用作抗肿瘤药物的高选择性的c-Met激酶抑制剂

摘要

本发明涉及式I的化合物及其药用盐，其中A，Ar，E，G，J，M，R1，R2，R3，X和X1如说明书中所定义。本发明还涉及含有这些化合物的药物组合物，它们的制备方法和它们在制备用于治疗癌症的药物的应用。式I

说明书

技术领域

本发明涉及新的化合物，特别涉及抑制、调节和/或调控Met激酶的信号转导的化合物、它们的制备、含有它们的药物组合物以及它们作为药物的应用。 

背景技术

蛋白激酶是信号传导途径的酶组分，它催化末端磷酸盐从ATP迁移至蛋白的酪氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基的羟基。因此，抑制蛋白激酶功能的化合物是评估蛋白激酶活动的生理学结果的有价值的工具。哺乳动物的正常或突变蛋白激酶的过表达或不适当表达已经成为广泛研究的主题，并已经被证实在许多疾病，包括糖尿病、血管生成、银屑病、再狭窄、眼病、精神分裂症、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、心血管疾病和癌症的发展中起到重要作用。蛋白激酶抑制剂在治疗人和动物疾病方面具有特别的用途。 

实现细胞调节的主要机制之一是通过跨膜胞外信号转导来进行的，该转导转而调控细胞内的生化通路。蛋白质磷酸化代表了一种过程，通过该过程胞内信号在分子与分子间传播，最终导致细胞应答。蛋白质磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上，因此已经按照其磷酸化位点的特异性对蛋白激酶进行了分类，即丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶。由于磷酸化是细胞内的普遍过程并且由于细胞表型主要受这些通路活性的影响，所以目前认为许多疾病状态和/或疾病可归因于激酶级联分子成分的异常活化或功能突变。 

肝细胞生长因子(HGF)(也称为扩散因子)受体c-Met，是调节细胞增殖、形态形成和能动性的受体酪氨酸激酶。c-Met基因被转译为170kD蛋白，该蛋白被加工为由140kDp跨膜亚单位和50kD糖基化细胞外α亚单位组成的细胞表面受体。 

经相同细胞的c-Met突变、c-Met和/或HGF/SF的过表达、和/或异常出现于多种人实体瘤，并被认为参与血管生成、肿瘤发展、侵入和转移。 

例如，具有不受控制的c-Met活动的细胞系是高度侵入和转移的。正常和经改变细胞表达c-Met受体的一个显著区别在于，肿瘤细胞中的酪氨酸激酶结构域的磷酸化 不依赖于配体的出现。 

已经在大量人疾病，包括肿瘤和癌症，例如，遗传和散发的人乳头状肾癌、乳腺癌、直肠结肠癌、胃癌、神经胶质瘤、卵巢癌、肝细胞癌、头和颈鳞状细胞癌、睾丸癌、基底细胞癌、肝癌、肉瘤、恶性胸膜间皮瘤、黑瘤、多发性骨髓瘤、骨肉瘤、胰腺癌、前列腺癌、滑囊肉瘤、甲状腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌、膀胱移行细胞癌、睾丸癌、基底细胞癌、肝癌-和白血病、淋巴瘤和骨髓瘤-例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性嗜中性细胞白血病(CNL)、急性未分化细胞白血病(AUL)、退行发育的大细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞白血病(PML)、幼年粒-单核细胞白血病(JMML)、成人T细胞ALL、伴有三系骨髓发育不良的AML(AML/TMDS)、混合系白血病(MLL)、骨髓增生异常综合征(MDSs)、骨髓增生性疾病(MPD)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓肉瘤、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金病(也称为霍奇金淋巴瘤)中鉴别出C-Met突变/更替。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的高选择性c-Met激酶含氮杂环抑制剂，其具有改善的抗肿瘤活性。 

本发明涉及式I化合物 

其中 

R¹和R²为氢原子或卤素原子； 

X、X¹为氢原子或卤素原子； 

A、E、G各自独立地为碳原子或氮原子，或CH＝G替换为硫原子； 

J为氮原子，碳原子或硫原子； 

M为碳原子或氮原子； 

Ar为芳基或杂芳基，它们任选地被1-3个独立地选自下组的取代基所取代：C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤代C_1-6烷基，卤代C_1-6烷氧基，C_3-7环烷基，卤素，氰基，氨基，-CONR⁴R⁵-NHCOR⁴，-SO₂NR⁴R⁵，C_1-6烷氧基-C_1-6烷基，氨基-C_1-6烷基，或4-6元杂环基，或者两个取代基连接在一起，与它们所连接的芳基或杂芳基上的碳原子一起形成4-6元环酰胺基； 

R⁴和R⁵各自独立地为氢原子，C_1-6烷基，C_3-7环烷基或4-6元杂环基； 

R³为氢原子，C_1-6烷基，C_1-6烷氧基，卤代C_1-6烷基，卤素，氨基，或-CONH-C_1-6亚烷基-4-6元杂环基； 

或其药用盐。 

根据本发明，JMN与相联苯环一起构成为吲唑、苯并咪唑或苯并噻唑稠环体系。 

在本申请的一个优选实施方案中，R¹和R²为氟原子。 

在本申请的另一个优选实施方案中，X或X¹为氟原子。 

在本发明的另一个优选实施方案中，R³为氢原子，C_1-6烷基，氨基，或-CONH-C_1-6亚烷基-4-6元杂环基。 

在本发明的另一个优选实施方案中，A和E为氮原子，且G为碳原子。 

在本发明的另一个优选实施方案中，A为碳原子，E为氮原子，且G为碳原子。 

在本发明的另一个优选实施方案中，A为碳原子，且E和G为氮原子。 

在本发明的另一个优选实施方案中，A和E为碳原子，且CH＝G替换为硫原子。 

在本发明的另一个优选实施方案中，Ar为芳基或5-6元杂芳基(更优选为含有1-2个氮原子的5-6元杂芳基)，它们任选地被1-3个独立地选自下组的取代基所取代：C_1-6烷基，C_3-7环烷基，卤素，氰基，氨基，-CONR⁴R⁵，-NHCOR⁴，-SO₂NR⁴R⁵，C_1-6烷氧基-C_1-6烷基，氨基-C_1-6烷基，4-6元杂环基，或者两个取代基连接在一起，与它们所连接的芳基或杂芳基上的碳原子一起形成4-6元环酰胺基(优选5元环酰胺基)。 

在本发明的另一个优选实施方案中，所述4-6元杂环基为4-6元氧杂环烷基，4-6元氮杂环烷基或4-6元氧氮杂环烷基，优选4-6元氧杂环烷基。 

在本发明的另一个优选实施方案中，R⁴和R⁵各自独立地为氢原子，C_1-6烷基，C_3-7环烷基或4-6元杂环基(优选含有1-2个选自氮和氧的杂原子的4-6元杂环基)。 

本发明的化合物优选地选自下列的化合物：实施例1-52中的化合物(详细参见实施例)。 

本申请还涉及制备式I化合物的方法。 

本发明的化合物可以由任何常规手段制备。实施例中提供了合成这些化合物的合适的方法。通常，可以根据下面描述的合成路径制备式I化合物。 

1)将化合物B与化合物C反应来制备式I化合物 

其中A，Ar，E，G，J，M，R¹，R²，R³，X和X¹如上所定义。 

2)将化合物D与化合物E反应来制备式I化合物 

其中A，Ar，E，G，J，M，R¹，R²，R³，X和X¹如上所定义。 

3)将化合物F与化合物G反应来制备式I化合物 

其中A，Ar，E，G，J，M，R¹，R²，R³，X和X¹如上所定义。L为离去基团(例如，氯、溴、苯氧基、4-硝基苯氧基、2，3-二氯苯氧基等)。 

4)将化合物H与化合物J反应来制备式I化合物 

其中其中A，Ar，E，G，J，M，R¹，R²，R³，X和X¹如上所定义。Q为氯、溴或碘原子。 

5)将化合物K与化合物L反应来制备式I化合物 

其中其中A，Ar，E，G，J，M，R¹，R²，R³，X和X¹如上所定义。 

本申请还涉及一种药物组合物，其包含根据上述的式I化合物以及药用载体和/或辅剂。 

本申请还涉及上述的式I化合物在制备用于治疗癌症的药物的用途。 

除非另外指出，阐明下列定义以举例说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。 

术语“卤素”是指氟，氯，溴和碘，优选氟，氯和溴。 

术语“C_1-6烷基”，单独或与其它基团组合，是指具有1至6个碳原子支链或直链单价烷基。该术语进一步例举为诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基的基团。更优选C_1-4烷基。 

“卤代烷基”是指本文定义的烷基，其中一个或多个氢已经被相同或不同卤素替换。例举性的卤代烷基包括-CH₂Cl，-CH₂CF₃，-CH₂CCl₃，全氟烷基(例如，-CF₃)等。 

术语“C_3-7环烷基”，单独或与其它基团组合，是指3至7个环碳的饱和单价环状烃基，例如环丙基，环丁基，环己基。 

术语“C_1-6烷氧基”，单独或与其它基团组合，是指基团R’-O-，其中R’是C_1-6烷基。 

术语“芳基”，单独或与其它基团组合，是指苯基或萘基，优选苯基。 

术语“4-6元杂环基”，单独或与其它基团组合，是指4至6个环原子的非芳族单环基团，其中一个或两个环原子是选自N，O，或S(O)_n(其中n是0至2的整数)的杂原子，其余环原子是C。杂环基部分的实例包括但不限于：任选取代的哌啶基，哌嗪基，高哌嗪基，氮杂 基，吡咯烷基，吡唑烷基，咪唑烷基，咪唑啉基，吡啶基，哒嗪基，嘧啶基，噁唑烷基，异噁唑烷基，吗啉基，噻唑烷基，异噻唑烷基，奎宁环基，噻二唑烷基，二氢呋喃基，四氢呋喃基，二氢吡喃基，四氢吡喃基，硫代吗啉基，硫代吗啉基亚砜，硫代吗啉基砜等。 

“术语“杂芳基”是指芳族5至6元单环或9至10元二环，其可以含有1、2或3个 选自氮、氧和/或硫的原子，如呋喃基，吡啶基，哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，噻吩基，异噁唑基，噁唑基，噁二唑基，咪唑基，吡咯基，吡唑基，三唑基，四唑基，噻唑基，异噻唑基，1，2，3-噻二唑基，苯并咪唑基，吲哚基，吲唑基，异吲唑基，苯并异噻唑基，苯并噁唑基，苯并异噁唑基和喹啉基。优选的杂芳基有吡啶基，噁唑基和三唑基。 

″药用盐″指常规的酸加成盐或碱加成盐，其保留式I化合物的生物有效性和性质，其由适宜的非毒性有机或无机酸或有机或无机碱形成。酸加成盐的例子包括衍生自无机酸和衍生自有机酸的那些盐，所述无机酸例如氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸和硝酸，所述有机酸例如对-甲苯磺酸、水杨酸、甲磺酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、马来酸、乳酸、富马酸等。碱加成盐的例子包括衍生自铵、钾、钠和季铵氢氧化物的盐，例如氢氧化四甲铵。将药用化合物(即药物)化学改性成盐是药剂师公知的技术，用以获得化合物的改善的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性。 

″可药用的″如可药用载体、赋形剂等指对于特定化合物的给药对象是可药用的和基本上无毒的。 

本发明的化合物对c-Met激酶具有抑制活性。这些化合物可以用于治疗过度增生性疾病如癌症和特别是结直肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、子宫颈癌、肾脏癌或肾癌，白血病或淋巴瘤。包括急性-骨髓性白血病(AM L，急性淋巴细胞性白血病(ALL)和胃肠基质瘤(GIST)的治疗。 

在备选实施方案中，本发明包括药物组合物，所述药物组合物包含至少一种式I化合物或其药用盐，还包含药用赋形剂和/或载体。 

这些药物组合物可以口服给药，例如以片剂、包衣片、糖衣丸、硬或软胶囊、溶液、乳剂或混悬剂的形式。它们也可以直肠给药，例如以栓剂形式，或胃肠外给药，例如以注射液的形式。 

包含式I化合物和/或其盐或酯的本发明的药物组合物可以用本领域已知的方法制备，例如用常规的混合、封入胶囊、溶解、制粒、乳化、包封、制糖衣丸或冷冻干燥法。这些药物制剂可与治疗学的惰性、无机或有机载体制剂。乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐可被用做用于片剂、包衣片、糖衣丸和硬明胶胶囊的载体。用于制备软胶囊的适宜载体包括植物油、蜡和脂油。根据活性成分的性质，在软胶囊的情况下通常不需要载体。用于制备溶液或糖浆剂的适宜载体为水、多元醇、蔗糖、转化糖和葡萄糖。用于注射剂的适宜载体为水、醇、多元醇、甘油、植物油、磷酸和表面活性剂。用于栓剂的适宜载体为天然油或硬化油、蜡、脂油和半固体多元醇。 

药物制剂也可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。它们也可含有其它治疗学上有价值的物质，包括与式I化合物不同的另外的活性成分。 

如上所述，本发明的化合物，包括式I化合物，可用于治疗或控制细胞增殖疾病。这些化合物和含有所述化合物的制剂在实体瘤，例如乳腺、结肠、肺和前列腺瘤的治疗或控制中特别有用。 

根据本发明的化合物的治疗有效量指这样的化合物的量，该量对于预防、减缓或改善疾病的症状或延长被治疗的患者的生命是有效的。治疗有效量的确定属于本领域的技术。 

根据本发明的化合物的治疗有效量或剂量可在宽限度内改变，并且可以以本领域已知方法确定。该剂量在每种特定情况下根据个体需要而调整，所述特定情况包括给药的具体化合物、给药途径、被治疗的情况及被治疗的患者。通常，在向约70Kg的成年人口服或肠胃外给药时，约10mg至约10,000mg，优选约100mg至约1,000mg的日剂量应当是合适的，尽管有迹象表明时，可以超出上限。日剂量可以以单独剂量或分开剂量给药，或者对于肠胃外给药，可以以持续输注的形式给予。 

中间体的制备

中间体A的制备 

第一步：4-溴-2-氟-氮-甲基苯酰胺 

在100mL反应瓶中加入4-溴-2-氟苯甲酸(3.0g，13.7mmol)和2M甲胺(34.3mL，68.5mmol)，EDCI(6.6g，34.25mmol)，HOBt(2.8g，20.6mmol)，二异丙基乙胺和N，N-二甲基甲酰胺(50mL)，反应混合物在室温下反应16个小时。反应完全后，加入水(50mL)。有机层分离后，水相用乙酸乙酯萃取(50mL，萃取3次)。有机相合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶3)，得标题化合物(白色固体，2.34g，74％)。(MS：[M+1]232) 

第一步：4-溴-2-氟-苯甲酰氯 

在100mL反应瓶中加入4-溴-2-氟苯甲酸(5.0g，22.8mmol)和二氯亚砜(50mL)，反应混合物在室温下反应2个小时。反应完全后，把反应物直接浓缩，得到的粗产物(4.0g，74％)，直接在下一步中使用。(MS：[M+1]239) 

第二步：4-溴-2-氟-氮，氮-二甲基苯酰胺 

在50mL反应瓶中加入4-溴-2-氟苯甲酰氯(4.0g，16.9mmol)和2M二甲胺(13mL，10.8mmol)，碳酸铯(11g，33.8mmol)和THF(50mL)，反应混合物在室温下反应过夜。反应完全后，加入饱和食盐水(30mL)。有机层分离后，水相用乙酸乙酯萃取(50mL，萃取3次)。有机相合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶3)，得标题化合物(白色固体，3.6g，88％)。(MS：[M+1]246) 

第一步：4-溴-2-氟-氮-乙基苯酰胺 

在100mL反应瓶中加入4-溴-2-氟苯甲酸(0.767g，3.5mmol)和2M乙胺(3.5mL，7.0mmol)，HATU(1.65g，7.0mmol)，二异丙基乙胺(0.925g，7.0mmol)和N，N-二甲基甲酰胺(50mL)，反应混合物在室温下反应2个小时。反应完全后，加入水(10mL)。有机层分离后，水相用乙酸乙酯萃取(10mL，萃取3次)。有机相合并，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝ 1∶3)，得标题化合物(白色固体，0.80g，95％)。(MS：[M+1]246) 

第一步：5-溴-氮-甲基吡啶-2-酰胺 

在50mL反应瓶中加入5-溴吡啶-2-羧酸甲酯(2.0g，9.3mmol)和2M甲胺(18.5mL，37.0mmol)，反应混合物在室温下反应过夜。反应完全后，把反应混合物浓缩，得到的粗产物(白色固体，2.0g，100％)，直接投入下一步反应。(MS：[M+I]216) 

应用上述合成方法制备中间体A1-A14(表A1)。 

表A1.中间体A1-A14 

第一步：四氢呋喃-3-基4-甲基苯磺酸酯 

在50mL反应瓶中加入四氢呋喃-3-醇(1.0g，11.4mmol)，对甲苯磺酰氯(2.42g，13.7mmol)，三乙胺(4.6g，45.4mmol)和二氯甲烷(10mL)。反应混合物在室温下搅拌过夜后，加入二氯甲烷(50mL)稀释，并用水(10mL)洗涤两遍。有机相分离后用无水硫酸钠干燥后，过滤、浓缩，得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶5)，得标题化合物(2.3g，91％)。(MS：[M+1]243) 

第一步：4-溴-2-氟苯磺酰胺 

在50mL反应瓶中加入氨水(60mL)，用冰盐浴冷却后，分批加入4-溴-2-氟苯磺酰氯(4.0g，14.6mmol)，反应混合物在低温下搅拌5个小时，反应完全后，用乙酸乙酯(50mL，萃取4次)萃取，有机相合并后，用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩后得到的粗产物(白色固体，3.7g，100％)，直接投入下一步反应。(MS：[M+1]254) 

第一步：4-溴-2，6-二氟-苯甲酸甲酯 

在100mL反应瓶中加入4-溴2，6-二氟苯甲酸(5.0g，21.1mmol)和二氯甲烷(20mL)，滴加入二氯亚砜(15mL)和DMF的混合液(0.5mL)。反应混合物在室温下反应2.5个小时后，冷却到0℃，滴加如甲醇(20mL)。反应混合液继续搅拌3个小时后，加入水(50mL)和二氯甲烷(50mL)。有机相分离后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)和饱和食盐水(50mL)洗涤过后，用无水硫酸钠干燥。过滤、浓缩后，得到得到的粗产物(棕色固体，3.39g，64％)，直接在下一步中使用。(MS：[M+1]251) 

第二步：4-溴-2-氟-6-硝基甲基苯甲酸甲酯 

在50mL反应瓶中加入硝基甲烷(1.0mL，16.9mmol)，无水硫酸镁(4.0g)和DMSO(15mL)。向混合液中，分批加入氢化钠(405mg，16.9mmol)。反应混合物搅拌30分钟后，加入4-溴2，6-二氟苯甲酸甲酯(530mg，2.1mmol)后，反应混合物继续在室温下搅拌2天，反应完成后，加入水(80mL)和6M盐酸(50mL)，再加入二氯甲烷(100mL)，有机相分离后，水相用二氯甲烷(50mL，萃取2次)萃取。有机相合并后，用饱和食盐水(50mL)洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩后得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶30)，得标题化合物(淡黄色固体，270mg，44％)。(MS：[M+1]292) 

第三、四步：5-溴-7-氟-异吲哚-1-酮 

在100mL反应瓶中加入水(20mL)，乙醇(60mL)，4-溴-2-氟-6-硝基甲基苯甲酸甲酯(500mg，1.71mmol)和铁粉(959mg，17.1mmol)。反应液回流搅拌3个小时后，冷却、过滤、浓缩。粗品溶解在乙醇中(50mL)，加入碳酸钾(1.0g，7.2mmol)，在室温下搅拌30分钟后，把反应混合物过滤、浓缩，得到粗产品(白色固体，330mg，44％)，直接在下一步中使用。(MS：[M+1]230) 

第一步：4-溴-1-环丙基-1氢-吡唑的合成 

在30mL微波管中加入4-溴-1氢-吡唑(1.0g，6.8mmol)，环丙基溴(1.3g，10.7mmol)，碳酸铯(3.5g，10.7mmol)和DMF(6mL)，反应混合物在微波反应器中加热到180℃下搅拌1.5个小时。反应完全后，反应混合物冷却后过滤，浓缩后得到粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶5)，得标题化合物(褐色液体，0.87g，68％)。(MS：[M+1]259) 

应用上述合成方法制备中间体A24，26-A31(表A2)。 

表A2.中间体A24，A26-A31 

中间体B的制备 

第一步：3-氯-6-(1-三苯基甲基-1氢-吡唑-4-基)哒嗪 

在1000mL反应瓶中加入4-(频哪醇硼酸酯基)-1-三苯基甲基-1氢-吡唑(20g，45.9mmol)，3，6-二氯哒嗪(10.2g，68.5mmol)，Pd(dppf)Cl2(1.0g，1.4mmol)，磷酸钾(26.4g，115mmol)和1，4-二氧六环(300mL)，水(30mL)。反应混合物在氮气保护下加热到100℃并搅拌过夜。反应完全后，过滤、浓缩，得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶4)，得标题化合物(棕色固体，13g，67％)。(MS：[M+1]423) 

第二步：3-氯-6-(1氢-吡唑-4-基)哒嗪 

在250mL反应瓶中，向上一步反应得到的3-氯-6-(1-三苯基甲基-1氢-吡唑-4-基)哒嗪(13g，30.8mmol)加入四氢呋喃(100mL)和浓盐酸(50mL)，反应混合物在室温下搅拌4个小时。反应完全后，把反应液浓缩，加入饱和碳酸氢钠水溶液中和至pH值8到9。过滤，干燥，得到标题化合物(棕色固体，5g，90％)。(MS：[M+1]181) 

第一步：2-氟-氮-甲基-4-频哪醇硼酸酯基苯酰胺 

在100mL反应瓶中加入4-溴-2-氟-氮-甲基苯酰氨(2.34g，10mmol)和联硼酸频那醇酯(3.05g，12.0mmol)，Pd2(dba)3(275mg，0.03mmol)，PCy3(168mg，00.6mmol)，乙酸钾(2.95g，30.0mmol)和1，4-二氧六环(25mL)，反应混合物在氮气保护下加热到80℃并搅拌3个小时。反应完全后，把反应液浓缩，加入水(50mL)，用乙酸乙酯萃取(50mL，萃取3次)。合并的有机相再用饱和食盐水(50mL)洗涤一次之后，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到的粗产物直接在下一步中使用。(MS：[M+1]280) 

第二步：2-氯-6-(3-氟-氮-甲基-4-苯甲酰胺)哒嗪 

在100mL反应瓶中，向上一步反应得到的粗产品2-氟-氮-甲基-4-频哪醇硼酸酯基苯酰胺(10mmol)加入3，6-二氯哒嗪(2.23g，15.0mmol)，Pd₂(dba)₃(275mg，0.03mmol)，PCy₃(168mg，00.6mmol)，磷酸钾(4.60g，20.0mmol)和1，4-二氧六环(20mL)，水(5mL)，反应混合物在氮气保护下加热到110℃并搅拌过夜。反应完全后，把反应液浓缩，加入水(50mL)，用乙酸乙酯萃取(50mL，萃取3次)。合并的有机相再用饱和食盐水(50mL)洗涤2次之后，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶2)，得标题化合物(棕色固体，675mg，24％，两步反应)。(MS：[M+1]266) 

第一步：2-氟-氮-甲基-4-频哪醇硼酸酯基苯酰胺 

在50mL反应瓶中加入4-溴-2-氟-氮-乙基苯酰胺(0.231g，0.94mmol)和联硼酸频那醇酯(0.354g，1.41mmol)，Pd(dppf)Cl₂(34mg，0.05mmol)，PCy₃(36mg，0.09mmol)， 乙酸钾(0.231g，2.35mmol)和1，4-二氧六环(4mL)，反应混合物在氮气保护下加热到90℃，并在该温度下搅拌过夜。反应完全后，把反应液过滤、浓缩，得到的粗产物直接在下一步中使用。(MS：[M+1]294) 

第二步：2-氯-6-(3-氟-氮-乙基-4-苯甲酰胺)哒嗪 

在50mL反应瓶中，向上一步反应得到的粗产品2-氟-氮-乙基-4-频哪醇硼酸酯基苯酰胺(0.94mmol)加入3，6-二氯哒嗪(0.282g，1.9mmol)，Pd(dppf)Cl₂(34mg，0.05mmol)，PCy₃(26mg，0.09mmol)，磷酸钾(0.433g，1.9mmol)和1，4-二氧六环(5mL)，水(0.5mL)，反应混合物在氮气保护下加热到90℃并搅拌过夜。反应完全后，把反应液过滤、浓缩，得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶1)，得标题化合物(棕色固体，133mg，51％，两步反应)。(MS：[M+1]280) 

第一步：5-频哪醇硼酸酯基-3-腈基吡啶 

在50mL反应瓶中加入5-溴-3-腈基吡啶(0.50g，2.7mmol)和联硼酸频那醇酯(0.832g，3.3mmol)，Pd₂(dba)₃(75mg，0.08mmol)，PCy₃(46mg，0.16mmol)，乙酸钾(0.803g，3.0mmol)和1，4-二氧六环(10mL)，反应混合物在氮气保护下加热到80℃，并在该温度下搅拌过夜。反应完全后，加水(40mL)，用乙酸乙酯(30mL，萃取3次)萃取，有机分离合并后，用无水硫酸钠干燥，之后过滤、浓缩得到的粗产物直接在下一步中使用。(MS：[M+1]231) 

第二步：2-氯-6-(5-氰基-吡啶-3-基)哒嗪 

在50mL反应瓶中，向上一步反应得到的粗产品5-频哪醇硼酸酯基-3-氰基吡啶(0.523g，2.7mmol)加入3，6-二氯哒嗪(0.611g，4.1mmol)，Pd(PPh₃)₄(158mg，0.014mmol)，碳酸铯(1.78g，5.5mmol)和1，4-二氧六环(20mL)，反应混合物在氮气保护下加热到100℃并搅拌过夜。反应完全后，把反应液过滤、浓缩，得到的粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶1)，得标题化合物(棕色固体，200mg，Y＝34％，两步反应)。(MS：[M+1]217) 

第一步：3-氯-6-(1-甲基-1氢-吡唑-4-基)哒嗪 

在100mL反应瓶中加入3-氯-6-(1氢-吡唑-4-基)哒嗪(1.7g，9.4mmol)，叔丁醇钾(1.23g，10.4mmol)，18-冠醚-6(250mg，0.94mmol)和乙醚(40mL)。反应混合物在氮气保护下室温搅拌20分钟后，用冰浴冷却到0℃，慢慢滴加入碘甲烷(1.56g，10.9mmol)。反应混合液慢慢升至室温，并搅拌过夜。反应完全后加入冰水(30mL)，用二氯甲烷(50mL，萃取3次)萃取，把有机相分离合并后，用无水硫酸钠干燥后，过滤、浓缩，得到标题化合物(棕色固体，1.7g，93％)。(MS：[M十1]195) 

第一步：3-氯-6-(1-(四氢呋喃-3-基)-1氢-吡唑-4-基)哒嗪 

在100mL反应瓶中加入3-氯-6-(1氢-吡唑-4-基)哒嗪(300mg，1.7mmol)，异丙基溴(820mg，6.7mmol)，碳酸铯(2.77g，8.5mmol)和DMF(50mL)。反应混合物在室温下搅拌过夜后，加入水(20mL)，用乙酸乙酯(20mL，萃取2次)萃取。有机相合并后用无水硫酸钠干燥后，过滤、浓缩，得到的标题化合物(314mg，85％)。(MS：[M+1]223) 

第一步：1-环丙基-4-频哪醇硼酸酯基-1氢-吡唑 

在100mL反应瓶中加入4-溴-1-环丙基-1氢-吡唑(6.57g，35.1mmol)和无水四氢呋喃(30mL)，反应混合物在氮气保护下冷却到-78oC，慢慢滴加2.5M n-BuLi(15.5mL，38.6mmol)。搅拌1个小时后，慢慢加入异丙基频哪醇硼酸酯(9.17g，94.1mmol)，继续在低温下搅拌3个小时。反应完全后，加入水(20mL)终止反应，用1M盐酸溶液把反应液pH调至8-9。分离后，水相用乙酸乙酯萃取(30mLx3次)。有机相合并后浓缩得到的粗产物(6.64g，81％)，直接在下一步反应中使用。(MS：[M+1]235) 

第二步：3-氯-6-(1-环丙基-1氢-吡唑-4-基)哒嗪 

在100mL反应瓶中加入6.86g(23.4mmol)1-环丙基-4-频哪醇硼酸酯基-1氢-吡唑(6.64g，28.4mmol)，3，6-二氯哒嗪(8.46g，56.8mmol)，Pd(dppf)Cl₂(1.04g，1.42mmol)，K₃P0₄(18.1g，85.2mmol)，水(5mL)和1，4-二氧六环(50mL)，反应混合物在氮气保护下加热到90℃下搅拌过夜。反应完全后，反应混合物冷却后加水(20mL)，分离后，水相用乙酸乙酯(30mLx3次)萃取。有机相合并浓缩后得到粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶5)得标题化合物(黄色固体，4.07g，65％)。(MS：[M+1]222) 

应用上述合成方法制备中间体B0-B32(表B)。 

表B.中间体B0和B32 

中间体C的制备 

第一步：5-氟-4-碘-2-甲基苯胺 

在1000mL反应瓶中加入5-氟-2-甲基苯胺(26.4g，211mmol)和碘(27.0g，106mmol)，尿素过氧化氢(14.8g，158mmol)和乙酸乙酯(500mL)，反应混合物在50℃下反应3个小时。反应完全后，加入饱和亚硫酸氢钠水溶液(300mL)。有机层分离后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到的粗产物(深褐色液体，53.0g，100％)，不进一步纯化直接在下一步使用。(MS：[M+1]252) 

第二步：氮-(5-氟-4-碘-2-甲基苯基)乙酰胺 

在1000mL反应瓶中加入5-氟-4-碘-2-甲基苯胺(53.0g，211mmol)，醋酸酐(23.7g，232mmol)和氯仿(500mL)，反应混合物在室温下搅拌3小时。反应完全后，浓缩得到粗产品有机层分离后用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到的粗产物(深褐色固体，61.7g，100％)，不进一步纯化直接在下一步使用。(MS：[M+1]294) 

第三步：2-(4-乙酰胺基-2-氟-5-甲基苯基)-2，2-二氟乙酸乙酯 

在1000mL反应瓶中加入氮-(5-氟-4-碘-2-甲基苯基)乙酰胺(61.8g，211mmol)，二氟-溴乙酸乙酯(64.3g，317mmol)，铜粉(54.0g，844mmol)和无水DMSO(500mL)。反应混合物在氮气保护下加热到60℃并搅拌过夜。反应完全后，冷却加入300ml饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯萃取(300ml，萃取3次)。有机相合并后用无水硫酸钠干燥，浓缩所得粗产品经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶2)得标题化合物(褐色固体，60.9g，100％)。(MS：[M+1]290) 

第四步：2-(1-乙酰基-6-氟-1氢-吲唑-5-基)-2，2-二氟乙酸乙酯 

在500mL反应瓶中加入2-(4-乙酰胺基-2-氟-5-甲基苯基)-2，2-二氟乙酸乙酯(10.4g，35.8mmol)，亚硝酸异戊酯(9.23g，78.9mmol)，18-冠-6(1.83g，7.17mmol)，醋酸钾(7.02g，71.7mmol)，醋酸酐(11.0g，108mmol)和氯仿(150mL)。反应混合物在氮气保护下加热到65℃并搅拌过夜。反应完全后，冷却过滤，浓缩后得到粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶5)，得标题化合物(淡黄色固体，5.9g，55％)。(MS：[M+1]301) 

第五步：2，2-二氟-2-(6-氟-1氢-吲唑-5-基)乙酸乙酯 

在1000mL反应瓶中加入2-(1-乙酰基-6-氟-1氢-吲唑-5-基)-2，2-二氟乙酸乙酯(67g，223mmol)和四氢呋喃(400mL)，反应混合物搅拌均匀后，滴加浓盐酸(400mL)。反应混合物加热至65℃，搅拌3个小时。反应完全后，冷却、浓缩后，向得到的粗产物中加入无水乙醇(800mL)，搅拌均匀后，缓慢滴加浓硫酸40mL，反应混合物加热至80℃，搅拌12小时。反应完全后，冷却，加入饱和碳酸氢钠水溶液(500mL)，分离后，水相用乙酸乙酯萃取(500mLx2次)。有机相合并后用无水硫酸钠干燥后，浓缩，粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶2)，得标题化合物(淡黄色固体，40.3g，70％)。(MS：[M+1]259) 

第六步：2，2-二氟-2-(6-氟-2-甲基-2氢-吲唑-5-基)乙酸乙酯 

在100mL反应瓶中加入2，2-二氟-2-(6-氟-1氢-吲唑-5-基)乙酸乙酯(1.4g，5.4mmol)，三甲基氧鎓四氟硼酸盐(1.2g，8.1mmol)和乙酸乙酯(40mL)，反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完全后，加入饱和NaHSO3水溶液(50mL)，分离后，水相用乙酸乙酯(40mLx2次)萃取。有机相合并后，用饱和食盐水(50mL)洗后，用无水硫酸钠干 燥。浓缩后得到粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：乙酸乙酯/石油醚＝1∶3)，得标题化合物(黄色固体，1.3g，59％)。(MS：[M+1]273) 

第七步：2，2-二氟-2-(6-氟-2-甲基-2氢-吲唑-5-基)乙酰肼 

在100mL反应瓶中加入2，2-二氟-2-(6-氟-2-甲基-2氢-吲唑-5-基)乙酸乙酯(2.13g，7.8mmol)，水合肼(3.90g，78mmol)和20ml乙醇，反应混合物在室温下搅拌1小时。反应完全后，浓缩后得到粗产物(淡黄色固体，2.01g，100％)，不经过进一步纯化，直接在下一步中使用。(MS：[M+1]259) 

应用上述合成方法制备中间体C1-C5(表C)。 

表C.中间体C1-C5 

实施例

实施例1：4-(3-(二氟(4-氟-2-甲基-二氢-吲唑-5-基)甲基)-[1，2，4]三唑[4，3-b]哒嗪-6-基)-2-氟-氮-甲基苯甲酰胺 

在50mL反应瓶中加入2，2-二氟-2-(4-氟-2-甲基-2氢-吲唑-5-基)乙酰肼(194mg，0.75mmol)，4-(6-氯哒嗪-3-基)-2-氟-氮-甲基苯甲酰胺(199mg，0.75mmol)，甲磺酸(0.06mL，0.9mmol)和1-甲氧基-2-丙醇(6mL)，反应混合物加热至90℃，搅拌16个小时。反应完全后，浓缩后得到粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：甲醇/二氯甲烷＝1∶20)，得标题化合物(淡黄色固体，156mg，44％)。(MS：[M+1]470) 

应用上述合成方法，从中间体C2制备终产物1-17(表1)。 

表1.应用实例1-17 

实施例44：6-(1-环丙基-1-氢-吡唑-4-基)-3-(二氟(6-氟-2-甲基-(二氢-吲唑-5-基)甲基)-[1，2，4]三唑[4，3-b]哒嗪的合成 

在100mL反应瓶中加入2，2-二氟-2-(6-氟-2-甲基-2氢-吲唑-5-基)乙酰肼(2.01g，7.8mmol)，3-氯-6-(1-环丙基-1氢-吡唑-4-基)哒嗪(1.81g，8.2mmol)，甲磺酸(0.898g，9.4mmol)和1-甲氧基-2-丙醇(15mL)，反应混合物加热至90℃，搅拌16个小时。反应完全后，浓缩后得到粗产物经柱色谱分离纯化(硅胶柱，洗脱剂：甲醇/二氯甲烷＝1∶20)，得标题化合物(淡黄色固体，1.32g，40％)。(MS：[M+1]425) 

应用上述合成方法，从中间体C1，C3-C5制备终产物18-52(表2)。 

表2.应用实例18-52 

活性实施例

活性实施例1：本发明的化合物对c-Met激酶的抑制活性 

【试验方法】使用PerKinElmer公司的LanceUltra Ulight^TM-TK试剂盒评估化合物对c-Met激酶的抑制活性。 

【仪器】PerKinElmer公司的ENVISION读板机。 

【试验材料】Optiplate-384孔板(PerKinElmer公司)，激酶缓冲液(50mM Hepes pH7.5，25mM NaCl，2mM DTT，0.01％Tween20，5mM Mg²⁺，0.5mM Mn²⁺)，c-Met激酶(1038-1346AA，中美冠科)，c-Met激酶底物(PerKinElmer公 司，货号#TRF0127-M)，LanceEu-W 1024-anti-phosphotyrosine(PT66)(PerKinElmer公司，货号#AD0068)，ATP (Invitrogen公司)，DMSO(Sigma，货号#34869)，纯化水(Millipore，型号Milli-Q)。 

【试验条件】将c-Met激酶(终浓度12.5nM)与化合物(DMSO终浓度为0.5％)在30℃预孵20分钟，预孵完毕后加入ATP(终浓度2.5μM)与反应底物(终浓度50nM)，30℃反应1小时，反应完毕后加入抗体，30℃反应60分钟，读板(615nM，665nM)，计算出665/615比值，并分析数据。 

【受试样品】实施例化合物和Crizotinib(阳性对照药) 

【数据分析】665/615比值背景值(无酶)：     0.003285 

            665/615比值最高值(无化合物)： 0.075356 

            抑制率(％)： 

【数据处理】使用CBIS数据分析软件计算出IC50数值。 

活性实施例2：本发明的化合物对c-Met底物磷酸化的抑制活性 

【试验方法】使用ELISA的方法检测c-Met底物磷酸化的抑制活性 

【仪器】PerKinElmer公司的ENVISION读板机。 

【试验材料】S114细胞(NIH)，96孔培养板(CORNING，#3596)，DMEM培养液(Gibco，#11965-092)，96孔吸附板(Thermo，#14-245-61)，PBS(Invitrogen，#10010023)，胎牛血清(Gibco，#16000044)，Fibronectin(Invitrogen，#33016-015)，1/2Tris碳酸氢铵缓冲液(25mM Tris，100mM NaCl，12mM NH₄HCO₃，PH 7.5)，封闭缓冲液(25mM Hepes，100mM NaCl，0.2％Tween20，PH 7.5)，结合缓冲液(0.3％明胶，25mM Hepes，100mM NaCl，0.01％Tween20，PH 7.5)，裂解缓冲液(50mMTris，150mMNaCl，1.25％CHAPS，1片蛋白酶抑制剂/10ml，1片磷酸酶抑制剂/10ml)，DMSO(Sigma，#D2650)；捕获抗体(抗C-met抗体，Cell Signaling，#3148s)，一抗(抗磷酸化C-met抗体，R&D Systems，#AF2480)，二抗(Anti-rabbit IgG HRP-linked抗体，Cell Signaling，#7074)，A.B.T.S(Sigma，#A1888)，A.B.T.S溶液(0.1％A.B.T.S，0.1mM柠檬酸，0.1mM磷酸氢二钠)，30％过氧化氢(国药)，纯化水(Millipore，型号Milli-Q)。 

【试验步骤】用PBS将Firbronectin配成5μg/ml溶液，以100μl/well包被96孔培养板2小时后吸出，用来铺细胞。DMEM(含10％FBS)培养S114细胞。 当细胞长至约80％时，胰酶消化收集细胞，800rpm离心5分钟，以适量的DMEM重悬细胞。细胞进行计数，调整细胞浓度至500,000cells/ml。以100μl/well将细胞悬液加入96孔细胞培养板。将培养板转移至细胞培养箱(37℃，5％CO₂)，培养过夜。用1/2Tris碳酸氢铵缓冲液溶解捕获抗体(1∶1000稀释)，并且以70μl/well包被96孔吸附板，4℃过夜。第二天弃96孔吸附板中的抗体，封闭缓冲液洗一遍，每孔加150μl封闭缓冲液，室温封闭1小时。弃96孔培养板中的培养液，用DMEM培养液(不含FBS)洗一次后，每孔加80μl DMEM培养液(不含FBS)和20μl需检测化合物(用不含FBS的DMEM培养液溶解)相应的梯度稀释溶液，细胞在37℃，5％CO₂培养箱中继续培养30分钟。弃细胞培养液，PBS洗一次，每孔加入50μl的裂解缓冲液，4℃裂解20分钟。弃96孔吸附板中封闭缓冲液，用结合缓冲液洗一次，每孔加入50μl结合缓冲液和40μl的细胞裂解液，室温孵育2小时。弃细胞裂解液，结合缓冲液洗2次，每孔加入100μl的一抗溶液(用结合缓冲液1∶1000稀释)，37℃孵育1小时。弃一抗溶液，结合缓冲液洗2次，每孔加入100μl的二抗溶液(用结合缓冲液1∶1000稀释)，37℃孵育1小时。弃二抗溶液，结合缓冲液洗2次，PBS洗1次，每孔加入100μl A.BT.S溶液(用A.B.T.S溶液1∶10000稀释30％过氧化氢)，37℃孵育30分钟。用ENVISION读板机进行OD405检测。 

【受试样品】实施例化合物和Crizotinib(阳性对照药) 

【数据分析】背景值(不加细胞裂解液)： 0.084 

            最高值(无化合物)：       0.517 

            抑制率(％)： 

【数据处理】使用CBIS数据分析软件计算出IC50数值 

表3.实施例1-52的体外活性测定结果(IC50，nM)