一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株

摘要

本发明涉及一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株，该病毒株的保藏编号为：CGMCC No.6752。本发明筛选的弱毒疫苗株用来制备用于防治鸡传染性支气管炎的疫苗。本发明筛选的鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株无论人工感染还是水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象，其遗传性稳定，符合鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，可以作为疫苗毒株进行商品化开发。

说明书

技术领域

本发明属于疫苗抗原筛选技术领域，具体涉及一种鸡传染性支气管炎病毒 弱毒疫苗株。

背景技术

鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种急性高 度接触性呼吸道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏、幼鸡流鼻涕、产蛋鸡产蛋 量减少和蛋的品质下降为特征；患病鸡常因为呼吸道、肾脏或消化道感染而引 起死亡。本病于1931年首先由Schalk等报道于美国，1936年由Beach和Hudson 确定本病的病原为病毒。至今本病在世界范围内广泛流行，给养鸡业带来严重 危害。在我国，邝荣禄(1972)在广东首次发现本病；到上世纪70年代后期，郑 福荣等在杭州、吴志达等在上海、艾国光等在北京、辛朝安等在广州分别自种 用鸡群中分离出IBV。荣骏弓等（1997）在患有腺胃肿大的病鸡中分离到腺胃 型鸡传染性支气管炎病毒D971株，用该毒株回归SPF雏鸡引起典型肾炎及腺胃 炎病变，并从人工感染SPF雏鸡中回收到鸡传染性支气管炎病毒。王玉东、范 根成等（1998）在山东省某患有腺胃肿大发病鸡群中采集病料，通过鸡胚连续 传5～6代，经电镜观察、动物回归和免疫保护试验、用气管环组织培养进行理 化特性测定、毒价测定、中和试验等，证明目前流行的以腺胃肿大为主要特征 的传染病的病原是冠状病毒，将该毒株命名为腺胃型鸡传染性支管炎病毒QX 株。

在欧洲，分别于2001年在俄罗斯东部及2002年在俄罗斯西部分离到IBV类 QX株(Bochkov et al，2006)，该毒株能引起鸡患腺胃炎、肾炎，与QX株相似。 从2003年起许多欧洲国家相继分离到IBV类QX株，包括德国、荷兰、比利时、 法国、意大利(Worthington et al，2008；Monne et al，2008)、波兰 (Domanska-Blicharz et al，2006)、英国(Gough et al,2008)和西班牙(Dolz et al， 2009)。各种相关研究报道表明整个欧洲地区都有类QX株病毒的存在。显然， IB类QX株对于禽养殖来说是很大的威胁，而目前尚无专门针对IB类QX株的 疫苗。国外学者将类QX毒株在鸡胚上连续传代80余代致弱的IB L1148毒株制 成IB类QX株的活疫苗，并进行相关的效力和安全性试验。表明对于SPF鸡亦 或是携有母源抗体的鸡，经IB L1148株制成的活苗免后对类QX株D388的攻 毒都能提供有效保护。

免疫接种是防治鸡传染性支气管炎的最有效手段。目前，国内外用于预防 腺胃型传染性支气管炎疫苗的研究较多，但均尚未商品化。同时由于IBV血清 型众多，市场上一直未有交叉保护力好的弱毒株，腺胃型IB得不到有效控制。 因此，筛选获得新的具有较好保护力的IB弱毒株就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株，即一种新的腺 胃型鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对目前中国 流行腺胃型鸡传染性支气管炎病毒的攻击能提供良好的免疫保护效力。

本发明的鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)YB160， 该病毒株于2012年10月31日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.6752。

本发明筛选的弱毒疫苗株用来制备用于防治鸡传染性支气管炎的疫苗。

本发明筛选的鸡传染性支气管炎病毒弱毒疫苗株无论人工感染还是水平传 播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符合鸡传染性支 气管炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，制成的疫苗能够提供有效的免疫保护， 具有很好的商品化开发前景。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的 是，在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

一、本发明鸡传染性支气管炎弱毒YB160株的筛选

使用10~11日龄SPF鸡胚对传染性支气管炎强毒进行连续传代致弱，每代 通过尿囊腔接种4枚SPF鸡胚，连传至160代，进行致弱评价。取10、20、30、 40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160传代接种的病 毒株感染1日龄的SPF鸡。结果从第80代病毒株开始无死亡鸡，第90代毒株 接种的鸡开始无眼观病变，第130代接种的鸡开始无组织学病变。说明IBV第 130代已经完全致弱，对鸡只具有良好的安全性。同时用本发明毒株130、140、 150160代分别免疫3日龄SPF鸡，于免疫后14日，用同源强毒攻击。免疫组 分毒率0/10～1/10，保护率9/10～10/10，对照组分毒率10/10。结果说明本发明 毒株具有良好的免疫保护性。为了便于同以前毒株区分，将传代160代弱化的 鸡胚毒定为原始种子E1代，并将该致弱毒株命名为YB160株。选取IBV YB160 株作为疫苗研制的候选毒株，并于2012年10月31日保藏于中国科学院中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.6752。

二、IBV YB160株的安全性检测

毒力返强试验：将YB160株的E1代在SPF鸡体上人工感染和同居感染分 别连续传5代，试验鸡均一切正常，接种后5天剖检气管、腺胃、肾脏等均未 见肉眼病理变化；试验发现病毒分离气管棉拭子和腺胃第4代起分不到病毒， 肾脏从第3代起分不到病毒，肝脏从第2代起分不到病毒。试验鸡气管、腺胃、 肾脏等组织匀浆中分毒不通器官病毒分离率不同，气管、腺胃病毒分离率较高， 说明该毒株主要在气管、腺胃两个器官增殖。随着代次的增加病毒向外排泄也 逐渐减少，分毒率逐渐降低。水平感染试验也出现人工感染同样的规律，只是 同居感染同代次分毒率相对人工感染低。以上试验结果证明该毒株无论人工感 染还是水平传播感染在鸡体连续传代，均未见毒力返强现象，遗传性稳定，符 合鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株无毒力返强的标准，可以作为疫苗毒株进行商 品化开发。

IBV YB160株毒种安全性试验取IBV YB160株基础种子E2、E4、E7、 E10、E13代毒种以10^5.0EID₅₀滴鼻1滴（约0.03ml），分别接种1、3日龄SPF 鸡，连续观察10日。结果接种鸡只均健活，均无任何异常反应。结果见表1、2。

表1IBV YB160株毒种的安全性试验结果

表2IBV YB160株毒种的安全性试验结果

上述毒力返强试验结果和毒种安全性试验结果说明本发明筛选的鸡传染性 支气管炎病毒弱毒疫苗株YB160株是安全的，可以用来制备疫苗。

三、IBV YB160株的免疫效力检测

用E2、E4、E7、E10、E13代次YB160株毒种鸡胚尿囊液，以5×10^2.0EID₅₀剂量，对1日龄SPF鸡滴鼻，免疫后14日，连同对照鸡，分别采血，分离血清， 进行IB HI抗体效价测定。同时每只鸡用10倍稀释的IB分离株强毒点眼、滴鼻 各1滴，攻毒后第5日，采集每只鸡的气管拭子，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡 胚5枚，0.1ml/胚，孵育观察至144小时。结果显示，免疫组鸡的血清HI抗体 效价的几何平均值在1:32～1:39.4之间，均≥1:16（微量法）；对照组鸡的血清 HI抗体效价均≤1:8（微量法）。同时免疫组分毒率在0/10～1/10之间，保护率 在9/10～10/10之间；对照组分毒率为10/10。说明IBV YB160株毒种在13代以 内其免疫原性基本一致，均具有良好免疫原性，说明IBV YB160株具有良好的 免疫保护性。用YB160株制成的活体疫苗的实际免疫效果表明YB160株接种后 4日后可产生抗体，14日抗体达到高峰，维持70日后平缓降低；同时在免后7 日时对IB分离株强毒攻击分毒率为1/10～2/10，保护率达到8/10~9/10；120日 时对IB分离株强毒攻击分毒率为0/10～2/10，保护率达到8/10～10/10；而150 日时对IB分离株强毒攻击分毒率为3/10～5/10，保护率仅为5/10～7/10。以上 结果说明IBV YB160株毒种在13代以内其免疫原性基本一致，具有良好免疫原 性，说明IBV YB160株具有良好的免疫保护性。

综上所述，IBVYB160株具有良好的免疫原性和安全性符合活疫苗株标准。 适合做种毒用。