一种湖州百合组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种湖州百合组培快繁方法，包括：将洗净的湖州百合的鳞片置于200~300mg/L甲基托布津中震荡0.3~1h后，于70~75%酒精中浸泡20~30s，再浸入质量体积浓度为0.1%~0.2%升汞中15~25min，冲洗干净；将冲洗干净的鳞片接至诱导培养基进行诱导培养；诱导出芽后，转移到增殖培养基进行增殖培养，获得丛生芽；将丛生芽接至壮球生根培养基，获得无菌苗。本发明的方法有效解决了湖州百合外植体在初代培养过程中易出现真菌、细菌污染的情况，将污染率控制在25%以下，此外死亡率也较低，且建立了一整套完整的初代、继代、壮球、生根培养过程，具有高诱导率及增殖倍数。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种湖州百合组培快繁 方法。

背景技术

食用百合是野生百合经过多年良种驯化、品种筛选及人工栽培后，可 供食用、安全无毒的食品，是我国经济价值较高的上等蔬菜，具较好的药 用价值和保健功能。

食用百合可分为甜百合和苦百合两大类，兰州百合、龙牙百合、卷丹、 川百合即为国内主要的食用百合。卷丹又名虎皮百合、南京百合，属于苦 百合类食用百合，野生种在我国分布广泛，而以食用作为栽培目的则主要 集中在江浙地区。

湖州百合（Lilium lancifolium）是卷丹的一个生态型，已有五六百年 的栽培历史，主要分布在湖州市的太湖、漾西、塘甸等乡镇，是浙江省的 传统特产。湖州百合栽培种鳞茎个大，肉质细嫩，营养（蛋白质、糖、矿 物质及多种维生素）丰富，味甘中带微苦，风味独特，且含微量秋水仙碱 等多种药理成分，有润肺化痰、安心宁神、清热利尿、健胃益脾、补中益 气等功效，并具一定抗癌作用，被誉为“百合之王”。湖州百合除鲜食外， 还被加工成百合干、百合粉、百合罐头、百合饮料等加以出售。

随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的改变，清凉滋补的百合， 作为药膳被人们所青睐，需求量逐年增加。然而，湖州百合虽种植历史悠 久，但由于该地农民长期使用当地老品种，不注意提纯复壮，而小鳞茎、 珠芽、鳞片扦插的无性繁殖方法，均导致后代容易积累病毒，使得百合病 毒病频发，加之新种质缺乏，导致品种退化现象严重。此外，传统繁殖方 式主要是去大留小，周期长，占有耕地且降低产量，大大增加了种植成本。

目前，植物快繁技术在以无性繁殖为主的园艺作物上应用广泛，技术 也相对成熟。利用组织培养繁殖湖州百合，可在短期内获得保持原有品种 优良性状的大量种苗，大大提高其产量和品质。因此，若能推行组培工厂 化育苗方式，不仅能使一些优良株系得到迅速推广，且能大大节约留种成 本，产生显著经济效益。目前，针对兰州百合、细叶百合、野百合及东方 系百合等的组培育苗的已有很多研究，但是不同种百合，因基因型等遗传 背景差异，其所需的技术条件差别很大。而对湖州百合组培快繁技术进行 系统研究还未见报道，特别是百合的鳞茎生长于地下，带菌多，使得组培 快繁过程中的消毒过程难度加大，始终存在着污染率较高的问题。

发明内容

本发明提供了一种湖州百合组培快繁方法，具有高诱导率及增殖倍 数，且在获取无菌苗的过程中污染率及死亡率均较低。

一种湖州百合组培快繁方法，包括：

（1）将洗净的湖州百合的鳞片置于200~300mg/L甲基托布津中震荡 0.3~1h后，于70~75%酒精中浸泡20~30s，再浸入质量体积浓度为 0.1%~0.2%升汞中15~25min，冲洗干净；

（2）将冲洗干净的鳞片接至诱导培养基进行诱导培养；

（3）诱导出芽后，转移到增殖培养基进行增殖培养，获得丛生芽；

（4）将丛生芽接至壮球生根培养基，获得无菌苗；

其中，所述诱导培养基为：琼脂，6~8g/L；蔗糖，30~35g/L；MS粉， 4~5g/L；6-BA，0.5~1.0mg/L；NAA，0.1~0.5mg/L；

所述增殖培养基为：琼脂，6~8g/L；蔗糖，60~65g/L；MS粉，4~5g/L； 6-BA，1.0~1.5mg/L；NAA，0.1~0.2mg/L；

所述壮球生根培养基为：琼脂，6~8g/L；蔗糖，70~80g/L；MS粉， 4~5g/L；NAA，0.1~0.2mg/L；活性炭，2~3g/L。

所述湖州百合的鳞片在洗净消毒前置于2~4℃处理1~4周。

将外植体材料进行一段时间的低温处理，不仅可以减少组织褐化现象 的发生，提高诱导率，还能有效降低外植体的带菌率。但低温时间过长过 短均不适宜，时间过长易滋生真菌，过短则达不到降低污染率的作用，优 选的，所述处理的时间为2~4周，更优选为2周。

将甲基托布津、酒精和升汞配合使用，可进行深度灭菌，达到比单一 消毒剂更好的消毒效果。另外，需严格控制消毒剂的浓度和消毒时间，防 止杀死外植体细胞，影响诱导率。

甲基托布津是一种广谱性的高效、低毒、低残留的内吸杀菌剂，被植 物吸收后转化为多菌灵，干扰真菌有丝分裂中纺锤体的形成，影响细菌细 胞分裂，使细胞壁中毒，孢子萌发长出的芽管畸形，从而杀死病菌。

优选的，所述甲基托布津的浓度为250~300mg/L，震荡时间为0.3~0.45 h；更优选的，所述甲基托布津的浓度为250mg/L，震荡时间为0.3h。

70~75%的酒精具有强渗透性，可进入细菌的细胞内使蛋白变性，但 是在杀死细菌的同时易损伤植物细胞，故将酒精消毒时间控制在30s以内。

优选的，所述酒精的浓度为75%，浸泡时间为30s。

升汞可以使病菌的蛋白变性，且对细菌的消毒能力比真菌强。

优选的，所述升汞的质量体积浓度为0.1%，浸泡时间为20~25min； 更优选的，所述升汞的浓度为0.1%，浸泡时间为20min。

优选的，所述升汞中含有体积比为1~2%的表面活性剂。

表面活性剂可以使升汞更好的与外植体的表面接触，增强消毒效果， 所述的表面活性剂通常为聚山梨醇酯类表面活性剂，具体可以为吐温-20， 价格低廉，且能显著增强附着作用。

在培养基中添加外源激素可以诱导外植体出芽、生根，这主要是外源 激素与植物外植体内源激素互作的结果，而不同种植物外植体内源激素的 错综复杂及内源激素与外源激素作用机理不同，导致了不同种植物外植体 所需添加的激素种类、激素含量、激素配比都有很大差别。

优选的，所述诱导培养基为：琼脂，6~8g/L；蔗糖，30g/L；MS粉， 4~5g/L；6-BA，1.0mg/L；NAA，0.5mg/L。

优选的，所述增殖培养基为：琼脂，6~8g/L；蔗糖，60g/L；MS粉， 4~5g/L；6-BA，1.5mg/L；NAA，0.1mg/L。

优选的，所述壮球生根培养基为：琼脂，6~8g/L；蔗糖，80g/L；MS 粉，4~5g/L；NAA，0.1mg/L；活性炭，3g/L。

百合的组培苗生长势弱，根叶细长柔软，移栽过程中成活率低，容易 重新感染病毒，是我国百合种球工厂化生产中遇到的突出问题。因此，通 过组织培养条件，培养膨大的试管鳞茎，可促进壮苗、改善试管苗质量、 缩短组培苗在大田生长周期、提高移栽成活率，且有利于种球的贮藏、运 输和种质保存。本发明专设壮球生根培养基，为获得成活率更高的组培苗 提供保障。

适宜的培养条件有利于湖州百合的鳞片出芽，快速生长增殖及生根。

所述诱导培养和增殖培养的条件为：光照强度1500~2000lux，光照 时间为10~12小时/天，温度为25±2℃。

将丛生芽接至壮球生根培养基时，于黑暗条件下培养30~35d后转至 弱光条件（光照强度一般为800lux，光照时间一般为12小时/天）培养 3~5d，再调整成与所述诱导培养和增殖培养相同的条件下进行培养，即 可获得无菌苗。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的方法有效解决了湖州百合外植体在初代培养过程中易出现 真菌、细菌污染的情况，将污染率控制在25%以下，此外，死亡率也较低。

本发明建立了一整套完整的初代、继代、壮球、生根培养过程，尤其 是针对外植体消毒灭菌及不同培养阶段的培养基配方，从而可满足湖州百 合离体条件下不同时期的生长发育需求，在较短时间内获得大量增殖，繁 殖系数高达15，且无菌苗小鳞茎可达直径1cm以上，在一定程度上可进 行工厂化组培苗生产。

附图说明

图1为实施例4中湖州百合鳞片外植体诱导培养20d时情况；

图2为实施例4中湖州百合鳞片外植体诱导培养35d时情况；

图3为实施例4中湖州百合芽增殖培养15d情况（增殖培养基中6-BA 为1.5mg/L，NAA为0.1mg/L）；

图4为实施例4中湖州百合黑暗处理转至光照条件培养后的鳞茎球。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

实施例1不同冷藏时间对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

从湖州某农户处购得湖州百合鳞茎球，并于4℃冰箱低温贮藏一段时 间（分别为0、1、2周，见表1）。

将湖州百合鳞茎去除干枯、有病虫害的外层鳞片并洗净后，将湖州百 合的鳞片在含洗洁精的自来水中浸泡30min左右，流水冲洗后，在超净工 作台中用75%酒精消毒30s，再在质量体积浓度为0.1%的升汞中浸泡 20min，用无菌水冲洗3~5遍，待用。

取消毒后的鳞片中下部，用手术刀切割成1cm×1cm的均匀小方块， 凹面朝上接种到诱导培养基(琼脂，8gL；蔗糖，30g/L；MS粉，4~5g/L； 6-BA，1.0mg/L；NAA，0.5mg/L；pH为5.6~5.8)，不同处理的接种数均 为15个外植体，重复三次；诱导培养条件为：25±2℃光照培养，光照强 度为1500~2000lux，光照时间为12小时/天。诱导培养40d后统计污染率 和死亡率。

污染率（%）=污染数/总接种数×100%；

死亡率（%）=死亡数/总接种数×100%。

表1   不同冷藏时间对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

由表1可见，随着冷藏时间的延长，污染率逐渐降低，差异显著，且 低温冷藏并不影响死亡率。而实际研究中发现，若冷藏时间继续增加，一 方面有因高湿产生真菌污染的风险，另一方面，在污染率方面并未有显著 降低。因此，2周左右的冷藏预处理较为适宜。

实施例2不同消毒剂处理对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

1、酒精消毒处理对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

将湖州百合鳞茎球置于4℃冰箱低温贮藏2周。

将湖州百合鳞茎去除干枯、有病虫害的外层鳞片并洗净后，将湖州百 合的鳞片在含洗洁精的自来水中浸泡30min左右，经流水冲洗后用75%酒 精消毒，消毒时间分别为0.5min、1min、3min、5min，用无菌水冲洗3~5 遍，待用。

取消毒后的鳞片中下部，用手术刀切割成1cm×1cm的均匀小方块，凹 面朝上接种到诱导培养基(琼脂，8g/L；蔗糖，30g/L；MS粉，4~5g/L；6-BA， 1.0mg/L；NAA，0.5mg/L；pH为5.6~5.8)，不同处理的接种数均为15个外 植体，重复三次；诱导培养条件为：25±2℃光照培养，光照强度为1500~2000 lux，光照时间为12小时/天。诱导培养40d后统计污染率和死亡率。

污染率（%）=污染数/总接种数×100%；

死亡率（%）=死亡数/总接种数×100%。

表2   不同酒精消毒时间对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

表2显示，单独采用75%酒精处理时，随着处理时间的延长，污染率 逐渐降低，而酒精的高渗透性亦在杀死细菌的同时将植物细胞损伤，如采 用酒精处理5min时，虽污染率仅为26.67%，但其死亡率却高达50%。

2、升汞或NaClO消毒处理对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

将湖州百合鳞茎球置于4℃冰箱低温贮藏2周。

将湖州百合鳞茎去除干枯、有病虫害的外层鳞片并洗净后，将湖州百 合鳞片置于含洗洁精的自来水中浸泡30min左右，经流水冲洗后分别用质 量体积浓度为0.1%升汞或者质量体积浓度为2%NaClO进行不同时间的消 毒处理，处理后用无菌水用无菌水冲洗3~5遍，待用。

取消毒后的鳞片中下部，用手术刀切割成1cm×1cm的均匀小方块，凹 面朝上接种到诱导培养基(琼脂，8g/L；蔗糖，30g/L；MS粉，4~5g/L；6-BA， 1.0mg/L；NAA，0.5mg/L；pH为5.6~5.8)，不同处理的接种数均为15个外 植体，重复三次；诱导培养条件为：25±2℃光照培养，光照强度为1500~2000 lux，光照时间为12小时/天。诱导培养40d后统计污染率和死亡率。

污染率（%）=污染数/总接种数×100%；

死亡率（%）=死亡数/总接种数×100%。

如表3所示，单独采用质量体积浓度为0.1%升汞或质量体积浓度为 2%NaClO消毒灭菌时，无论升汞还是NaClO，随着处理时间的延长，污 染率大致呈降低趋势，而死亡率则逐渐升高。在同一浓度下，NaClO处理 的外植体的死亡率比升汞显著高，可能是因为NaClO作为强氧化剂型消 毒剂，在光照下容易分解而失去氧化活性，且其渗透性较高，经其处理后 的外植体长时间处于水渍状而失去萌发能力。因此，用质量体积浓度为 0.1%升汞处理20~25min效果较理想。

表3不同消毒剂及消毒时间对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

3、甲基托布津消毒处理对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

将湖州百合鳞茎球置于4℃冰箱低温贮藏2周。

将湖州百合鳞茎去除干枯、有病虫害的外层鳞片并洗净后，将湖州百 合鳞片置于含洗洁精的自来水中浸泡30min左右，经流水冲洗后，先用甲 基托布津溶液摇床室温振荡（甲基托布津溶液的浓度和震荡时间见表4）， 再在超净工作台中用75%酒精消毒30s，最后再在质量体积浓度为0.1%的 升汞中浸泡20min，用无菌水冲洗3~5遍，待用。

取消毒后的鳞片中下部，用手术刀切割成1cm×1cm的均匀小方块，凹 面朝上接种到诱导培养基(琼脂，8g/L；蔗糖，30g/L；MS粉，4~5g/L；6-BA， 1.0mg/L；NAA，0.5mg/L；pH为5.6~5.8)，不同处理的接种数均为15个外 植体，重复三次；诱导培养条件为：25±2℃光照培养，光照强度为1500~2000 lux，光照时间为12小时/天；诱导培养40d后统计污染率和死亡率。

污染率（%）=污染数/总接种数×100%；

死亡率（%）=死亡数/总接种数×100%。

表4不同甲基托布津浓度及浸泡时间对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

表4中，发现采用低浓度（100mg/L）的甲基托布津处理时，其污染 率较高，当甲基托布津浓度升至300mg/L且处理时间控制在0.5h以内时， 其污染率及死亡率均可控制在较低水平，分别为25.92%和33.33%。在实际 操作中，采用250mg/L处理0.3h再结合其他消毒方法综合处理，即可达到 更好的效果。

4、吐温处理对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

将湖州百合鳞茎球置于4℃冰箱低温贮藏2周。

将湖州百合鳞茎去除干枯、有病虫害的外层鳞片并洗净后，将湖州百 合鳞片置于含洗洁精的自来水中浸泡30min左右，经流水冲洗后，先用250 mg/L甲基托布津溶液摇床室温振荡0.3h，再在超净工作台中用75%酒精消 毒30s，最后再在含体积百分比为0.1%的吐温-20、质量体积浓度为0.1%的 升汞中浸泡20min，用无菌水冲洗3~5遍，待用，以不添加吐温试剂的处理 作为对照。

取消毒后的鳞片中下部，用手术刀切割成1cm×1cm的均匀小方块，凹 面朝上接种到诱导培养基(琼脂，8g/L；蔗糖，30g/L；MS粉，4~5g/L；6-BA， 1.0mg/L；NAA，0.5mg/L；pH为5.6~5.8)，不同处理的接种数均为15个外 植体，重复三次；诱导培养条件为：25±2℃光照培养，光照强度为1500~2000 lux，光照时间为12小时/天。诱导培养40d后统计污染率和死亡率。

污染率（%）=污染数/总接种数×100%；

死亡率（%）=死亡数/总接种数×100%。

表5吐温-20对湖州百合鳞片灭菌效果的影响

如表5所示，添加吐温-20后，外植体在污染率及死亡率上分别为 24.23%及19.14%，均明显低于未添加吐温-20的消毒。同时，试验中还发 现添加吐温-20的处理，90%以上的外植体在接种至诱导培养基3~5d后有转 绿现象，且外植体肥厚显著，而未添加吐温-20的处理则需6~15d，这可能 是源于吐温-20类细胞分裂素的作用。而此污染率及死亡率低于郭海滨（郭 海滨，雷家军.卷丹百合鳞片及珠芽组织培养研究.中国农学通报,2006.） 27.5%、37.5%的研究结果。

至此，本发明建立了适用于湖州百合鳞茎的甲基托布津-酒精-升汞的 三步消毒法，污染率低，死亡率高。

实施例3   不同诱导培养基对湖州百合诱导培养的影响

(1)外植体的消毒

从湖州某农户处购得湖州百合鳞茎球，并于4℃冰箱低温贮藏2周。

将湖州百合鳞茎去除干枯、有病虫害的外层鳞片并洗净后，在含洗洁 精的自来水中浸泡30min左右，经流水冲洗后采用三步消毒法，第一步先 用250mg/L甲基托布津溶液摇床室温振荡0.3h，第二步在超净工作台上用 75%酒精消毒30s，第三步在含体积百分比为0.1%的吐温-20，质量体积浓 度为0.1%的升汞中浸泡20min，用无菌水冲洗3~5遍，待用。

(2)取鳞片中下部用手术刀切割成1cm×1cm的均匀小方块，凹面朝上接 种到诱导培养基（诱导培养基的具体配方见表6）上于25±2℃光照培养， 光照强度为1500~2000lux，光照时间为12小时/天，诱导培养35d后统计诱 导芽数，计算诱导率。

平均诱导率（%）=诱导出不定芽的外植体数/（总接种数-污染数）× 100%；

平均诱导芽数=不定芽总数/诱导出不定芽的外植体数。

表6不同诱导培养基对湖州百合诱导培养的影响

由表6可知，不同的激素浓度配比对平均诱芽时间、诱导芽数及平均 诱导率均有影响。在6-BA/NAA比值在2~5之间时，其相关指标均较高，且 以6-BA为1.0mg/L，NAA为0.5mg/L时，在较短时间（10~15d）内可获得 平均为4.8个不定芽，诱导率为54.55%。

实施例4不同增殖培养基对湖州百合继代培养的影响

(1)外植体的消毒

从湖州某农户处购得湖州百合鳞茎球，并于4℃冰箱低温贮藏2周。

将湖州百合鳞茎去除干枯、有病虫害的外层鳞片并洗净后，将湖州百 合鳞片在含洗洁精的自来水中浸泡30min左右，经流水冲洗后采用三步消 毒法，第一步先用250mg/L甲基托布津溶液摇床室温振荡0.3h，第二步在 超净工作台上用75%酒精消毒30s，第三步在含体积百分比为0.1%的吐温 -20，质量体积浓度为0.1%的升汞中浸泡20min，用无菌水冲洗3~5遍，待 用。

(2)取鳞片中下部用手术刀切割成1cm×1cm的均匀小方块，凹面朝上接 种到诱导培养基上于25±2℃光照培养，光照强度为1500~2000lux，光照时 间为12小时/天。

诱导培养基：琼脂，8g/L；蔗糖，30g/L；MS粉，4~5gL；6-BA， 1.0mg/L；NAA，0.5mg/L；pH5.6~5.8。

(3)待湖州百合诱导培养33~35d，芽长长至3~4cm后转入增殖培养基 （增殖培养基的具体配方见表7）上继代培养，继代培养的条件为：温度 为25±2℃，光照强度为1500~2000lux，光照时间为12小时/天，增殖培养 40d后统计增殖系数。

(4)待湖州百合芽达一定数量后，将芽转接至壮球生根培养基，25±2℃ 黑暗条件培养30d后，转至弱光条件(光照强度为800lux，光照时间为12小 时/天)培养3~5d，再进行正常的光照培养，光照强度1500~2000lux，培养 温度均25±2℃，光照时间为12小时/天，培养20~25天后即可获得适合移 栽的无菌苗。

壮球生根培养基：琼脂，8g/L；蔗糖，60g/L；MS粉，4~5g/L；NAA， 0.1mg/L；活性炭，3g/L；pH为5.6~5.8。

增殖系数（%）=可转出的芽数/启动芽数

表7不同增殖培养基对湖州百合继代培养的影响

根据表7可知，6-BA/NAA浓度比值在10~20间，不定芽的增殖情况 较好。在本试验中，除了Z4，增殖系数较低（0.91），其主要原因是该处 理在增殖过程中细菌污染严重，从而影响了芽的正常生长。综合增殖系数 及长势，选取6-BA1.5mg/L，NAA0.1mg/L为最优增殖配比。

如图1~图4所示，外植体在3～5d时开始转绿增厚，随后约在10～ 15d左右在外植体基部开始有圆球状突起并逐步分化成芽（图1），随后开 始展叶，至诱导35d时，可见芽长约3～4cm（图2），但此时无鳞茎形成。 将诱导形成的芽切分后转至增殖培养基，培养15d时，已可见芽的分化， 且有一定程度的结鳞茎（图3）。最后，经过暗培养及弱光培养壮球生根培 养，无菌苗小鳞茎可达直径1cm以上，整体繁殖系数则高达15（图4）。