猪细小病毒VLPs供外源蛋白插入的候选位点发现及其重组PCV2-ORF2的病毒样颗粒构建

摘要

试验中先将PPV SC-1株VP2基因扩增产物克隆到pMD18-T载体构建质粒pMD-VP2；设计两对引物(分别引入HindⅢ和SacⅠ两个酶切位点)扩增PCV2 SC株ORF2基因,构建了pMD-ORF2.A和pMD-ORF2.B两质粒；经相应内切酶酶切后回收目的片段,插入PPV SC-1株VP2基因的HindⅢ和Sac Ⅰ两个特异限制酶切位点处(分别对应于PPVVP2蛋白N端和C端1/3处),得到重组质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B.经鉴定后的质粒pPVP2-ORF2.A和pPVP2-ORF2.B用KpnI、BamHI和ApaLI三酶切,回收含VP2和ORF2基因的目的片段克隆至真核表达载体(pEGFP-C1),得到重组质粒pEG-FP.VO.A和pEGFP.VO.B.脂质体法转染重组质粒于Cos7细胞后,采用荧光显微镜和电镜观察基因表达情况,结果仅在转染pEGFP.VO.A的样品中观察到了病毒样颗粒(VLPs).纯化VLPs免疫小鼠,结果显示能产生较好的细胞免疫和针对PPV、PCV2的特异性体液免疫,该结果表明研究中获得了PCV VP1-PCV2ORF2重组VLPs,同时也揭示PPV VPLs的N端1/3适于外源蛋白插入构建重组VLPs.