一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用

摘要

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用。本发明提供的一种人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体，是缺失疏水区的Tat△(31-45)突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供了该Tat蛋白突变体在制备HIV免疫原、预防和治疗性HIV疫苗、HIV检测试剂盒中的应用，本发明的Tat△(31-45)突变体蛋白及其金标体颗粒均有助于该蛋白构象的稳定、免疫原性的增强以及该蛋白N端和第46-61位氨基酸表位的展示，有望作为HIV疫苗开发和HIV感染检测诊断的候选抗原。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种缺失疏水区的人类免疫 缺陷病毒I型（HIV-1）Tat蛋白突变体序列，及其在制备HIV免疫原中、在制 备预防和治疗性HIV疫苗中、在制备HIV检测试剂盒中的应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）主要经血液、性 接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合征（AIDS），即艾滋 病。据联合国艾滋病规划署2012年的统计，全球HIV感染者约3400万，我国 现存HIV感染者和艾滋病病人约38万，艾滋病已经成为我国及全球所面临的 重大公共卫生问题。目前采用高效抗逆转录病毒疗法（HAART）虽能延缓艾 滋病病情的发展，但不能完全清除病毒；行为干预也仅减缓HIV感染传播速度 而无法终止其流行。因此，迫切需要开发研制新的有效的药物以控制HIV的传 播和感染。感染人类的HIV有HIV-1和HIV-2两型，两者核苷酸序列相差可 超过40%。世界各地主要流行的是HIV-1，HIV-2则主要流行在非洲西部地区。

HIV-1转录反式激活因子（trans-activator of transcription,Tat）是HIV-1感 染早期产生的重要调控蛋白。根据HIV-1毒株的不同，Tat蛋白由86-101个氨 基酸残基组成，由两个独立的外显子编码：第1个外显子编码1-72位氨基酸 （aa），具有完全的转录激活活性；第2外显子编码Tat C末端区（73-101aa）。 试验证实Tat在HIV-1复制、扩散及致病中起重要作用。研究表明，在感染细 胞内，Tat可反式激活HIV基因组转录的起始和延长，从而启动和促进病毒的 复制；而分泌和释放至细胞外的Tat还具有多样的胞外活性，如参与免疫抑制、 神经系统损伤及Kaposi肉瘤形成等致病过程，被称为“病毒毒素”（参见文献: Silvers JM,Aksenova MV,Aksenov MY,Mactutus CF,Booze RM.Neurotoxicity of HIV-1Tat protein:involvement of D1dopamine receptor.Neurotoxicology.2007; 28(6):1184-1190.)。Tat上述生物学特性及致病效应已使其成为HIV预防性及 治疗性疫苗的候选抗原之一。

HIV-1Tat分子为天然非折叠蛋白，属于无规卷曲类型的分子。虽然Tat序 列在HIV-1不同亚型间具有高度保守性，但其缺乏稳定二级结构和高级结构， 使其分子构象极不稳定，处于快速动态的变化之中。天然Tat作为HIV疫苗的 候选抗原尚存在诱发免疫保护性抗体滴度低、交叉反应性差等不足。

因此通过分子生物学手段，对HIV-1天然Tat分子结构进行改造，是获得 分子构象相对稳定的新型Tat免疫原的一条有效途径，具有潜在的HIV疫苗开 发价值。本申请人已于2011年3月25日申请了中国发明专利，涉及三种人类 免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列：Tat突变体抗原1（Tat1-37）由37个 氨基酸组成；Tat突变体抗原2（Tat1-61）由61个氨基酸组成；Tat突变体抗 原3（Tat22-101）由80个氨基酸组成（参见中国专利申请CN201110074185.7， 发明名称为“人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用”，申请公布 号为CN102206255A，申请公布日为2011年10月5日）。

发明内容

本发明的目的在于进一步深入地对HIV-1天然Tat分子结构进行改造，寻 找分子构象稳定的新的Tat蛋白突变体序列，并提供该Tat蛋白突变体序列在 制备HIV免疫原中、在制备预防和治疗性HIV疫苗中、在制备HIV检测试剂 盒中的应用。

本申请人通过对Tat蛋白进行疏水性分析发现，Tat第31-45位氨基酸具 有较强的疏水性，其余部分均有较强的亲水性（图1）。鉴于Tat31-45肽段的 疏水性对于Tat蛋白的表达有较大的影响，申请人设想通过分子生物学手段， 对HIV-1天然Tat分子结构进行改造，截去Tat蛋白中疏水区段，有望提高Tat 蛋白的表达量并获得分子构象相对稳定的新型Tat免疫原，具有潜在的HIV疫 苗开发和HIV感染检测诊断价值。

本发明的第一方面，是提供了一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat 蛋白突变体序列（以下也称TatΔ(31-45)或TatΔ(31-45)突变体或TatΔ(31-45)序 列）：

TatΔ(31-45)突变体由86个氨基酸组成，其氨基酸序列为：

H₂N—MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCSYGRKKRRQRRRA HQNSQTHQASLSKQPASQPRGDPTGPKESKKKVERETETDPVD—COOH （SEQ ID NO:1）；

编码TatΔ(31-45)突变体的核苷酸序列为：

5′-ATGGAACCGGTTGACCCGCGTCTGGAACCGTGGAAACACCCGGG TTCTCAGCCGAAAACCGCTTGCACCAACTGCTACTGCAAAAAATGCTCTT ACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGCTCACCAGAACTCTCA GACCCACCAGGCTTCTCTGTCTAAACAGCCGGCTTCTCAGCCGCGTGGTG ACCCGACCGGTCCGAAAGAATCTAAAAAAAAAGTTGAACGTGAAACCG AAACCGACCCGGTTGAC-3′（SEQ ID NO:2）。

本发明的第二方面，是提供了上述缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat 蛋白突变体序列及其编码基因在制备HIV免疫原中的应用。

进一步地，本发明还提供了上述一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型 Tat蛋白突变体序列及其编码基因在制备预防和治疗性HIV疫苗中的应用。

进一步地，本发明还提供了上述一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型 Tat蛋白突变体序列及其编码基因在制备HIV检测试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，是要制备得到一种不含Tat疏水区（Tat第31-45位氨 基酸）的原核表达量高、构象相对稳定并能诱导产生更强免疫反应的新型HIV-1 Tat免疫原。

本发明通过拼接PCR方法获得人类免疫缺陷病毒I型（HIV-1）HXB2株 天然Tat（参见文献：Opi S,Péloponèse JM Jr,Esquieu D,Campbell G,de Mareuil J,Walburger A,Solomiac M,Grégoire C,Bouveret E,Yirrell DL,Loret EP.Tat HIV-1primary and tertiary structures critical to immune response against non-homologous variants.J Biol Chem.2002;277(39):35915-35919.）分子高疏水 区段第31-45位氨基酸缺失的TatΔ(31-45)DNA片段，构建其原核表达质粒， 经过转化大肠杆菌（E.coli）BL21(DE3)，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达，经SDS-PAGE凝胶 电泳分析和Western blot鉴定正确后，与直平均径75±15nm的胶体金颗粒结 合形成一种构象相对稳定并能诱导产生更强免疫反应的新型HIV-1TatΔ(31-45) 免疫原复合物。

本发明的TatΔ(31-45)突变体与天然全长HIV-1Tat抗原及Tat N末端缺失 的Tat22-101蛋白相比，HIV-1TatΔ(31-45)突变体蛋白的原核表达量显著增加， 构象更加稳定，实验结果表明抗HIV-1TatΔ(31-45)小鼠抗血清与HIV-1全长Tat 蛋白呈特异性反应；而且能诱导产生更强的针对HIV-1Tat N端的免疫反应。 此外，与HIV-1TatΔ(31-45)突变体蛋白相比，HIV-1TatΔ(31-45)结合胶体金形 成的金标体免疫复合物具有更强的免疫原性，抗TatΔ(31-45)金标体小鼠抗血清 与Tat38-61的免疫反应明显增强。

本发明的具体技术方案如下：

（1）以Overlap PCR的方法全基因合成tat1-101-HCVC122-191 DNA片段， 胶回收试剂盒回收PCR产物，经Ase I和BamH I两种限制性内切酶酶切并回 收目的片段，再与同样经Ase I和BamH I酶切后的pPEPTIDE载体（图2）连 接，连接产物转化E.coli Top10感受态细胞。抽提单克隆转化菌落的质粒并进 行序列鉴定，测序正确的重组质粒命名为pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)。

（2）以pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)质粒为模板，用PCR方法扩增两 个DNA片段tat1-30和tat46-101-HCVC(122-191)，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检 测，DNA片段大小与理论值相符，分别为90bp、381bp。以上述两片段为模 板，用Overlap PCR扩增tat△(31-45)-HCVC(122-191)。经1.5%琼脂糖凝胶电 泳检测，结果PCR扩增DNA片段大小与理论值相符，为471bp。再以tat(△ 31-45)-HCVC(122-191)为模板，经PCR扩增目的基因，经1.5%琼脂糖凝胶电 泳检测，结果PCR扩增DNA片段大小与理论值相符，为258bp。

（3）用胶回收试剂盒回收PCR产物，分别经Nco Ⅰ和BamH Ⅰ两种限制 性内切酶酶切并回收目的片段，再与同样经Nco Ⅰ和BamH Ⅰ酶切后的表达载 体pET32a连接，连接产物转化E.coli Top10感受态细胞。抽提单克隆转化菌 落的质粒并进行酶切鉴定和序列鉴定，测序正确的重组质粒命名为pET32a-Tat △(31-45)。

（4）用上述重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，经 SDS-PAGE检测和Western blot试验，结果表明表达的突变体融合蛋白Tat△ (31-45)-PET的分子量大小与理论值相符，为27.6千道尔顿（KDa），经Glyko BandScan5.0软件分析目的蛋白的表达量约占菌体总蛋白比例为55.0%。通过 亲和层析法对上述蛋白进行纯化，经Glyko BandScan5.0软件分析显示纯度为 90.0%。

（5）用上述亲和层析法纯化的Tat△(31-45)-PET蛋白标记平均直径大小 为75nm的胶体金颗粒，形成Tat△(31-45)-PET蛋白金标体免疫复合物。经不 同pH条件下NaCl聚沉实验证明Tat△(31-45)-PET蛋白金标体免疫复合物能在 生理pH条件下保持稳定。

（6）用以上制备的Tat△(31-45)-PET蛋白和Tat△(31-45)-PET蛋白金标体 免疫复合物分别经皮下注射C57BL小鼠，首次免疫用弗氏完全佐剂,第二、三、 四次用不完全弗氏佐剂，间隔两周免疫1次，最后一次免疫两周后摘除眼球取 血，离心后取上清于-40℃保存。

（7）取上述两种免疫小鼠抗血清(抗Tat△(31-45)-PET、抗Tat△(31-45) -PET金标体免疫复合物)分别检测与HIV-1全长Tat蛋白（用pPEPTIDE2载体 表达）、Tat N末端融合表达抗原Tat1-21-PEP、Tat38-61-PEP、Tat C末端融合 表达抗原Tat60-101-PEP的反应性。经酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，该2 种小鼠抗血清均与HIV-1全长Tat蛋白呈特异性反应，标记胶体金后对Tat△ (31-45)-PET蛋白的免疫原性有增强作用。

经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定，表明本发明的HIV-1Tat突变体蛋 白Tat△(31-45)-PET得到了较高表达。经ELISA试验验证，表明抗该发明的 Tat△(31-45)-PET蛋白和Tat△(31-45)-PET金标体免疫复合物的小鼠抗血清与 HIV-1全长Tat蛋白呈特异性反应，其中抗Tat△(31-45)-PET小鼠血清与HIV-1 Tat N端、Tat C端和Tat38-61的反应性比与全长Tat蛋白的反应性更强，提示 Tat△(31-45)可作为一种新的Tat免疫原，能诱导产生有更高滴度的针对Tat N 端、Tat C端和Tat38-61的抗体，有望达到阻断野生型Tat蛋白生物学功能的作 用，可用以制备抗HIV感染多肽药物的组成成分或作为制备HIV Tat疫苗的候 选抗原。此外，抗Tat△(31-45)蛋白金标体免疫复合物抗血清与HIV-1全长Tat 蛋白的反应性强于抗Tat△(31-45)血清，而且与HIV-1Tat N端、Tat C端和 Tat38-61的反应性比与全长Tat蛋白的反应性更强，表明缺失疏水区的Tat△ (31-45)突变体蛋白及其金标体颗粒均有助于该蛋白构象的稳定、免疫原性的增 强以及该蛋白N端、C端和第38-61位氨基酸表位的展示，有望作为HIV疫苗 开发和HIV感染检测诊断的候选抗原。

附图说明

图1是用DNAssist Version2.2软件分析Tat蛋白疏水性结果

其中：纵坐标代表亲疏水性，正值代表疏水，负值代表亲水。第31-45 位氨基酸（椭圆区域）具有较强的疏水性，其余区域均具有较强的亲水性。

图2是pPEPTIDE表达载体图谱

其中：其N端融合高效表达的163个氨基酸及His标签的50个氨基酸，含 Ase I和BamH I克隆位点用于目的片段的插入。该载体适用于小分子量多肽或 蛋白的表达。

图3是PCR扩增Tat△(31-45)DNA片段的琼脂糖电泳图

其中：M,DL2000Marker（从上至下DNA片段大小依次为2000bp、1000 bp、750bp、500bp、250bp和100bp）；1，tat1-31；2，tat(45-101)-HCVC(122-191)； 3，tat△(31-45)-HCVC(122-191)；4，Tat△(31-45)。

图4是重组表达质粒pET32a-Tat△(31-45)的酶切鉴定结果

其中：M,DL5000 Marker（从上至下DNA片段大小依次为5000bp、3000 bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp）；1，空载 体pET32a；2，pET32a经Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后产物；3，未酶切 tat△(31-45)；4，tat△(31-45)经Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后产物；5，未酶切 pET32a-Tat△(31-45)；6，pET32a-Tat△(31-45)经Nco Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后产物。

图5是Tat△(31-45)突变体融合蛋白原核表达产物及其纯化后SDS-PAGE分析结 果

其中：M,蛋白Marker；1，pET32a-Tat△(31-45)未经IPTG诱导表达产物（细 胞裂解液上清）；2，pET32a-Tat△(31-45)经IPTG诱导表达产物；3，BL21(DE3) 空菌裂解液上清（阴性对照）；4，纯化后Tat△(31-45)目的融合蛋白（27.6kDa）。

图6是Tat△(31-45)突变体融合蛋白Western blot鉴定结果

其中：M，蛋白预染Marker；1，纯化后Tat△(31-45)-PET融合蛋白；2， 全长Tat-PET融合蛋白（阳性对照）；3，pET32a载体蛋白（阴性对照）。

图7是用透射电镜检测制备的胶体金颗粒大小和均一度结果

其中：胶体金平均粒径为75.0±15nm，没有成团聚集情况，均一度良好。

图8是四种小鼠抗血清（抗Tat-PEP、抗Tat△(31-45)-PET、抗Tat△(31-45)-PET 金标体复合物和正常小鼠血清）与HIV-1全长Tat融合蛋白（Tat1-101-PEP） 反应的抗体滴度测定结果

图9是四种小鼠抗血清（抗Tat-PEP、抗Tat△(31-45)-PET、抗Tat△(31-45)-PET 金标体复合物和正常小鼠血清）分别与3种HIV-1Tat突变体抗原 （Tat1-21-PEP、Tat38-61-PEP和Tat60-101-PEP）的反应性结果

其中：A，抗Tat小鼠抗血清（抗Tat-PEP、抗Tat△(31-45)-PET、抗 Tat△(31-45)-PET金标体复合物）分别与Tat N端抗原Tat1-21-PEP的反应性； B，抗Tat小鼠抗血清（抗Tat-PEP、抗Tat△(31-45)-PET、抗Tat△(31-45)-PET 金标体复合物）分别与Tat38-61-PEP的反应性；C，抗Tat小鼠抗血清（抗 Tat-PEP、抗Tat△(31-45)-PET、抗Tat△(31-45)-PET金标体复合物）分别与Tat C端抗原Tat60-101-PEP的反应性。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限 于此。

实施例1：通过重组质粒的构建、原核表达获得能一种缺失疏水区的Tat蛋白

1.1、目的基因的体外合成

以Overlap PCR的方法全基因合成tat1-101-HCVC122-191 DNA片段，胶 回收试剂盒回收PCR产物，经Ase I和BamH I两种限制性内切酶酶切并回收 目的片段，再与同样经Ase I和BamH I酶切后的pPEPTIDE（购自TAKARA 公司）载体（图2）连接，连接产物转化E.coli Top10感受态细胞。抽提单克 隆转化菌落的质粒并进行序列鉴定，测序正确的重组质粒命名为 pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)。

用PCR方法体外合成编码Tat1-31和Tat46-101-HCVC(122-191)肽段的 DNA片段。PCR反应体系包括：模板pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)质粒10ng； 分别以引物Tat-U和Tat31-D、Tat45-U和T7-Terminator为上下游引物各取2μl （浓度为0.01mM）（引物序列见表1）；Taq酶1.5U，dNTP100μmol，Mg²⁺3 mmol，反应体积50μl。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s， 72℃40s，30个循环；72℃10min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进 行检测，结果PCR扩增的2个目的片段（tat1-31和tat46-101-HCVC(122-191)） 大小与理论值相符，分别为90bp、381bp（图3第1、第2泳道）。

以上两PCR产物原液为模板Overlap PCR扩增tat1-101(△ 31-45)-HCVC(122-191)DNA片段。PCR反应体系包括：模板为上一步PCR原 液各2.5ul；引物Tat-U和T7-Terminator为上下游引物各取2μl（浓度为0.01 mM）（引物序列见表1）；Taq酶1.5U，dNTP100μmol，Mg²⁺3mmol，反应 体积50μl。PCR扩增条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃40s， 30个循环；72℃10min。经1.5%琼脂糖凝胶电泳对Overlap PCR产物进行检 测，结果Overlap PCR扩增的目的片段tat1-101(△31-45)-HCVC(122-191)大小 与理论值相符，为471bp（图3第3泳道）。

再以tat1-101(△31-45)-HCVC(122-191)为模板，PCR扩增目的基因 Tat1-101(△31-45)，模板为上Overlap PCR产物2.5ul；分别以引物Tat-U和Tat-D 为上下游引物各取2μl（浓度为0.01mM）（引物序列见表1）；Taq酶1.5U， dNTP100μmol，Mg²⁺3mmol，反应体积50μl。PCR扩增条件为：94℃5min； 94℃30s，57℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min。经1.5%琼脂糖凝 胶电泳检测，结果PCR扩增tat1-101(△31-45)DNA片段大小与理论值相符， 为258bp（图3第4泳道）。

表1体外合成目的基因的引物名称及其序列

1.2、重组表达载体的构建

用胶回收试剂盒3S DNA Gel Purification Kit3.1（购自上海TIANGEN公 司）回收DNA片段后，用Nco Ⅰ和BamH Ⅰ两种限制性内切酶进行双酶切以 获得含粘性末端的目的基因。酶切反应体系包括：DNA片段25μl（6μg），Nco Ⅰ和BamH Ⅰ各2.5μl（25U），10×K Buffer5μl，1mg/ml BSA5μl，无菌双蒸 水10μl，反应总体积50μl。将酶切后的目的基因与同样用NcoⅠ和BamH Ⅰ双 酶切的表达载体pET-32a（购自TAKARA公司）连接。连接条件：目的基因与 pET-32a载体以摩尔比1:1比例连接，按总体积20μl的1/10加入高效连接液2 μl于16℃连接16h。取连接产物10μl转化感受态细胞E.coli Top10（购自上 海杰李生物有限公司）。提取单克隆转化菌落质粒进行酶切及测序鉴定。酶切 鉴定的反应体系：重组表达质粒15μl，Nco Ⅰ和BamH Ⅰ各1.5μl，10×K buffer 3μl，无菌双蒸水9μl，反应总体积30μl，于37℃酶切2h，经1.5%琼脂糖凝 胶电泳检测（图4）。对经酶切鉴定结果阳性的单克隆质粒，委托上海杰李生物 科技有限公司进行序列测定。测序结果用DNASTAR软件分析，测序正确的重 组质粒分别命名为pET32a-Tat(△31-45)。

1.3、Tat(△31-45)融合蛋白的表达和纯化

常规氯化钙法制备大肠杆菌BL21-TRXB(DE3)感受态细菌；取上述重组质 粒pET32a-Tat(△31-45)200ng加至200μl感受态细菌BL21-TRXB(DE3)（购 自上海杰李生物有限公司）中，冰水浴30min，42℃、90s，再冰水浴1-2min 后加800μl的LB培养基于37℃、150rpm培养1h后涂LB培养基平板（含 100μg/ml Amp和35μg/ml Kana），于37℃培养过夜。次日挑取单克隆转化菌 落接种至3ml LB液体培养基（含100μg/ml Amp和35μg/ml Kana），于37℃、 150rpm振荡培养过夜后，取500μl过夜菌液，加500μl甘油制备甘油保存菌 种于-20℃保存；另按1:10的接种量将过夜培养的菌液转接到新鲜的3ml LB 培养基中（含100μg/ml Amp和35μg/ml Kana），于37℃、220rpm振荡培养 3h至OD₆₀₀为1.0时，加1M的IPTG3μl至终浓度1mM，诱导培养4h，于 10000rpm离心3min，弃上清，沉淀加300μl0.01M磷酸盐缓冲液（PBS） 重悬后，取20μl PBS重悬液加入2×SDS点样液20μl混匀，制成SDS样品， 同时收集未经IPTG诱导的菌液及空菌BL21-TRXB(DE3)培养液按同法制成 SDS样品后，进行SDS-PAGE电泳检测：制备12%SDS聚丙烯酰胺凝胶，将 上述SDS样品及蛋白标准品沸水浴5分钟，加样，初始加压5V/cm，待溴酚蓝 进入分离胶后提高至12V/cm，直至溴酚蓝达分离胶底部。电泳结束，取出凝 胶用考马斯亮蓝染色过夜，再置于甲醇-冰醋酸溶液中脱色3-4小时。结果可见 含有重组质粒pET32a-Tat(△31-45)的克隆在相对分子质量约27.6千道尔顿 （KDa）处表达目的融合蛋白条带，未经IPTG诱导的菌液及空菌BL21-TRXB (DE3)培养液未见该条带。经Glyko BandScan5.0软件分析，蛋白的表达量约占 菌体总蛋白比例分别为55%。随后对阳性细菌克隆进行大量诱导表达及纯化： 将含pET32a-Tat(△31-45)/BL21甘油菌种按照1:10接种量接种至50ml LB培 养基中（含100μg/ml Amp和35μg/ml Kana），于37℃、170rpm振荡培养 过夜后，转接至新鲜的450ml LB中（含100μg/ml Amp和35μg/ml Kana）， 于37℃、220rpm振荡培养3.5h至OD₆₀₀为1.0，之后加1M IPTG500μl至 终浓度为1mM，再于37℃、220rpm振荡培养4h后收集菌液，于4℃、5000 rpm离心10min，弃上清，沉淀加入30ml8M尿素（pH8.0）裂解，于4℃过 夜。次日，裂解产物于4℃、10000rpm离心30min，取上清至另一离心管中， 取其中20μl上清液加2×SDS点样液20μl混匀制成SDS样品后，经12％ SDS-PAGE电泳检测分析；取上清过金属螯合亲和层析介质柱(Ni-NTA，购自 德国QIAGEN公司），Ni-NTA柱以8M尿素（pH8.0）平衡，尿素裂解液上 清上柱，8M尿素（pH7.0）洗柱，以8M尿素（pH4.5）洗脱，收集洗脱峰， 用0.1M Tris中和，以PBS透析，经12％SDS-PAGE分析纯化效果，结果显示 在相对分子量约27.6KDa处可见清晰目的融合蛋白条带，经Glyko BandScan5.0软件分析显示重组蛋白纯化后纯度为90.0%（图5）。

1.4、Tat(△31-45)融合蛋白的Western blot检测

取出SDS-PAGE电泳凝胶作适当修剪，浸泡于转移缓冲液中准备转膜；剪 12张与凝胶大小一致的滤纸与1张硝酸纤维素膜，带手套操作，将滤纸与硝酸 纤维素膜用转膜缓冲液浸泡15分钟后，将6张滤纸整齐叠放，凝胶置于其上 （靠近负极），将硝酸纤维素膜（靠近正极）置于凝胶上，再叠放6张滤纸， 在300mA条件下进行蛋白稳流转膜50min；转膜结束后加适量封闭液（含0.01 mol/L PBS、10%脱脂奶粉、0.1%Tween-20、0.2%柳硫汞）于4℃封闭过夜； 用PBST洗液洗涤5次，加入小鼠抗Tat单克隆抗体（购自abcam公司）（1:1000 稀释），37℃孵育2h，漂洗液洗5次，加入辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗 鼠IgG-HRP（购自abcam公司）(1:1000稀释)，37℃孵育45min，漂洗液洗 涤5次，加入底物二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）显色5-10分钟， 出现棕色条带后立即用蒸馏水冲洗，终止显色反应。结果可见Tat(△31-45)-PET 融合蛋白和全长Tat融合蛋白均与小鼠抗Tat单克隆抗体呈阳性反应，而 pET32a载体蛋白则无此反应（图6）。

实施例2：通过制备和标记获得Tat蛋白金标体免疫复合物，并对其进行质量 鉴定。

2.1、胶体金的制备

0.01%氯金酸溶液100ml加热至沸腾，200rpm搅动下准确加入1%柠檬酸 三钠0.7ml，金黄色氯金酸溶液变成紫红色。继续加热搅拌15min，冷却后定 容到100ml。

2.2、电子显微镜检测胶体金颗粒大小和均一度

透射电子显微镜检测胶体金颗粒大小和均一度，发现胶体金平均颗粒直径 为75nm，均一度较好（图7）。

2.3、Tat△(31-45)-PET蛋白标记胶体金溶液

取纯化后Tat(△31-45)-PET蛋白对0.005Mol/L pH 9.0NaCl溶液4℃透析9小 时后测定蛋白浓度。以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调节胶体金溶液pH值到 9.6，搅拌加入透析后Tat(△31-45)-PET蛋白直到溶液不再被10%NaCl聚沉为 止，1200rpm离心10min，分离上清和沉淀，测定上清中蛋白浓度后，加入适 量上清重悬沉淀配成蛋白吸附量为0.1mg/ml的Tat(△31-45)-PET蛋白金标体溶 液备用。

2.4、NaCl聚沉实验鉴定Tat△(31-45)蛋白金标体稳定性

取以上金标体溶液2管，每管50ul，各加入5ul10％NaCl溶液后静置2h，观 察聚沉情况。结果发现未结合Tat△(31-45)-PET蛋白的胶体金溶液在加入10％ NaCl溶液后发生聚沉，溶液颜色由酒红色变为蓝灰色，而结合了足量 Tat△(31-45)-PET蛋白的胶体金溶液在加入10％NaCl溶液后保持稳定，溶液颜 色不发生变化，仍保持酒红色。

2.5、NaCl聚沉鉴定不同pH条件下Tat△(31-45)蛋白金标体稳定性

取以上金标体溶液7管，每管50ul，各加入5ul10％NaCl溶液后0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调节其pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、 10.0、11.0、12.0、13.0。静置2h，观察聚沉情况。结果发现Tat(△31-45)-PET 蛋白金标体在pH5.0-11.0范围内均能保持稳定，不发生聚沉。当pH值小于5.0 或大于11.0时，加入10％NaCl溶液后，溶液颜色由酒红色变为蓝灰色，表明 Tat△(31-45)-PET蛋白金标体复合物发生聚沉。

实施例3：通过动物免疫试验检测Tat突变体免疫原性的改变及胶体金标记对 其表位展示的影响

3.1、动物免疫实验

初次免疫取纯化后全长Tat-PET、Tat(△31-45)-PET融合蛋白和Tat(△ 31-45)-PET蛋白金标体各100μl（蛋白含量均为0.01mg）分别与弗氏完全佐 剂等体积混合后，于脚掌和腹部皮下注射免疫健康雌性六周龄C57BL小鼠（第 二军医大学实验动物中心），每组5只实验小鼠；之后每2周进行一次加强免 疫，免疫用弗氏不完全佐剂，共加强免疫3次，方法及剂量均与初次免疫相同。 同时设立胶体金和生理盐水对照组。最后一次免疫两周后摘除眼球取血，约1.2 ml/只，10000rpm离心10min，取上层血清于-40℃冻存备用。

3.2、免疫小鼠血清的ELISA检测

将纯化的HIV-1全长Tat融合蛋白（Tat1-101-PEP）及3种Tat突变体融合 蛋白（Tat1-21-PEP、Tat38-61-PEP和60-101-PET）分别用50mM碳酸盐缓冲 液（pH9.6）按1:200稀释包被96孔酶联反应板，每种抗原包被5排复孔，0.5 μg/孔，37℃孵育2h，弃包被液，加180μl10%脱脂奶粉于37℃封闭2h， 用PBST洗液洗涤4次后，分别加入1:2倍比稀释的小鼠抗Tat1-101-PET血清、 抗Tat(△31-45)-PET血清、抗Tat(△31-45)-PET蛋白金标体血清、胶体金溶液 组小鼠血清和生理盐水组小鼠血清各100μl，最后1孔不加，37℃孵育45min， 用PBST洗涤5次，加入HRP标记的羊抗兔IgG(1:1000稀释)，100μl/孔，37℃ 孵育45min，PBST洗涤5次，经3,3′,5,5′-四甲基联苯胺 （3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine,TMB）显色，加2mol/L硫酸终止反应，用酶 标仪（Bio Rad）于450nm波长处测定吸光度值（A₄₅₀）。用生理盐水组小鼠血 清作为阴性对照，以高于阴性对照A₄₅₀值3倍的数值作为阳性判断标准。

抗Tat(△31-45)蛋白小鼠抗血清和抗Tat(△31-45)蛋白金标体小鼠抗血清均 与HIV-1全长Tat蛋白呈特异性反应，标记胶体金后可明显增强Tat(△31-45) 蛋白的免疫原性（图8）。

与抗全长Tat小鼠抗血清相比，Tat(△31-45)及其金标体免疫小鼠抗血清均 与Tat N端和Tat38-61抗原的反应性增强（图9A、9B）；Tat(△31-45)标记胶体 金后免疫小鼠抗血清与Tat38-61抗原的反应性更强（图9B）；抗全长Tat、抗 Tat(△31-45)和抗Tat(△31-45)金标体三者小鼠抗血清与Tat60-101反应性均明 显高于对照组，但三者之间无明显差异（图9C）。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还 会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发 明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。