表面修饰功能性基团的金磁纳米微粒的制备方法

摘要

本发明提供一种表面修饰功能性基团的金磁纳米微粒的制备方法，使修饰的金磁纳米微粒既具有较强的磁性，良好分散性和稳定性，易生物分子固定化，同时又具有良好的化学惰性及生物相容性的特点。该制备方法包括以下步骤：（1）将Fe3O4/Au/Fe3O4金磁纳米微粒与表面活性剂混合均匀，加入适量盐酸，调节pH值为1.0~4.0，200rpm搅拌均匀；磁性分离去除上清；（2）将步骤（1）制备得到的表面正电荷的Fe3O4/Au核壳型金磁纳米微粒与包含所要修饰功能性基团的高分子聚合物溶液混合，搅拌均匀；反应完毕后，磁性分离，得到沉淀物，最终制备得到表面修饰功能性基团的金磁纳米微粒。

说明书

技术领域

本发明属于材料合成领域，涉及一种可用于构建功能化纳米材料的制备 方法，具体涉及一种表面修饰功能性高分子聚合物的金磁纳米颗粒的制备方 法。

背景技术

金磁纳米微粒是指兼有Fe₃O₄纳米粒的超顺磁性和纳米金优异性能的纳米 级复合材料。这种材料以纳米Fe₃O₄或Fe₃O₄聚集体作为内核，在外加磁场中具 有磁响应性，在磁性内核表面包裹一层Au壳，使得复合材料具有诸多优点， 如独特的光学特性、优良的生物相容性、化学惰性以及易于多种生物分子固 定化等。因此，核壳型Fe₃O₄/Au在生物与医学领域、电磁学领域都具有良好的 应用前景。

中国发明专利03153486.4用有机试剂处理磁性复合微粒的磁性核心部 分，然后将纳米级的贵金属微粒在核心磁性微粒表面组装，制备得到了组装 型磁性复合材料，该微粒具有良好的磁学性能，但尺寸达到了微米级。中国 发明专利200810029399.0报导了采用化学共沉淀法制备磁性Fe₃O₄纳米粒子， 并用硅烷偶联剂对磁性粒子表面进行改性，然后以改性的磁性Fe₃O₄为种子， 以油胺为还原剂，在超声条件下将金离子在磁性纳米粒子表面还原为单质金， 制备得到纳米粒子。此法可得到粒径为30~50nm的具有核壳结构的金磁纳米 微粒，其饱和磁化强度为6.8~17.6emu/g，磁响应性较弱。

中国发明专利201110326087以带有亲水基团的聚丙烯酸为表面活性剂， 调节pH值后，对该体系进行溶剂热处理，即可获得表面修饰的超顺磁 MFe2O4(M＝Fe,Co,Ni,Cu,Mn,Zn)。该方案中采用的原材料是分散于油相中 的纳米级材料，在超顺磁颗粒的合成过程中加入聚丙烯酸作为相转移剂，并 起到了一定分散稳定作用，但进行表面修饰时所涉及的制备步骤较多，使得 过程较复杂，不便于操作。另外，作者提出制备所得的材料具有靶向药物输 运、细胞磁分离等领域应用，但文中并未给出制备具体的材料表面形貌（影 响生物分子活性的最重要因素），其公开的方案不能体现所制备得到的产品是 否可用于生物分子偶联。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表面修饰功能性基团的金磁纳米微粒的制备 方法，使修饰的金磁纳米微粒既具有较强的磁性，良好分散性和稳定性，易 生物分子固定化，同时又具有良好的化学惰性及生物相容性的特点。

本发明中用以表面修饰的金磁纳米微粒具有花瓣状，即核/壳/花瓣型结 构，包括磁性Fe₃O₄内核、具有化学惰性与良好生物相容性的Au壳和外部吸 附的Fe₃O₄种子，通常表示为Fe₃O₄/Au/Fe₃O₄。采用表面活性剂对金磁纳米微 粒进行预分散，去除外周的Fe₃O₄花瓣，得到Fe₃O₄/Au核壳结构。吸附于核 壳结构表面的阳离子表面活性剂带有正电荷，可将含羧基的阴离子型高聚物 包覆于材料表面。表面修饰后，得到了表面带有功能基团的亲水性聚合物修 饰的新型金磁纳米结构。功能性基团的引入，赋予了材料在偶联生物分子时 的极大便利，即新型金磁纳米微粒不但可以通过物理吸附方法，还可以通过 碳二亚胺（EDC）化学键合作用与生物分子偶联，构建生物分子功能化的金 磁纳米微粒，使其成为适用于体外诊断和磁性成像的理想载体。

因此，本发明中的表面修饰过程是首先采用表面活性剂预分散，然后亲 水型高分子聚合物包裹两步。具体按照以下步骤进行：

（1）表面活性剂预分散以制备Fe₃O₄/Au核壳型金磁纳米微粒

将Fe₃O₄/Au/Fe₃O₄金磁纳米微粒与表面活性剂混合均匀，加入适量盐酸， 调节pH值为1.0~4.0，200rpm搅拌均匀。磁性分离去除上清，洗涤沉淀三次， 得到表面正电荷的Fe₃O₄/Au核壳型金磁纳米微粒；

（2）对Fe₃O₄/Au核壳型金磁纳米微粒进行功能化聚合物的表面修饰

将步骤（1）制备得到的表面正电荷的Fe₃O₄/Au核壳型金磁纳米微粒与包 含所要修饰功能性基团的高分子聚合物溶液混合，200rpm搅拌均匀；反应完 毕后，磁性分离，得到沉淀物，将沉淀物用超纯水洗涤三次，以缓冲液重悬， 制备得到表面修饰功能性基团的金磁纳米微粒。

对上述方案还可做进一步优化限定和改进如下：

步骤（1）中所述的表面活性剂为二甲基二十八烷基溴化铵(DOAB)、三- 十八烷基甲基溴化铵(TOAB)、十八烷基三甲基溴化铵(STAB)、十六烷基三甲 基溴化铵（CTAB），浓度为5~100mmol/L。

上述阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵时，其浓度为5~50 mmol/L；调节pH值为1.0~4.0，搅拌10min。

步骤（2）中所述高分子聚合物为带有负电荷，且含有大量羧基的聚合物， Fe₃O₄/Au/Fe₃O₄金磁纳米微粒直径：高分子聚合物分子量=1nm：100~500 g/mol。

步骤（1）采用直径为30nm的Fe₃O₄/AuFe₃O₄金磁纳米微粒，步骤（2） 采用的高分子聚合物分子量在3000~15000g/mol。

上述高分子聚合物为1-十八烯马来酸酐、聚丙烯酸、聚丁基丙烯酸钠、 聚（3-噻吩乙酸钠）或聚甲基丙烯酸。

所采用的聚丙烯酸与Fe₃O₄/Au/Fe₃O₄金磁纳米微粒的质量比为1：0.1~1： 2，最佳比例为1：0.2。

为验证本发明制备所得产品偶联生物分子的效果，可以按照如下方式计 算偶联率及偶联量：

偶联量（μg/mg）=总量（μg）×偶联效率（%）/GoldMag用量

吸取制备得到的表面修饰所得的金磁纳米微粒加入缓冲液，用移液器吹 打混匀，在磁性分离架上进行磁性分离，弃上清。以缓冲液重悬后，超声混 匀，再向复合微粒中加入碳二亚胺溶液，超声反应一定时间后；再次加入碳 二亚胺反应5min，加入抗体溶液；超声反应。向复合微粒中加入清洗缓冲液 并吹打混匀，磁分离，重复清洗三次，进行蛋白定量，按上式计算偶联率及 偶联量。

本发明采用的高分子聚合物分子链上带有大量羧基，具有良好的亲水性 及生物相容性，随着溶液pH值的升高，羧基可以部分转变为羧酸根，带有一 定量的负电荷，利用本发明方法制备的表面修饰有功能化高分子的金磁纳米 微粒，既可利用物理吸附与生物分子作用，又可通过羧基化学偶联抗原/抗体， 部分电离得到的羧基根通过静电斥力又利于功能化的金磁纳米微粒保持良好 的分散性和稳定性。

本发明中使用的金磁纳米微粒可采用中国发明专利200910219500.3中的 方法进行制备，此方法以分散有油溶性的磁性氧化物的有机试剂作为制备金 磁纳米微粒的核及油相建立正向微乳液体系，然后用乳状液作为复合材料生 成的微反应器，在磁性氧化物表面还原离子金而制备得到金磁纳米微粒，该 方法制备得到的Fe₃O₄/Au/Fe₃O₄纳米复合微粒磁响应性强（约30emu/g）、粒 径为30nm，已经在生物分子检测、靶向药物载体、生物分子纯化分离及细胞 分选中得到广泛应用。由于高比表面、过剩表面自由能以及复杂的表面结构， 通过适当的表面修饰，使金磁纳米微粒保持长时稳定性和单分散性是必要的。 这种表面修饰还需要提供生物分子表面功能化过程中的稳定性，以防止纳米 微粒产生团聚而失去纳米颗粒所特有的光学性质，且为后续偶联提供所需的 功能基团或作用位点。

与中国发明专利201110326087相比，本发明的特点主要在于通过聚合物 的表面修饰后，金磁纳米微粒不但可以获得良好的分散性和稳定性，得到亲 水性并带有均一电荷的材料表面，更有利于偶联生物分子。本发明的操作简 便、步骤少、重复性高，对尺寸相近、表面性质类似的颗粒材料有很强的可 借鉴性。

本发明的具体优点如下：

（1）提供了一种新型表面修饰的金磁纳米微粒。修饰后的金磁纳米微粒 具有较强的磁性，又具有良好的分散性、稳定性以及良好的生活相容性和易 功能化的特点。

（2）该方法工艺简单，操作便捷，可行性好，在表面活性剂预分散的基 础上，只要一次性包覆即可。

（3）表面修饰后的金磁纳米微粒，可通过化学键合或物理吸附方式与生 物分子偶联，得到分散性、稳定性良好，并具有生物活性的金磁纳米微粒载 体，可以满足实际应用的需要。

附图说明

图1为利用本发明表面修饰所得的金磁纳米微粒的TEM照片，所采用的 表面修饰层为聚丙烯酸（PAA）。

图2为利用本发明表面修饰所得的金磁纳米微粒稳定性表征结果，聚丙 烯酸修饰的金磁纳米微粒在不同介质（水,100mM的NaCl溶液和0.25×TBE 缓冲液）中的紫外可光光谱图。

图3为利用本发明所得聚丙烯酸-金磁纳米微粒与兔IgG偶联前后的粒度 分布的变化。

具体实施方式

本发明采用功能性高分子聚合物对金磁纳米微粒进行表面修饰，所修饰 的金磁纳米微粒可与生物分子偶联得到功能化的纳米颗粒。需要进行表面修 饰的原有金磁纳米微粒为花瓣状，即核/壳/花瓣的三层结构，包括磁性Fe₃O₄内核、具有化学惰性与良好生物相容性的Au壳和外部吸附的Fe₃O₄种子，通 常表示为Fe₃O₄/Au/Fe₃O₄；采用表面活性剂对金磁纳米微粒进行预分散，去除 多余的氧化物，同时赋予核/壳纳米材料表面正电荷，将亲水性高分子聚合物 包覆于材料表面，得到具有良好的磁响应性、生物相容性和易功能化的金磁 纳米微粒。本发明中的表面修饰方法涉及的工艺简单，操作简捷，可重复性 良好。利用修饰后的纳米材料表面的功能性基团，保持良好的分散性和稳定 性的同时，通过物理方法或化学键合方法进一步偶联生物分子，实现表面功 能化，便于拓展纳米复合微粒在生物医药领域的应用。

本发明中采用表面活性剂预分散和高分子聚合物包裹的结合方式，得到 了表面带有功能化基团的核壳型金磁纳米微粒，为验证本发明修饰材料的优 势，将本发明得到的核壳型金磁纳米微粒表面通过化学键合法偶联生物分子， 表面功能化的过程中，核壳型金磁纳米微粒良好的分散性、稳定性保持不变， 并且可以保持生物分子良好的生物活性。本发明步骤简单，操作便捷，重复 性良好，所得粒子尺寸大小适于高灵敏度、高特异性生物分子的检测，在体 外检测技术、磁性成像技术中应有良好的应用前景。

以下结合免疫检测例对本发明金磁纳米微粒的表面修饰及载体用于检测 的方法作进一步的说明：

实施例：

（1）核壳型Fe₃O₄/AuNP的制备：

取0.182g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）与100mL的超纯水于三口烧 瓶内，用搅拌机轻转搅拌均匀，加入金磁纳米微粒150mg，配成CTAB为5 mmol/L，金磁纳米微粒浓度为10mg/mL的混合溶液，200rpm搅拌10min 至均匀，加入HCl溶液至pH1.0~4.0，搅拌20min结束后。将CTAB预处理 后的金磁纳米微粒磁性分离，弃去上清，超纯水重悬后，再次磁性分离，重 复清洗三次,定容至50mL。

（2）制备Fe₃O₄/Au/PAA颗粒：

在上述制备好的CTAB-Fe₃O₄/Au纳米颗粒中，加入3mL聚丙烯酸钠 （PAA）（1mg/mL）于三口烧瓶中，搅拌30min。反应停止后将复合微粒离 心分离/磁性分离，弃去未反应上清液，在沉淀中加入超纯水混匀，分离弃去 上清，重复上述清洗过程3次；最后将金磁纳米微粒定容于50mL的超纯水 中，混匀后取出2mL称固体物含量，备用。

效果验证：

Fe₃O₄/Au/PAA/RIgG的制备：

吸取上述步骤修饰Fe₃O₄/Au/PAA金磁纳米微粒1mg于2mL离心管中， 加入0.5mL缓冲液，用移液器吹打混匀，在磁性分离架上进行磁分，弃去上 清。然后向复合微粒中加入缓冲液0.5ml，加入碳二亚胺（EDC）（5mg/mL） 10μL，室温反应15min；再次加入EDC（5mg/mL）10μL，室温反应5min。 以6000rpm离心5min后，去除未反应的EDC。以0.5ml缓冲液重悬后，向 溶液中加入5-40μL免IgG(rabbit-IgG,5mg/ml)溶液，并留取小样记为pre-； 室温下反应1h。反应完成后在磁架上进行磁分离，吸取上清并记为post。向 复合微粒中加入清洗缓冲液并吹打混匀，磁分离，重复清洗三次并记为 wash1-wash3。Lowry法进行蛋白定量，计算偶联率及偶联量。

将实施例制备的表面修饰功能化聚合物金磁纳米微粒以及金磁纳米微粒- 抗体偶联产物用透射电子显微镜TEM、激光粒度分析仪Zetasizer、紫外可见 光分光光度计UV-Vis对其进行了表征，各种试验情况如下：

观察物品：表面修饰得到的聚合物功能化的金磁纳米微粒、金磁纳米微 粒-抗体偶联产物。

实验仪器：

透射电子显微镜TEM型号为Hitachi H-600、动态光散射仪型号为 Zetasizer Nano-ZS、紫外可见光分光光度计型号为岛津UV-2550。

1、观察

按透射电镜使用方法对金磁纳米微粒及金磁纳米微粒-抗体偶联物进行观 察，观测结果见图1。由图1可见，透射电镜观察到聚合物修饰后的金磁纳米 微粒，成球形，结构完整。

2、测试

UV-Vis紫外可见光光度计、Zetasizer动态光散射仪的测试方法对表面修 饰后的金磁纳米微粒的稳定性分散性、粒径及zeta电位进行测试。

利用本发明所得的金磁纳米微粒偶联生物分子前后，所得的粒径分布表 征如图2所示。由图2可见，修饰所得的金磁纳米微粒的粒径范围在70~80nm， 偶联生物分子得到的金磁纳米微粒-生物分子偶联的粒径略有增大，在100-110 nm左右。修饰后的金磁纳米微粒在I=100mM的电解质溶液、TBE缓冲液中， 最大吸收峰强度虽略有减少，但峰位没有发生明显的红移，结合粒径分布的 检测，修饰后的金磁纳米微粒没有发生团聚，依然保持有良好的分散性和稳 定性。

3、观测结果

表面修饰的金磁纳米微粒的UV-Vis光谱见图2。