一种用于鉴定卵巢癌患者临床分期的分子标记、试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种用于鉴定卵巢癌患者临床分期的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其与正常的MTDH基因相比，区别在于：第231位存在一个单核苷酸多态性：G>A。一种用于鉴定卵巢癌患者临床分期的试剂盒，包括特异性引物，该引物为一对，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列。一种体外检测样品是否存在MTDH基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下：（1）用MTDH基因特异性引物扩增样品的MTDH基因，得到扩增产物；（2）对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：231G>A。本发明的方法，检测简单、准确、快速，特异性强，对于高危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于鉴定卵巢癌患者临床分期的分子标记、试剂盒及其检测方法，具体 地涉及MTDH基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）及其与卵巢 癌的相关性，及检测这些SNP的方法和试剂盒，属于分子生物学和医学领域。

背景技术

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系统肿瘤，2008年全球新发病例225500人，死亡140200 人。多数卵巢癌患者起病隐匿，症状不明显，发现时已届晚期，预后差，无理想的治疗手段。 临床上工作中发现即使临床分期、病理类型、发病年龄等临床因素相似的病人，其对化疗的 反应性及其临床预后也会有很大的差异，从而导致治疗的不理想。因此探讨卵巢癌发生发展 的生物学机制，寻找卵巢癌患者分子分型的分子标记，对卵巢癌患者实施有效的个体化防治 具有重要意义。

因此，本领域急需进一步寻找卵巢癌患者分子分型的分子标记，开发检测卵巢癌临床分 期的方法、试剂盒，以及相关的治疗药物。

发明内容

针对上述现有技术，本申请的发明人经过深入而广泛的研究，对大量候选基因的SNP进 行了测定和分析，首次发现MTDH和卵巢癌患者临床分期密切相关，可作为卵巢癌患者临床分 期检测或者分子分型的分子标记，因此，本发明提供了一种用于鉴定卵巢癌患者临床分期的 试剂盒及其方法，以及体外检测样品是否存在MTDH基因的单核苷酸多态性的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于鉴定卵巢癌患者临床分期的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其 与正常的MTDH基因相比，区别在于：第231位存在一个单核苷酸多态性：G>A，即第231位 的碱基包括碱基G和碱基A两种情形，当为碱基G时，为正常的MTDH基因，当为碱基A时， 为突变的MTDH基因：

gctacaaatt agtaggaaaa gaatagtgcc gcccacgggc tttccaactt ttgaattctg  60

gggactaaca acagagagca agagtgaatg agccaaacga cgcaaacgtg ccctcgccag  120

gctggcaact ggtaggcacg cagtgtatta gttgccctgg agagaaacac cctggagaga  180

aatacccaat ttgtgaacta aacctaggtc ccggaagaac agtgttcggc rtcagactcc  240

231位，r＝G或A

gttgagctca ttctggaagg atccaactgg cgccaccagg gagaaaaagc gattccacct  300

caataacact ccagaaaaag gcatgaagag ccctatacct gccagggcga ctttgaccta  360

gacccggtga cccggttcct agcgctgcag ccctacccgc cccccgcccg cccccgcctt  420

gcacggagcc cctcctctgt actcattcgt tgcgccacgt ctcctaactc tgcgccacca  480

gccaccccgc gaaggcgtcc accaattaac ccctcccagc ttctggtcta cagtaacggg  540

tccccaacgc cgcgtcttaa ccaggcccga accgaccacc gccaaccttc cctgacacgc  600

ctttgcccca cccgaccccg cccgccccca cgtgacgccc acgccccgcc cactggcgcc  660

cacgtgaccc acggtcgtcc ccgcgcgcgg cgtggatcgc ggcccaagcc gccattgttc  720

cgccgaggga ggacagcggg gcctggcgct ggcgccgaga cgccgcttag cggccgccac  780

tggagacact ccctcccgcc tcccgggtct cctggcggcg gcggagtgag gctgacagcg  840

gggaacctgg gagacccctc cgccctcccc gcggtggcag cggccgatcc ccggctccgg  900

cgcgagggac ggccgcgatg cgctcggcct gaggttaccc ggcccggccc ttcctcgctt  960

ccctcgacta ttccactgcg tctccgcgcc ccggcgtcat cctgcgagtc cctctgacgg  1020

gagggaagat ggctgcacgg agctggcagg acgagctggc ccagcaggcc gaggagggct  1080

cggcccggct gcgggaaatg ctctcggtcg gcctaggctt tctgcgcacc gagctgggcc  1140

tcgacctggg gctggagccg aaacggtacc  1170

一种用于鉴定卵巢癌患者临床分期的试剂盒，包括特异性引物，该引物为一对，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列，该引物为能够特异性的扩增MTDH基因的引物，能特异性 地扩增出长度200～2700bp的序列。

进一步地，试剂盒还包括PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg²⁺、Taq酶和Buffer组成。 PCR反应液中各组分的用量关系为常规的，对所属领域技术人员而言是公知常识。

一种体外检测样品是否存在MTDH基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下：

（1）用MTDH基因特异性引物扩增样品的MTDH基因，得到扩增产物；所述引物为一对， 具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列；

（2）对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：231G>A； 231G>A突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。

一种对卵巢癌患者个体的临床分期或分子分型进行检测或诊断的方法，步骤如下：

检测该个体的MTDH基因、转录本和/或蛋白，并与正常的MTDH基因、转录本和/或蛋白 进行比较，存在差异就表明该患者临床分期为早期的可能性高于正常卵巢癌患者。所述差异 是指是否存在单核苷酸多态性：231G>A；231G>A突变位置编号基于SEQ ID NO:1的序列。

本发明的用于鉴定卵巢癌患者临床分期的分子标记、试剂盒及其方法，以及体外检测样 品是否存在MTDH基因的单核苷酸多态性的方法，检测简单、准确、快速，特异性强，对于高 危人群或易感个体及卵巢癌患者实施有效的早诊、早治和个体化防治具有重要意义。对于探 讨巢癌发生发展的生物学机制，寻找卵巢癌患者分子分型的分子标记，对卵巢癌患者实施有 效的个体化防治具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1  MTDH基因突变的检测及与卵巢癌患者临床分期的关联分析

1.1研究对象

选取卵巢癌患者145例，2008年9月～2011年4月于山东大学齐鲁医院确诊治疗，临床 资料从病历获得。大部分受试者均为山东省内汉族居民。取受试人员外周血1.5ml，于-80℃ 冷藏保存。所有受试人员均按照山东大学齐鲁医院伦理委员会要求征得同意。

1.2 DNA提取

用常规酚氯仿法提取受试者外周血DNA，具体如下：

（1）取400ul血加于1.5ml离心管中。

（2）加入800ul PBS,混匀，3500g，15min，弃上清；重复一遍。

（3）加入400ul裂解液，37℃，1h。

（4）加入蛋白酶K 4ul，浓度200ug/ml。

（5）55℃水浴消化过夜（4-12h）。

（6）加入400ul的Tris饱和酚，混合摇动10min。

（7）5000g，15min，取水相。

（8）加入100ul NaAc，800ul无水乙醇，-20℃，20min。

（9）12000g，5min，弃上清。

（10）600ul 70%冰乙醇，12000g，5min，弃上清，重复一次。

（11）12000rpm离心，10分钟。弃上清，晾干。溶于100μl TE。

（12）测定浓度和纯度，分装，冻存于-80℃。

1.3引物、PCR扩增和测序

从GenBank下载MTDH基因组序列（Gene ID:92140；Nucleotide：AC_000140.1 GI:157734173），用primer premier5.0设计引物。具体引物详细信息见表1。

表1引物序列表

引物名称 序列 SEQ ID NO： 上游引物 5'CTGGCAACTGGTAGGCACGC 3' 2 下游引物 5'GAGGGACTCGCAGGATGACG 3' 3

PCR扩增条件：94℃3分钟，（94℃30秒，60℃30秒，72℃40秒）×35，72℃ 7分钟，10℃保温。PCR扩增产物为1255bp。

PCR扩增产物送交上海博尚生物技术公司测序，测序结果应用软件Meglign 7.0和 Chromas 2.33进行检验和分析，本实施采用了反向测序，经分析，发现存在以下SNP：231G>A。

1.4 SNP分型和关联分析

应用卡方（X²）检验对受试人员位点的分布进行统计分析；当一个单元格的期望个数少 于5个时应用Fisher精确检验进行分析。所有P值均为双侧概率，当P<0.05时认为有显著 统计学意义。应用无条件逻辑回归分析对基因型频率、等位基因频率和卵巢癌患病之间的相 关性进行评估，计算其比值比（Odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence interval， CI），并应用SPSS17.0软件（SPSS Inc.Chicago,Illinois,USA）进行统计分析。

结果发现SEQ ID NO：1中的rs16896059(231G>A)位点与卵巢癌患者的临床分期显著相 关，A等位基因携带者（GA+AA）临床分期为早期的可能性较大，可作为卵巢癌患者临床分期 的分子标记。详细结果见表2。

表2  231G>A位点基因型与卵巢癌患者临床分期的相关性

实施例2  卵巢癌患者临床分期检测试剂盒

由于SEQ ID NO：1中231G>A的突变与卵巢癌患者的临床分期高度相关，因此可基于这 个突变设计MTDH基因特异性引物再以病人的DNA为模板进行扩展检测。

制备一试剂盒（100人次），它含有如表3所示的物质：

表3

抽取受试者外周血2ml，常规方法提取DNA。利用卵巢癌患者临床分期检测试剂盒进行 PCR反应，将反应产物进行测序，将测序结果利用Meglign 7.0和Chromas 2.33软件进行检 验和分析。

检测结果含有rs16896059(231G>A)的卵巢癌患者临床分期为早期的可能性高于正常卵巢 癌患者。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明做各种修改 或改动，但这些改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。