rockford， IL)进行人IgG抗体的辣根过氧化物酶缀合。用作检测H1、H3和B亚型 之对照的失活全病毒(WIV)从National Institute for Biological Standards  and Control(NIBSC)购得。

表6：用于所表达蛋白质免疫印迹的电泳条件、抗体和稀释度

FII：Fitzgerald Industries International，Concord，MA，U SA；

NISBIC：National Institute for Biological Standards and Control；

JIR：Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA；

BEI NR：Biodefense and emerging infections research resources  repository；

ITC：Immune Technology Corporation，Woodside，NY，USA

TGA：Therapeutic Goods Administration，Australia

针对H5的血凝素分析是基于Nayak.和Reichl(2004)所述的方法。 简言之，在含有100μL PBS的V形底96孔微滴定板中进行测试样品的两 倍系列稀释(100μL)，使每孔中含有100μL稀释样品。将100μL0.25％ 火鸡红细胞悬液(Bio Link Inc.，Syracuse，NY)加到每孔中，将板在室温 下孵育2小时。将显示完全血细胞凝集的最高稀释度的倒数记录为HA活 性。平行地，用PBS稀释重组HA标准物(A/越南/1203/2004H5N1)(Protein  Science Corporation，Meriden，CT)，并作为每个板的对照。

7.蔗糖梯度超离心

将对含有H5的生物质进行凝胶过滤色谱而洗脱得到的1mL级分9、 10和11合并，并加到20～60％(重量/体积)不连续蔗糖密度梯度中，以 125000g(4℃)离心17.5小时。从顶部起，将梯度物分级分离成19个3mL 级分，并在免疫分析和血细胞凝集测定之前通过透析除去蔗糖。

8.电子显微镜

将100μL待测样品置于Airfuge超离心管(Beckman Instruments， Palo Alto，CA，USA)中。将网置于该管的底部，然后将所述管以120000g 离心5分钟。取出网，温和干燥并置于3％磷钨酸(pH6)液滴上进行染 色。利用Hitachi7100透射电子显微镜(TEM)检测网(图14B、15B和 15C中的图像)。

对于图19中的图像而言，将约1mm³的叶块用含有2.5％戊二醛的 PBS固定，并用含有3％蔗糖的PBS清洗，然后用1.33％四氧化锇再次固 定。用Spurr树脂对固定样品进行包埋，并将超薄切片铺于网上。用5％ 醋酸双氧铀和0.2％柠檬酸铅对样品进行正染色，然后观察。利用Hitachi 7100透射电子显微镜(TEM)观察网。

9.质膜脂质分析

根据Mongrand等人利用聚乙二醇3350/葡聚糖T-500(各6.6％)在 水性聚合物两相系统中分配而进行细胞分级分离后，从烟草叶和培养的 BY2细胞得到质膜(PM)。所有步骤均在4℃下进行。

根据Bligh和Dyer所述，从不同级分提取和纯化脂质。使用Lefebvre 等所述的溶剂体系通过一维HP-TLC分离极性和中性脂质。如Macala等 所述，用醋酸铜染色后检测脂质的PM级分。通过比较脂质的迁移时间与 标准物的迁移时间来鉴定脂质(除了SG得自Matreya，Pleasant Gap，PA， USA以外，其它所有标准物均得自Sigma-Aldrich，St-Louis，MO，USA)。

10.H5VLP(A/印度尼西亚/5/2005)的纯化

使用市售的搅拌器，在1.5倍体积的50mM Tris(pH8)、NaCl150 mM和0.04％偏亚硫酸氢钠溶液中对冷冻的经660渗入的本塞姆氏烟草叶 进行匀浆。向所得提取物中添加1mM PMSF，并用1M醋酸调节至pH6， 然后在42℃加热5分钟。将硅藻土(DE)添加到经热处理的提取物中， 以吸附由pH变化和热处理所沉淀出的污染物，并通过Whatman滤纸过 滤所述浆液。所得澄清的提取物在室温下以10000×g离心10分钟以除去 残留的DE，通过0.8/0.2μm Acropack20滤器，并加到胎球蛋白-琼脂糖亲 和柱(Sigma-Aldrich，St-Louis，MO，USA)上。用400mM NaCl、25mM  Tris(pH6)清洗后，用1.5M NaCl、50mM MES(pH6)洗脱所结合的 蛋白质。向洗脱的VLP中添加Tween-80使终浓度为0.0005％(体积/体积)。 利用100kDa MWCO Amicon膜浓缩VLP，在4℃以10000×g离心30分 钟，并用含有0.01％Tween-80和0.01％硫柳汞的PBS(pH7.4)重悬。使 用之前对混悬的VLP进行过滤除菌。

1.1动物研究

小鼠

利用6～8周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories)对 流感病毒VLP施用的免疫应答进行研究。将70只小鼠随机分到14组中， 每组5只。8组用于肌内免疫，6组用于测试鼻内施用途径。所有组均以两 剂方案免疫，即初次免疫后3周进行加强免疫。

对于在后肢进行肌内施用而言，用由植物生产的H5VLP(A/印度 尼西亚/5/2005(H5N1))疫苗(0.1、1、5或12μg)或对照血凝素(H5) 抗原免疫未麻醉的小鼠。对照H5含有基于A/印度尼西亚/5/05H5N1毒株 制备并从293细胞培养物(Immune Technology Corp.，New York，USA) 中纯化的重组可溶性血凝素(除非另外指明，每剂注射使用5μg)。缓冲 液对照是PBS。该抗原由HA蛋白的18～530位氨基酸组成，并具有组氨 酸标签(His-tag)和经修饰的切割位点。电子显微镜观察证实了该市售产 品不是VLP形式。

为了测量佐剂的作用，用5μg由植物生产的VLP H5疫苗外加1倍 体积的2％铝胶(明矾，Accurate Chemical & Scientific Corporation， Westbury，NY，US)或用5μg从293细胞培养物中纯化的重组血凝素外加 1倍体积的明矾来分别免疫两组动物。将70只小鼠随机分到14组中，每 组5只。8组用于肌内免疫，6组用于测试鼻内施用途径。所有组均根据初 免-加强方案进行免疫，即初次免疫后3周进行加强免疫。

对于在后肢进行肌内施用而言，用由植物生产的VLP H5疫苗(0.1、 1、5或12μg)或对照血凝素(HA)抗原(5μg)或PBS免疫未麻醉的小 鼠。在免疫之前以1∶1体积比将各抗原制备物与1％铝胶(明矾，Accurate  Chemical & Scientific Corporation，Westbury，NY，US)混合。为了测量佐 剂的作用，用不含任何佐剂的5μg由植物生产的VLP H5疫苗或者用不含 任何佐剂的5μg对照HA抗原分别免疫两组动物。

对于鼻内施用而言，使用自动吸气室通过吸入异氟烷短暂麻醉小鼠。 然后，用由植物生产的VLP疫苗(0.1或1μg)或者用对照HA抗原(1μg) 或者用PBS以4μl滴/鼻孔来免疫小鼠。在免疫之前将各抗原制备物与1 ％壳聚糖谷氨酸(Protosan，Novamatrix/FMC BioPolymer，Norway)混合。 然后，使小鼠在所述溶液中呼吸。为了验证鼻内施用途径中佐剂的作用， 用1μg由植物生产的VLP H5疫苗或用1μg对照HA抗原来分别免疫两 组动物。

雪貂

使用10组雪貂(雄性，18～24周龄，重量约为1kg)，每组5只。 如表7中所述对每组进行处理。所用的佐剂是2％铝胶(明矾)(Superfos  Biosector，Denmark)(终浓度为1％)。疫苗组合物是如所述制备的膜相关 的A/印度尼西亚/5/05(H5N1)VLP。疫苗对照(阳性对照)是来自印度 尼西亚毒株的完全糖基化的膜结合重组H5，其由Immune Technology  Corporation(ITC)使用293细胞培养物中的腺病毒来制备。

表7.处理组

*i.m.：肌内

在研究期间定期评价雪貂的整体健康情况和外观(体重、直肠温度、 姿态、皮毛、运动模式、呼吸、排泄)。在第0、14和28天向四头肌中肌 内注射(0.5～1.0倍总体积)来免疫动物；对于引入佐剂的方案而言，在 免疫之前以1∶1体积比将疫苗组合物与铝胶混合。在第0天(免疫前)以 及第21和第35天获取血清样品。在第40～45天处死(放血/心脏穿刺) 动物，收集脾脏并进行尸检。

可使用同源或异源的失活H5N1病毒，利用ELISA测定来定量抗流 感病毒的抗体效价。

如Aymard等(1973)所述，利用微滴定HAI评估血清样品(免疫 前、第21天和第35天)的血细胞凝集抑制抗体效价。简言之，用受体破 坏酶对血清进行预处理，热失活并与红细胞(经清洗的血红细胞(RBC)) 混悬液混合。推荐使用来自Lampire的经清洗的马RBC(10％)，考虑到 该测定可根据RBC来源而变化(马依赖型)，测试了来自10匹马的经清 洗RBC，以选择最敏感的批次。或者，可使用火鸡的RBC。抗体效价表 示为完全抑制血细胞凝集的最高稀释度的倒数。

交叉反应性HAI效价：用针对A/印度尼西亚/5/05(进化枝2.1)的 疫苗免疫的雪貂的HAI效价使用来自另一亚进化枝或进化枝的失活H5N1 流感毒株（例如进化枝1越南毒株（A/越南/1203/2004和A/越南/1194/2004) 或者A/安徽/01/2005(亚进化枝2.3)或A/火鸡/土耳其/1/05(亚进化枝2.2)) 测量。所有分析均是针对单个样品进行的。

数据分析：对所有数据进行统计学分析(ANOVA)以确定组与组之 间的差异是否具有统计学显著性。

致命性攻击的实验设计(小鼠)

将128只小鼠随机分到16组中，每组8只动物，1组未免疫且未受 攻击(阴性对照)。所有组均以两剂方案通过肌内施用进行免疫，在初次 免疫后2周进行第二次免疫。

对于在后肢进行肌内施用而言，用由植物生产的H5VLP疫苗(1、 5或15μg)或15μg对照HA抗原或PBS免疫未麻醉的小鼠。在免疫之前 将各抗原制备物与1倍体积的1％铝胶(明矾，Accurate Chemical &  Scientific Corporation，Westbury，NY，US)混合。

在免疫期间，每周为小鼠称重一次，并观察和监测注射部位的局部 反应。

第二次免疫后第22天，在BL4防护实验室(P4-Jean  Mérieux-INSERM，Lyon，France)对经麻醉小鼠鼻内攻击(i.n.)4.09×10⁶的50％细胞培养物感染剂量(CCID50)的流感病毒A/土耳其/582/06病毒 (由法国里昂大学的Bruno Lina博士馈赠)。攻击之后，在14天内观察小 鼠的疾病临床症状并每日称重。将具有严重感染症状且体重减轻≥25％的 小鼠麻醉后处以安乐死。

血液收集、肺和鼻腔清洗以及脾脏收集

在初次免疫后第14天和第二次免疫后第14天收集未麻醉动物的侧 隐静脉之静脉血。以8000g离心10分钟收集血清。

在第二次免疫后4周，利用CO₂气体麻醉小鼠并在终止后马上进行 心脏穿刺以收集血液。

最后放血后，将导管朝向肺插入气管中，将1ml冷的PBS-蛋白酶 抑制剂混合溶液置于与所述导管相连的1cc注射器中并注射到肺中，然后 取出用于分析。该清洗步骤进行2次。对肺清洗物进行离心以除去细胞碎 片。对于鼻内清洗而言，将导管朝鼻区方向插入，将0.5ml PBS-蛋白酶抑 制剂混合溶液通过所述导管推进鼻腔中，然后收集。对鼻清洗物进行离心 以除去细胞碎片。收集用5μg添加佐剂的由植物生产之疫苗或5μg添加 佐剂的重组H5抗原进行肌内免疫的小鼠以及用1μg添加佐剂的由植物生 产之疫苗或1μg添加佐剂的重组H5抗原进行鼻内免疫的小鼠的脾脏。将 收集的脾脏置于补充有庆大霉素的RPMI中，并用10ml注射器的推筒将 所述脾脏研碎到50ml锥形管中。清洗研碎的脾脏2次，以2000rpm离心 5分钟，室温下用ACK裂解缓冲液重悬5分钟。用PBS-庆大霉素清洗脾 细胞，重悬在5％RPMI中并计数。脾细胞用于增殖测定。

抗体效价

在初次免疫后第14天以及第二次免疫后第14天和第28天测量血清 的抗流感病毒抗体效价。使用失活病毒A/印度尼西亚/5/05作为包被抗原， 利用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定效价。终点效价表示为达到高出阴 性对照样品至少0.1的OD值的最高稀释度的倒数。

对于抗体种类测定而言(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM)，如 上文所述通过ELISA评估效价。

血细胞凝集抑制(HI)效价

如先前所述(WHO2002；Kendal1982)，在第二次免疫后第14天和 第28天测量血清的血细胞凝集抑制(HI)效价。将A/印度尼西亚/5/05或 A/越南/1203/2004毒株的失活病毒制备物用于测试小鼠血清样品的HI活 性。用由霍乱弧菌(Kendal1982)制得的受体破坏酶II(RDE II)(Denka  Seiken Co.，Tokyo，Japan)对血清进行预处理。用0.5％火鸡血红细胞进行 HI测定。HI抗体效价被定义为引起完全凝集抑制的最高稀释度的倒数。

实施例

实施例1.通过农杆菌渗入法在本塞姆氏烟草植物中瞬时表达流感病毒A/ 印度尼西亚/5/05(H5N1)血凝素

通过A/印度尼西亚/5/05(H5N1)毒株之H5亚型的表达来测定瞬时 表达系统产生流感病毒血凝素的能力。如图11所示，首先将带有天然信号 肽和跨膜结构域的血凝素基因编码序列(GenBank登录号EF541394)组 装在质体蓝素表达盒(来自苜蓿质体蓝素基因的启动子、5’UTR、3’UTR 以及转录终止序列)中，将所组装的盒(660)插入到pCAMBIA二元质 粒中。然后，将该质粒转染到农杆菌(AGL1)中，得到重组株AGL1/660， 其用于瞬时表达。

用AGL1/660渗入本塞姆氏烟草植物，并在6天的培养期后收获叶。 为了测定H5是否在农杆菌渗入的叶中积累，首先从经渗入的叶组织中提 取蛋白质并通过Western印迹利用抗-H5(越南)多克隆抗体进行分析。 检测到提取物中约72kDa的独特条带(图12)，其大小对应于未切割的流 感病毒血凝素HA0形式。用作阳性对照的市售H5(A/越南/1203/2004； Protein Science Corp.，Meriden，CT，USA)被检测为约48kDa和28kDa 的两个条带，分别对应于HA1和HA2片段的分子量。这表明H5在经渗 入叶中的表达导致未切割之翻译产物的累积。

来自经AGL1/660转化的叶的粗蛋白质提取物能够凝集火鸡血红细 胞，证明形成了活性HA三聚体(数据未显示)。

实施例2：使用体积排阻色谱表征植物提取物中含有血凝素的结构

通过凝胶过滤对由植物生产的流感病毒血凝素组装成高分子量结构 进行评估。通过体积排阻色谱(SEC)利用Sephacryl^TMS-500HR柱(GE  Healthcare Bio-Science Corp.，Piscataway，NJ，USA)对经AGL1/660渗入 之植物的粗蛋白质提取物(1.5mL)进行分级分离。使用抗HA抗体通过 免疫检测测定洗脱级分的总蛋白质含量和HA丰度(图13A)。如图13A 所示，Blue Dextran(2MDa)洗脱物早在级分10中出现峰值，而大部分 宿主蛋白质仍保留在柱中并在级分14与22之间被洗脱出来。当利用丙酮 沉淀法将来自200μL各SEC洗脱级分的蛋白质浓缩(5倍)并通过Western 印迹(图15A，H5)分析时，血凝素(H5)主要存在于级分9～14中(图 13B)。不希望受理论限制，这表明HA蛋白已被组装成大的超级结构或已 附着于高分子量结构上。

将第二表达盒与来自A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)(SEQ ID NO： 33；图16；GenBank登录号AY289929)的H1核酸序列进行组装以产生构 建体540(图11)。设计嵌合基因构建体以产生可溶性三聚体形式的H1， 其中信号肽源自植物蛋白质二硫键异构酶基因，H1的跨膜结构域被GCN4 亮氨酸拉链的pII变体替代，其已显示可自组装成三聚体的肽(Harbury 等，1993)(盒544，图11)。虽然缺乏跨膜结构域，但是该可溶性三聚体形 式仍具有血细胞凝集能力(数据未显示)。

通过SEC对用AGL1/540或AGL1/544渗入之植物的蛋白提取物进 行分级分离，用抗A型流感病毒抗体(Fitzgerald，Concord，MA，USA)通 过Western印迹检测H1洗脱级分的存在。在经AGL1/540渗入的叶中， H1主要以很高分子量的结构累积，其中峰朝较小结构偏离(H1；图13C)。 在经AGL1/544渗入的叶中，可溶性形式的H1作为分离的三聚体累积， 这可通过与宿主蛋白质洗脱曲线平行的凝胶过滤洗脱曲线来证明(可溶性 H1；图13D)。相比较而言，由5～6个血凝素三聚体微团组成的H1玫瑰 花结(Protein Science Corp.，Meriden，CT，USA)在级分12～16中洗脱出 来(图13E)，早于可溶性H1(图13D)但晚于天然H1(图13C)。

为了评价M1共表达对血凝素组装成结构的影响，使用对应于 A/PR/8/34(H1N1)M1编码序列(SEQ ID NO：35；图18；GenBank登录 号NC_002016)的核酸组装了M1表达盒。该构建体称为750，示于图11 中。对于M1和H1共表达而言，在渗入前以相等体积混合AGL1/540和 AGL1/750混悬液。多种农杆菌混悬液的共渗入允许共表达多种转基因。 对SEC洗脱级分的Western印迹分析表明M1共表达不改变H1结构的洗 脱曲线，但导致经农杆菌渗入的叶中H1累积减少(参见图13F)。

实施例3：通过蔗糖梯度离心分离H5结构并在电子显微镜下观察

在电子显微镜(EM)下观察血凝素结构需要的浓度和纯度水平比从 SEC获得的叶蛋白质粗提物更高。为了能通过EM观察H5结构，首先通 过PEG沉淀(20％聚乙二醇)浓缩叶蛋白质粗提物，然后重悬在1/10体 积的提取缓冲液中。将所浓缩的蛋白提取物通过S-500HR凝胶过滤进行 分级分离，并合并洗脱级分9、10和11(对应于柱的空隙体积)，通过20～ 60％蔗糖密度梯度超速离心，进一步与宿主蛋白质分离。在分析之前，从 顶部开始进行蔗糖梯度分级分离，将级分透析，并利用100NMWL离心 过滤装置进行浓缩。如Western印迹和血细胞凝集结果所示(图14A)， H5主要累积在级分16～19中，其含有约60％蔗糖，而大多数宿主蛋白质 在级分13中出现峰值。合并级分17、18和19，进行负染色，并在EM下 观察。对样品的观察清楚地表明存在大小为80～300nm的刺突球状结构， 其与流感病毒VLP的形态学特征相吻合(图14B)。

实施例4：来自植物生物质的流感病毒H5VLP的纯化

除了含量丰富的可溶性蛋白质以外，植物的叶提取物中含有可溶性 糖、核酸和脂质的复杂混合物。通过改变pH和热处理然后利用硅藻土过 滤对粗提物进行纯化(参见“材料和方法”部分中有关纯化方法的详述)。图 15A(泳道1～4)表示考马斯蓝染色的凝胶，其比较了多个纯化步骤的蛋 白质含量。粗提物(泳道1)和经纯化提取物(泳道4)中蛋白质含量的比 较表明，纯化步骤能降低总蛋白质含量以及除去叶粗提物中的大多数主要 污染物(显示为50kDa)。所述50kDa条带对应于RuBisCO大亚基，占 叶总蛋白质的高达30％。

通过亲和色谱利用胎球蛋白柱对来自这些经澄清提取物的流感病 毒H5VLP进行纯化。对加样级分(图15A，泳道5)、流穿(图15A， 泳道6)以及经洗脱VLP(图15A，泳道7)的比较表明胎球蛋白亲和 柱对经澄清植物提取物中的流感病毒H5VLP具有特异性。

如利用考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的密度测定所示(图15， 泳道7)，纯化步骤导致H5的纯度大于75％。为了评价所纯化产物的结 构质量，利用100NMWL(nominal molecular weight limit，名义分子 量极限)离心过滤装置对经纯化的H5进行浓缩，并在负染色后于EM 下观察。图15B显示了表示存在大量VLP的代表性部分。更加细致地 观察证实了VLP上存在刺突(图15C)。

如图15D所示，基于考马斯蓝染色的H5血凝素的密度以及基于 通过BCA法测定的总蛋白质含量，利用胎球蛋白柱亲和色谱将来自经 澄清叶提取物的H5VLP纯化至纯度约89％。

通过凝集火鸡红细胞的能力证实HA VLP生物活性(数据未显 示)。

图15D还通过Western印迹目测以及利用抗H5多克隆血清(A/ 越南/1203/2004)进行的免疫检测验证了纯化VLP的身份。检测到约 72kDa的独特条带，其大小对应于未切割的HA0形式流感病毒血凝素。 图15c显示所述疫苗的VLP结构，其中血凝素刺突覆盖其结构。

通过0.22μm滤器过滤来制备用于免疫小鼠的VLP，利用内毒素 LVL(Limulus Amebocyte Lysate)检测试剂盒(Lonza，Walkserville，MS， USA)测定内毒素含量。经过滤的疫苗含有105.8±11.6％EU/ml(内毒 素单位/ml)。

实施例5：流感病毒VLP在植物中的定位

为了对VLP定位并证实其质膜来源，将产生H5的植物的叶薄切 片固定，并在正染色后于TEM下观察。对叶细胞的观察表明VLP存在 于由质膜内陷形成的细胞外腔中(图19)。所观察的VLP的形态和位置 表明，尽管其质膜附着在细胞壁上，但是植物细胞具有产生来源于其质 膜的流感VLP并将它们累积在质外体空隙中所需的可塑性。

实施例6：质膜脂质分析

对植物流感病毒VLP的组成和来源的进一步验证来自于对脂质 成分的分析。从经纯化的VLP提取脂质，并通过高效薄层色谱 (HP-TLC)将其组成与高度纯化的烟草质膜的组成进行比较。来自 VLP与对照质膜的极性和中性脂质的迁移模式相似。经纯化的VLP包 含在质膜中发现的主要磷脂(磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺)和鞘脂(葡 萄糖神经酰胺)(图27A)，并且二者均含有作为唯一中性脂质的游离固 醇(图27B)。然而，对经纯化VLP提取物中质膜蛋白质标志物(ATP 酶)的免疫检测表明，VLP脂双层不包含与植物质膜相关的主要蛋白质 中任一种，这表明宿主蛋白质可能在VLP从植物细胞中出芽的过程中 被排除在膜以外(图27C)。

实施例7：H5VLP的免疫原性以及施用途径的影响

通过肌内注射或鼻内(吸入)向小鼠施用由植物生产的H5VLP。 根据所述的方法，将0.1～12μgVLP肌内注射给小鼠，以明矾作为佐 剂。使用最低抗原量即观察到了峰值抗，其幅度与5μg重组可溶性血 凝素(H5)相似(图20A)。

0.1～1μg由植物生产的H5VLP与壳聚糖佐剂一起鼻内施用所提 供的抗体应答大于重组可溶性H5与明矾佐剂所提供的抗体应答(图 20B)。

对于这两种施用途径而言，在一定的抗原量范围内，在所有测试 小鼠中均观察到血清转换。重组H5可溶性抗原产生低的(＜1/40)或可 忽略不计的(1＜1/10，对于未加佐剂的重组H5而言)HI效价。

实施例8：H5VLP的血细胞凝集抑制抗体效价(HAI)

图21A、21B示意在用由植物生产的H5VLP或重组可溶性H5“加 强”后第14天的血细胞凝集抑制(HAI)抗体应答。当肌内施用时最低 剂量的抗原(0.1μg)所产生的HAI应答是施用5μg重组可溶性H5的 10倍。与最低剂量相比，H5VLP的剂量增加导致HAI适度增加。

鼻内施用后，与施用1μg重组可溶性H5的小鼠(其与阴性对照 类似)相比，施用由植物生产的H5VLP(1.0或0.1μg)之小鼠的HAI 应答显著提高。通过肌内注射H5VLP(0.1～12μg)免疫的所有小鼠 的HAI效价均高于用对照H5抗原免疫的小鼠(图21A)。对于同样的 5μg剂量，VLP诱导的HAI效价是相应剂量的对照H5抗原的20倍。 当通过鼻内途径递送时，VLP诱导的HAI效价也显著高于对照HA抗 原(图21b)。对于给定剂量的H5VLP而言，鼻内免疫之小鼠的HAI 效价水平低于肌内免疫的小鼠；当肌内施用时，1μg VLP诱导的平均 HAI效价为210，而鼻内施用同样剂量所诱导的平均HAI效价为34。

当肌内施用时，所有剂量VLP均诱导高水平的能与失活的同源全 病毒结合的抗体(图20a和24)。由植物生产的VLP疫苗与对照H5抗 原之间无显著差异(除了加强后第14天的12μg VLP组以外)，因为这 两种抗原制备物均诱导针对同源毒株的高结合抗体效价。然而，当鼻内 施用时，VLP诱导的结合抗体效价高于对照H5抗原(图20b)。当与 壳聚糖混合时，用1μg VLP免疫诱导的平均Ab效价倒数为5500，其 是在用1μg对照HA抗原免疫的小鼠中水平(平均Ab价倒数为920) 的8.6倍。

然后，通过在小鼠中进行剂量范围研究来研究由植物生产的流感 VLP的免疫原性。以3周的间隔用配制在明矾(1∶1比例)中的0.1μg 至12μg含有来自流感病毒A/印度尼西亚/5/05(H5N1)之HA的VLP 肌内免疫数组BALB/c小鼠(每组5只)。使用失活全病毒抗原(A/印 度尼西亚/5/05(H5N1))测量第二次免疫后第14天收集之血清的血细 胞凝集抑制效价(HI或HAI)。用低至0.1μg剂量VLP进行的免疫诱 导抗体产生，所述抗体在高稀释度下抑制病毒凝集红细胞(图21A)。 用5μg非VLP、明矾佐剂化的对照H5抗原(同样来自A/印度尼西亚 /5/05)平行免疫小鼠所诱导的HI应答比用最低VLP剂量所产生的HI 应答低2～3个对数值。

对于两种施用途径而言，在一定的抗原量范围内，施用VLP之小 鼠的HAI应答均更佳。

实施例9：佐剂对H5VLP免疫原性的作用

由植物生产的H5VLP具有质膜来源(图19，实施例5)。不希望 受理论限制，包膜病毒或包膜病毒的VLP通常从其出芽的膜获得包膜。 植物质膜含有植物固醇成分(即使在动物细胞中发现，也非常稀少)， 并且已表明这些固醇的某一些表现出免疫刺激作用。

在佐剂存在或不存在下，向小鼠肌内(图22A)或鼻内(图22B) 施用由植物生产的H5VLP，并测定HAI(血细胞凝集抑制抗体应答)。 在添加或不添加佐剂(明矾或壳聚糖，如这些实施例中所示)下，以任 一施用体系施用VLP表现出比重组可溶性H5显著更高的HAI血细胞 凝集抑制。即使不添加佐剂(即明矾或壳聚糖)，由植物生产的H5VLP 仍表现出显著的HAI，这表示对施用所述抗原的全身免疫应答。

明矾使肌内施用VLP的平均HAI效价水平提高至5倍(图22a)， 使对照H5抗原的平均HAI效价水平提高至3.7倍。当肌内施用时，5μg VLP诱导的平均HAI效价比对应剂量的对照H5抗原高12倍。壳聚糖 不提高对照H5抗原的平均HAI水平(图22b)，而其使鼻内施用1μg VLP免疫的小鼠的平均HAI水平提高5倍。

实施例10：抗体同种型

在存在或不存在明矾作为所添加佐剂的情形下，施用由植物生产 的H5VLP或重组可溶性H5的小鼠表现出多种免疫球蛋白同种型(图 23A)。

在添加佐剂的情形下，VLP与重组H5的抗体同种型模式相似， 其中IgG1是主要的同种型。当不添加佐剂而施用VLP或重组H5时， IgG1应答降低，但仍是响应于VLP的主要同种型，IgM、IgG2a、IgG2B 和IgG3保持与添加佐剂时相似的效价。当不添加佐剂而施用重组H5 时，IgG1、IgG2a和IgG2b效价显著降低(图23A)。

因此，这些数据表明，由植物生产的VLP不需要添加佐剂来激发 宿主的抗体应答。

图23B示意在添加抗原的情形下肌内施用由植物生产的VLP或 可溶性重组HA的小鼠中抗失活全流感病毒株(A/印度尼西亚/5/05；A/ 越南/I203/04)的抗体效价。在施用1μg或5μg VLP或者5μg可溶性 HA的小鼠中未观察到针对这些流感毒株之抗体效价的显著差异。

实施例11：H5VLP疫苗诱导的血清抗体的交叉反应性

评价了H5VLP疫苗诱导的血清抗体针对不同的失活全流感病毒 株的交叉反应性。所有VLP剂量(0.1～12μg)以及5μg对照HA抗 原均诱导针对进化枝1毒株(A/越南/1194/04)、进化枝2.1的同源毒株 A/印度尼西亚/5/05以及进化枝2.2毒株A/火鸡/土耳其/1/05的高的结合 抗体效价(图25A)。

然而，只有由植物生产的VLP诱导针对A/火鸡/土耳其/1/05毒株 的HAI效价(图25b)。VLP针对A/印度尼西亚/5/05的HAI效价高。

实施例12：由植物生产的H5VLP进行免疫所提供的交叉保护

向如上文所述先前已施用两剂方案之A/印度尼西亚/5/05H5VLP 的小鼠随后用流感病毒A/土耳其/582/06(H5N1)(“土耳其H5N1”)感 染性病毒进行鼻内攻击，并观察。每只动物所施用的剂量为10LD₅₀(4.09×10⁵CCID₅₀)。

攻击后7天内，只有37.5％的施用PBS疫苗对照的小鼠在暴露于 土耳其H5N1后存活(图26A)。100％的施用对照抗原(HA)或者1、 5或15μg印度尼西亚H5VLP的动物在攻击后存活至17天(此时实 验结束)。

还在实验期间监测了小鼠的体重，并绘制了存活小鼠的平均体重 图(图26B)。在攻击之前施用1、5或15μg印度尼西亚H5VLP的小 鼠在实验过程中没有可觉察的体重损失，特别是施用5μg VLP的小鼠 似乎体重明显增加。阴性对照小鼠(未用土耳其H5N1攻击)没有可觉 察的体重增加或减轻。阳性对照小鼠(未施用VLP，但用土耳其H5N1 攻击)在实验过程中表现出体重显著减轻，并且其中有3只小鼠死亡。 由于体重是所有同组小鼠的平均值，所以去除“患病最严重的”小鼠(死 亡的3只)可导致体重明显呈整体增加，然而，需注意的是阳性对照组 的平均体重仍然显著低于阴性组或VLP处理组的平均体重。

因此，这些数据表明，由植物生产的含有H5血凝素病毒蛋白的 流感病毒VLP诱导特异性针对病原性流感毒株的免疫应答，并且病毒 样颗粒可从植物质膜出芽。

因此，这些数据表明，植物能够生产流感病毒样颗粒，并且还首 次表明病毒样颗粒可从植物质膜出芽。

此外，使用现有的瞬时表达技术，在得到靶标HA序列后仅用16 天就生产了第一批抗原。按照当前的H5VLP产量，以及示例性的5μg/ 对象的剂量，每千克经渗入的叶可生产约20000剂疫苗。除了其它实施 方案以外，这种平台简单、能大量生产以及具有强免疫原性的独特组合 为响应于大流行提供了新的方法。

实施例13：使用体积排阻色谱表征植物提取物中含有血凝素(H1、H2、 H3、H5、H6和H9)的结构

通过凝胶过滤对由植物生产的不同亚型流感病毒血凝素组装成高分 子量结构进行评估。通过体积排阻色谱(SEC)利用Sephacryl^TMS-500HR 柱(GE Healthcare Bio-Science Corp.，Piscataway，NJ，USA)对经 AGL1/660、AGL1/540、AGL1/783、AGL1/780、AGL1/785和AGL1/790 渗入之植物的蛋白质粗提物或经浓缩蛋白质提取物(1.5mL)进行分级分 离。如图46所示，Blue Dextran(2MDa)洗脱物早在级分10中出现峰 值。当利用丙酮沉淀法将来自200μL各SEC洗脱级分的蛋白质浓缩(5 倍)并通过Western印迹(图46)分析时，血凝素主要存在于级分7～14 中，这表示HA已并入VLP中。不希望受理论限制，这表明HA蛋白已被 组装成大的超结构或者其已附着于高分子量结构上，而与所产生的亚型无 关。在图46中，使用含有PDI信号肽的盒制备来自A/新喀里多尼亚/20/1999 毒株的H1以及来自A/布里斯班/10/2007毒株的H3。所得结果表明，用苜 蓿PDI的信号肽替换天然信号肽不影响HA组装成颗粒的能力。

实施例14：使用野生型核苷酸序列通过农杆菌渗入在本塞姆氏烟草植物 中瞬时表达季节性流感病毒血凝素

通过表达来自毒株A/布里斯班/59/2007(H1N1)(质粒#774)、 A/新喀里多尼亚/20/1999(H1N1)(质粒#540)和A/所罗门群岛/3/2006 (H1N1)(质粒#775)的H1亚型以及来自毒株A/布里斯班/10/2007(质 粒#776)和A/威斯康星/67/2005(质粒#777)的H3亚型以及来自毒株B/ 马来西亚/2506/2004(Victoria谱系)(质粒#778)和B/佛罗里达/4/2006 (Yamagata谱系)(质粒#779)的B型来测定瞬时表达系统产生季节性 流感病毒血凝素的能力。首先将血凝素基因编码序列组装在质体蓝素表 达盒(苜蓿质体蓝素基因的启动子、5’UTR、3’UTR以及转录终止序列) 中，将所组装的盒插入pCAMBIA二元质粒中。然后将所述质粒转染到 农杆菌(AGL1)中，分别产生农杆菌株AGL1/774、AGL1/540、 AGL1/775、AGL1/776、AGL1/777、AGL1/778和AGL1/779。

用AGL1/774、AGL1/540、AGL1/775、AGL1/776、AGL1/777、 AGL1/778和AGL1/779渗入本塞姆氏烟草植物，并在6天培养期后收 集叶。为了测定H1是否累积在经农杆菌渗入的叶中，首先从经渗入的 叶组织中提取蛋白质，并用抗HA抗体通过Western印迹进行分析(用 于检测每种HA亚型的抗体和条件参见表6)。对于来自H1毒株的HA 而言，检测到提取物中约72kDa的独特条带(图47)，其大小对应于流 感病毒血凝素的未切割的HA0形式。这表明不同的年度流行毒株的血 凝素在经渗入叶中的表达导致未切割翻译产物的累积。使用这些表达和 免疫检测策略，在蛋白质粗提物中未检测到来自H3亚型或B型之流感病 毒HA的表达(图47)。

实施例15：使用野生型核苷酸序列通过农杆菌渗入在本塞姆氏烟草植物 中瞬时表达潜在大流行流感病毒血凝素

通过表达来自毒株A/安徽/1/2005(H5N1)(质粒#781)、A/印度 尼西亚/5/2005(H5N1)(质粒#660)以及A/越南/1194/2004(H5N1) (质粒#782)的H5亚型以及来自毒株A/新加坡/1/1957(H2N2)(质 粒#780)的H2亚型以及来自毒株A/水鸭/香港/W312/1997(H6N1)(质 粒#783)的H6以及来自毒株A/马/布拉格/1956(H7N7)(质粒#784) 的H7以及最后来自毒株A/香港/1073/1999(H9N2)(质粒#785)的 H9来测定瞬时表达系统产生潜在流感病毒血凝素的能力。首先将血凝 素基因编码序列组装在质体蓝素表达盒(苜蓿质体蓝素基因的启动子、 5’UTR、3’UTR以及转录终止序列)中，将所组装的盒插入pCAMBIA 二元质粒中。然后将所述质粒转染到农杆菌(AGL1)中，产生农杆菌 株AGL1/781、AGL1/660、AGL1/782、AGL1/780、AGL1/783、AGL1/784 和AGL1/785。

用AGL1/781、AGL1/660、AGL1/782、AGL1/780、AGL1/784 和AGL1/785渗入本塞姆氏烟草植物，并在6天培养期后收集叶。为了 测定H5是否累积在经农杆菌渗入的叶中，首先从经渗入的叶组织中提 取蛋白质，并用合适的抗HA抗体(用于检测每种HA亚型的抗体和条 件参见表6)通过Western印迹进行分析。在转化有H5和H2表达构 建体之植物的提取物中检测到约72kDa的独特条带(图48a和b)，其 大小对应于流感病毒血凝素的未切割的HA0形式。这表明不同的潜在 大流行毒株的血凝素在经渗入叶中的表达导致未切割的翻译产物的累 积。使用这些表达和免疫检测策略，在蛋白质粗提物中未检测到来自H7 和H9之流感病毒HA的表达(图48b)。

实施例16：通过农杆菌渗入在普通烟草植物中瞬时表达H5

通过表达来自毒株A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)(质粒#660) 的H5亚型来分析瞬时表达系统在普通烟草的叶中产生流感病毒血凝素 的能力。首先将血凝素基因编码序列组装在质体蓝素表达盒(苜蓿质体 蓝素基因的启动子、5’UTR、3’UTR以及转录终止序列)中，将所组装 的盒插入pCAMBIA二元质粒中。然后将所述质粒转染到农杆菌 (AGL1)中，产生AGL1/660株。

用AGL1/660渗入普通烟草植物，并在6天培养期后收集叶。为 了测定H5是否累积在经农杆菌渗入的叶中，首先从经渗入的叶中提取 蛋白质，并用抗H5抗体通过Western印迹进行分析。检测到提取物中 约72kDa的独特条带(图49)，其大小对应于未切割的HA0形式的流 感病毒血凝素。这表明血凝素在经渗入普通烟草叶中的表达导致未切割 HA0前体的累积。

实施例17：由植物生产的来自A/印度尼西亚/5/05(H5N1)的H5N1VLP 疫苗在雪貂中的免疫原性

在雪貂中进行剂量渐增的研究以评价由植物生产的VLP的免疫 原性。使用第一剂疫苗后第14天(图50A)和第二剂后第14天(图50B) 采集的血清，通过另外三种H5N1毒株(A/火鸡/土耳其/1/05(进化枝 2.2)、A/越南/1194/04(进化枝1)以及A/安徽/5/05(所有均为失活全 病毒))的血细胞凝集抑制来评价3种剂量(1、5和15μg)下H5VLP 疫苗所诱导血清抗体的体外交叉反应性。在所有3种剂量浓度下，均观 察到交叉反应性。

实施例18：根据CHMP标准分析免疫原性结果

EMEA的人用医疗产品委员会(Committee for Medicinal Products for Human Use，CHMP) (http://www.emea.europa.eu/htms/general/contacts/CHMP/CHMP.ht  ml)确立了疫苗效力的三个标准(适用于第二剂之后)：1-血清转换的 数目或HI效价显著增加(4倍)＞40％；2-几何平均值增加至少2.5； 3-达到1/40HI效价的对象比例应当为至少70％。在雪貂模型中对这些 标准的分析示于表8～11中。(*)表示符合或超出CHMP标准。与用 于颁发许可的CHMP标准相关的交叉免疫原性分析的总结于表12中。

每天评价动物的体重、体温和总体状况。在研究期间没有记录到 患病或不适的迹象。在研究期间体重和体温在正常范围内。所述疫苗是 安全的并被动物耐受。

表12：与用于颁发许可的CHMP标准相关的交叉免疫原性分析的总结

实施例19：血凝素核苷酸序列的选择

从流感病毒序列数据库(参见URL：flu.lanl.gov)或NCBI流感 病毒源(Bao等，2008，J.Virology82(2)：596-601；参见URL： ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)获取HA的核苷酸序列。对 于几种HA核酸序列而言，所述数据库中列了多个条目(表13)。一些 变异主要与培养体系(来源-MDCK、蛋、未知、病毒RNA/临床分离株) 有关；例如，当B型流感病毒在蛋的尿囊液中表达时，HA的第194位 (以成熟蛋白质编号)的糖基化位点不存在(还参见Chen等，2008)。 对一些序列而言，可缺少结构域(例如不完全克隆、测序假象等)。流 感病毒血凝素的结构域和亚结构域已在本说明书中进行了一般性论述。 一个序列的结构域可与另一已有序列的结构域相组合，例如一种毒株之 序列的信号肽可与另一毒株血凝素编码序列的平衡相组合以提供完整 的编码序列。

表13：流感病毒亚型中所选HA编码序列的变异

Y，N-分别为是、否

SP-信号肽序列的存在  是/否

HA1-全长HA1结构域  是/否

HA2-全长HA2结构域  是/否

DTm-全长跨膜结构域  是/否

毒株：A/所罗门群岛/3/2006的H1

比较了8种氨基酸序列并鉴定了变异(表14)。在一些序列中， 第171位表现出甘氨酸(G)或精氨酸(R)变异。

表14：A/所罗门群岛/3/2006的氨基酸变异

氨基酸编号* MDCK 蛋 212 K T 241 Q R 542 L R

从起始M编号

毒株：A/布里斯班/59/2007的H1

第203位表现出天冬氨酸(D)、异亮氨酸(I)或天冬酰胺(N) 变异。

毒株：A/布里斯班/10/2007的H3

在5个位置观察到序列变异(表15)。在两个采样序列的第215 位观察到缺失。

表15：A/布里斯班/10/2007的H3的氨基酸变异

＊从起始M编号

毒株：A/威斯康星/67/2005的H3

在该株的4个位置观察到序列变异(表16)。

表16：A/威斯康星/67/2005的H3的氨基酸变异

＊从起始M编号

毒株：B/马来西亚/2506/2004的B型

在两个位置观察到变异(表17)。第120位不是糖基化位点；第 210位参与糖基化；在蛋中培养之后该糖基化被消除。

表17：来自B/马来西亚/2506/2004的血凝素的氨基酸变异

氨基酸编号* MDCK 蛋 120 K N 210 T A

*从SP中部开始编号

毒株：来自B/佛罗里达/4/2006的血凝素；ISDN261649

所观察的变异包括第211位的氨基酸序列变异，这取决于培养系 统。在从MDCK细胞分离的序列中观察到天冬酰胺(N)，而在从蛋分 离的序列中观察到谷氨酸(D)。第211位是糖基化位点，并且在蛋中培 养后被消除。

毒株：来自A/新加坡/1/1957的H2

在6个位置观察到序列变异(表18)。

表18：来自A/新加坡/1/1957的H2的氨基酸变异

从成熟蛋白开始编号

毒株：来自A/越南/1194/2004的H5以及来自A/安徽/1/2005的H5 与这些H5株任一的一级序列比对，未观察到氨基酸序列的变异。

毒株：来自A/水鸭/香港/W312/1997的H6

毒株(AF250179)仅有一个条目可获取。

毒株：来自A/马/布拉格/56的H7

在数据库中总共发现2个序列条目。条目AB298877被排除在外， 因此其是由实验室重组的。

毒株：来自A/香港/1073/1999的H9；AJ404626 在数据库中总计发现2个序列条目。只有一个是完整的。

实施例20.与来自植物分泌蛋白之信号肽融合的流感病毒血凝素的瞬时表 达。

还通过表达融合有来自苜蓿蛋白质二硫键异构酶(PDI；登录号No. Z11499；SEQ.ID.NO：34；图17)之信号肽(SP；32-103位核苷酸)的来自 毒株A/布里斯班/59/2007(H1N1)(质粒#787)、A/新喀里多尼亚/20/1999 (H1N1)(质粒#540)、来自毒株A/布里斯班/10/2007(H3N2)(质粒 790)和A/印度尼西亚/5/2005(H5N1)(质粒#663)的A亚型HA以及来 自毒株B/佛罗里达/4/2006(质粒#798)的B型来研究信号肽修饰对另一些 血凝素之HA累积水平的作用。将PDI SP-血凝素基因融合物组装进质体 蓝素表达盒(来自苜蓿质体蓝素基因的启动子、5′UTR、3′UTR和转录终 止序列)，并将经组装的盒插入pCAMBIA二元质粒中。然后，将该质粒 转染进农杆菌(AGL1)中，分别得到农杆菌菌株AGL1/787、AGL1/540、 AGL1/790、AGL1/663和AGL1/798。

用AGL1/787、AGL1/540、AGL1/790、AGL1/663和AGL1/798渗 入本塞姆氏烟草植物。平行地，用AGL1/774、AGL776、AGL1/660和 AGL1/779渗入一系列植物，用于比较。六天培养期后收获叶，从经渗入 的叶中提取蛋白质，并使用合适的抗HA抗体通过Western印迹进行分析。 与使用其天然信号肽时观察到同样HA的表达相比，使用来自PDI的信号 肽时，来自H1(布里斯班)和H3(布里斯班)之HA的表达大幅增加(分 别为图87b和c)。使用该信号肽替换策略证实了来自亚型H1(毒株A/ 新喀里多尼亚/20/1999)的第三HA的表达(图87a)。信号肽修饰不导致 H5(A/印度尼西亚/5/2005)之HA累积的大幅增加(图87d)，来自毒株 B/佛罗里达/4/2006a的HA则未检测到信号，无论表达所使用的信号肽为 哪种(图87e)。对于检测HA表达的所有条件来说，在分子量约72kDa 处观察到独特的免疫反应条带(图87a至d)，其大小对应于未切割的HA0 前体。

实施例21.CPMV-HT表达盒控制下的HA表达

使用包含来自豇豆花叶病毒(CPMV)RNA2之非翻译序列的表达 盒CPMV-HT(Sainsbury等，2008Plant Physiology148：1212-1218；还参 见WO2007/135480)在转基因植物中表达某些血凝素。在经所述农杆菌 渗入的本塞姆氏烟草植物中在CPMV-HT的控制下表达来自A/新喀里多 尼亚/20/1999(H1)、A/布里斯班/59/2007(H1)、A/布里斯班/10/2007 (H3)、A/印度尼西亚/5/2005(H5)和B/佛罗里达/4/2006(B)的HA。 培养后，收获叶并进行提取，通过Western印迹对蛋白质提取物中的HA 含量进行比较。如图88所示，CPMV-HT表达盒比质体蓝素盒得到更高 的HA表达水平，无论所使用的信号肽为哪种。此外，对于来自毒株B/ 佛罗里达/4/2006的B型来说，使用CPMV-HT表达盒使得能够检测到HA 累积，然而其在质体蓝素盒下表达时在这些免疫检测条件下仍检测不到。

表19：用于表达具有天然或PDI信号肽的流感病毒血凝素的表达盒

实施例22.与Hsp70和Hsp40共表达并与信号肽修饰相组合

将植物来源的胞质Hsp70和Hsp40(构建体#R870)与H1(新喀里 多尼亚，构建体#540)或H3(布里斯班，构建体#790)共表达，二者均 具有植物来源的信号肽(苜蓿PDI信号肽)。用含有AGL1/540、AGL1/R870 和AGL1/35ShcPro(针对H1)或者AGL1/790、AGL1/R870和 AGL1/35ShcPro(针对H3)的混合物(比例为1∶1∶1)的细菌悬液通过农 杆菌渗入本塞姆氏烟草植物进行共表达。用AGL1/540、AGL1/35ShcPro (针对H1)或者AGL1/790、AGL1/35ShcPro(针对H3)的混合物(比 例为1∶2)通过农杆菌渗入对照植物。培养后，收获叶并进行提取，通过 Western印迹对蛋白质提取物中的HA含量进行比较(图89)。在所测试 的条件下，所得结果表明，与Hsp70和Hsp40共表达不增加H1(新喀里 多尼亚)的血凝素累积水平。然而，对于H3(布里斯班)而言，Western 印迹清楚地表明，与胞质Hsp70和Hsp40共表达导致血凝素累积水平的显 著提高。

所有引文通过引用并入本文。

本发明通过一个或多个实施方案进行了描述。然而，对于本领域 技术人员而言显然的是，可在不背离权利要求中所述的本发明范围的情 形下进行多种改动和改进。

以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的 一部分并入此处：

1.核酸，其包含与在植物中有活性之调控区有效连接的编码流感 血凝素(HA)的核苷酸序列。

2.项1的核酸，其中所述HA包含天然或非天然的信号肽。

3.项2的核酸，其中所述非天然的信号肽是蛋白质二硫键异构酶 信号肽。

4.项1的核酸，其中所述HA是A型流感病毒、B型流感或者是A 型流感的亚型，其选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、 H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

5.项1的核酸，其中所述HA来自A型流感，选自H1、H2、H3、 H5、H6、H7和H9。

6.在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：

a)将项1的核酸导入所述植物或植物部分中，以及

b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或植物部分， 从而生产VLP。

7.项6的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，所述核酸在该 植物中瞬时表达。

8.项6的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，所述核酸在该 植物中稳定表达。

9.项6的方法，其还包括以下步骤：

c)收获所述宿主并纯化所述VLP。

10.项6的方法，其中在所述导入步骤(步骤a)中，包含编码一 种或多种伴侣蛋白之核苷酸序列的第二核酸被导入所述植物中。

11.项10的方法，其中所述一种或多种伴侣蛋白选自Hsp40和 Hsp70。

12、在植物中生产流感病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：

a)提供包含项1之核酸的植物或植物部分，以及

b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或植物部分， 从而生产所述VLP。

13、包含项1之核酸的植物。

14.项13的植物，其还包含含有与在植物中有活性之调控区有效连 接的编码一种或多种伴侣蛋白的核苷酸序列的核酸。

15.项14的植物，其中所述一种或多种伴侣蛋白选自Hsp40和 Hsp70。

16.病毒样颗粒(VLP)，其包含流感病毒血凝素(HA)蛋白以及 一种或多种源自植物的脂质。

17.项16的病毒样颗粒(VLP)，其中所述HA是A型流感、B型 流感或者是A型流感的亚型，其选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、 H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

18.项17的VLP，其中所述HA来自A型流感，其选自H1、H2、 H3、H5、H6、H7和H9。

19.组合物，其包含有效剂量的项16之VLP以及可药用载体。

20.诱导对象中针对流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用项16的 病毒样颗粒。

21.项20的方法，其中所述病毒样颗粒经口、皮内、鼻内、肌内、 腹膜内、静脉内或皮下施用给对象。

22.病毒样颗粒(VLP)，其包含具有植物特异性N-聚糖或经修饰 N-聚糖的流感病毒HA。

23.项22的病毒样颗粒(VLP)，其中所述HA是A型流感、B型 流感或者是A型流感的亚型，其选自H1、H2、H3、H4、H5、H6、 H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H16。

24.项23的VLP，其中所述HA来自A型流感，其选自H1、H2、 H3、H5、H6、H7和H9。

25.组合物，其包含有效剂量的项22之VLP以及可药用载体。

26.诱导对象中针对流感病毒感染之免疫的方法，其包括施用项25 的组合物。

27.项26的方法，其中所述组合物经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜 内、静脉内或皮下施用给对象。

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