一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方法

摘要

本发明提供一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方法，其包括如下步骤：获得巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖；将所述巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖进行氧化反应，形成二硫键，获得所述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体。本发明还提供该方法获得的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体在基因转染中的应用。壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体包含还原敏感性的二硫键，能够在细胞内由较高含量谷胱甘肽造成的还原环境而快速降解而释放DNA，表现出良好生物相容性和高转染效率，是一种低毒高效的非病毒基因载体，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺 非病毒转基因载体的制备方法。

背景技术

基因治疗通过运载目的基因到达靶细胞实现持续表达治疗性蛋白，从而达 到治疗效果。分子生物学的发展和人类基因库的建立推动了基因治疗的临床应 用，使其不仅在治疗遗传性先天疾病和恶性肿瘤等领域发挥优势，并且越来越 广泛的应用于各种普遍性疾病的治疗。大量的临床试验见证了其临床治疗的发 展，然而，到目前为止还没有一例用于人类的转基因产品被FDA批准，其原因 为实现构建安全高效的转基因载体仍然难以实现。

转基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体尽管具有较高的转 染效率，但其所具有的基因毒性和免疫毒性限制它的临床应用，使得目前基因 治疗的应用领域主要集中于癌症和单基因遗传病等。近些年安全可靠的非病毒 转基因载体的快速发展，从一定程度上弥补了病毒载体的不足，将基因治疗拓 展到对于一般性疾病治疗的应用领域。非病毒转基因载体具有制备简单，无免 疫反应和核酸携带量大等优势，尤其是其短期表达目的基因的特性，能够避免 达到治疗目的后转载基因过度表达的负面后果。

非病毒载体主要包括壳聚糖，脂质体，聚乙烯亚胺(PEI)，树枝状高聚物 (Dendrimer)等，通过静电作用与DNA复合形成纳米微球进行基因转染。其中， 壳聚糖(Chitosan)作为唯一的天然阳离子多糖，具有良好的生物相容性，可降解， 无细胞毒性，其所携带的氨基阳离子能够复合DNA形成纳米微球，因而应用 于非病毒转基因载体并被广泛的研究。但转染效率较低，大量的研究都集中于 对其改性以提高转染效率。聚乙烯亚胺(PEI)是一种具有较高转染效率的阳离子 聚合物，其单体为-CH₂-CH₂-NH-，尤其是它具有的“质子海绵效应”使它在多 种细胞和组织中都有良好的基因转染效果。这种效应是由于它具有很强的质子 缓冲能力，通过细胞内吞进入溶酶体后能够改变溶酶体的离子渗透压，引起溶 酶体膜破裂并释放所携带的DNA。但由此所带来的细胞毒性也限制了它的进一 步临床应用。低分子量的聚乙烯亚胺毒性有所降低，但同时转染效率也降低了。

结合壳聚糖的生物相容性和聚乙烯亚胺的转染效率，有望开发出一种安全 高效的转基因载体，但目前用于构建共聚物的化学链接都为不可降解的链接， 并不能完全充分发挥壳聚糖和聚乙烯亚胺各自的优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供一种壳聚糖接 枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方法。

本发明提供一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方法，其 包括如下步骤：

获得巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖；

将所述巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖进行氧化反应，形成二硫键，获 得所述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体。

以及，提供上述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方法获得 的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体在基因转染中的应用。

本发明提供的一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方法， 其采用具有还原敏感性的双硫键作为交联键，交联聚乙烯亚胺和壳聚糖。该方 法获得的具有还原敏感性的双硫键的壳聚糖接枝乙烯亚胺新型基因载体材料， 具有“质子海绵效应”，能够有效复合DNA形成纳米微球，携带其进入细胞。 二硫键能够被细胞内高浓度的谷胱甘肽降解，将其应用于构建转基因载体，能 够实现在制备和投递的过程中稳定的装载目的基因，而在携带基因进入细胞后 被降解断链，不仅能够降低高分子量载体所致细胞毒性，且能过实现快速的释 放基因，有利于其后续的表达。可降解的聚二硫氨显示了提高的基因转染效率 和降低的细胞毒性。而由其链接的聚乙烯亚胺也显示了较好的转染效率。进一 步，该制备方法简单，条件温和，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例4制备的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的 红外光谱图；

图2是本发明实施例4制备的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体、 壳聚糖和PEI25K的细胞毒性；

图3是本发明实施例4制备的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体、 壳聚糖、PEI25K和脂质体的转染效率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实 施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方 法，其包括如下步骤：

S01：获得巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖；

S02：将所述巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖进行氧化反应，形成二硫键， 获得所述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体。

步骤S01中，巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖均可以通过现有技术制备 或者市售获得。如所述巯基化聚乙烯亚胺可以通过支链氨基与巯基羧酸反应获 得，也可以通过先与异型双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-3-(2-吡基二硫)- 丙酸酯（SPDP）反应获得硫代聚乙烯亚胺，然后加入还原剂还原，获得所述巯 基化聚乙烯亚胺。由于所述巯基化壳聚糖含有氨基，因此可以通过选用与巯基 化聚乙烯亚胺制备方法类似的方法获得。所述还原剂可以为二硫苏糖醇（DTT）、 2-巯-乙醇和巯基乙酸等。优选地，所述巯基化聚乙烯亚胺的巯基与聚乙烯亚胺 的摩尔比为1:1，所述巯基化壳聚糖的巯基与壳聚糖的摩尔比为1:1～4:1。

其中，具体的，巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖可以采用下述方法获得：

S11：将SPDP先溶于DMSO中，然后滴加到聚乙烯亚胺的PBS缓冲液(PBS， 1mM EDTA，0.02%叠氮钠,pH7)，常温搅拌反应，用透析袋透析除去未反应的 SPDP，得到硫代聚乙烯亚胺，向硫代聚乙烯亚胺中加入二硫苏糖醇（DTT）， 反应后用透析袋透析纯化，获得所述巯基化聚乙烯亚胺，反应如下所示： 其 中，n₃为19～38；

S12：将壳聚糖先用少量醋酸缓冲液溶解，再溶于PBS缓冲液(PBS，1mM EDTA，0.02%叠氮钠,pH7)，将SPDP先溶于DMSO中，然后滴加到壳聚糖的 溶液中，搅拌反应，用透析袋透析除去未反应的SPDP，得到硫代壳聚糖，向 硫代壳聚糖水溶液中加入二硫苏糖醇，反应后用透析袋透析纯化，获得所述巯 基化壳聚糖，反应如下所示；

步骤S11中，所述聚乙烯亚胺低分子量聚乙烯亚胺，更优选的，聚乙烯亚 胺的分子量为800~1800Da。例如，具体为将低分子量聚乙烯亚胺溶于PBS缓 冲液(PBS，1mM EDTA，0.02%叠氮钠,pH7)，将SPDP先溶于DMSO中，然 后滴加到聚乙烯亚胺的溶液中，常温搅拌反应24h，用截留分子量小于聚乙烯 亚胺分子量的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫代聚 乙烯亚胺。在硫代聚乙烯亚胺水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用 截留分子量小于聚乙烯亚胺分子量的透析袋在惰性气体保护下于去离子水中透 析一天纯化，得到巯基化聚乙烯亚胺。SPDP与聚乙烯亚胺的摩尔比为3:1~1:1。

步骤S12中，所述壳聚糖为高脱乙酰度壳聚糖，更优选地，所述壳聚糖的 脱乙酰度大于90%，所述壳聚糖的分子量优选为5kDa～100kDa。例如，具体 为将分子量为10kDa的壳聚糖先溶于少量50mM醋酸缓冲溶液中，然后溶于 PBS缓冲液(PBS，1mM EDTA，0.02%叠氮钠，pH7)中，将SPDP先溶于DMSO 中，然后滴加到壳聚糖的溶液中，常温搅拌反应24h，用截留分子量3500Da 的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫代壳聚糖。在硫 代壳聚糖水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子量3500Da 的透析袋在惰性气体保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化壳聚糖。 SPDP与壳聚糖的摩尔比为4:1～32:1。其中，n₁+n₂=30~617，n₂/(n₁+n₂)>90%。

步骤S02为本领域的技术人员所熟知的。巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚 糖在空气环境下搅拌氧化，反应时间为2～6天，优选为4天。该制备方法简单 且易于控制。所述巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖的摩尔比优选为2.8:1～ 23:1。更优选地，所述巯基化聚乙烯亚胺和巯基化壳聚糖的摩尔比为4:1。步 骤S02具体为，将巯基化壳聚糖和巯基化聚乙烯亚胺水溶液混合，空气中搅拌 氧化4天，用截留分子量12000Da的透析袋在去离子水中透析两天除去未反应 的硫化壳聚糖和硫化聚乙烯亚胺，冷冻干燥得到白色固体，即为目标产物还原 敏感壳聚糖接枝聚乙烯亚胺基因载体。反应式如下所示：

由上所述，上述实施例提供的一种壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因 载体的制备方法，其利用还原敏感性双硫键作为一种可逆交联键，构建壳聚糖 和低分子量聚乙烯亚胺共聚物的非病毒载体。聚乙烯亚胺和壳聚糖的巯基化方 法简单易行，原料便宜易得，且该方法获得的基因载体，细胞毒性低，生物相 容性好，显著提高了转染效率。

本发明还提供上述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的制备方法获 得的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体在基因转染中的应用，其中，在 基因转染技术中，所述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体的浓度为5 μg/mL～2mg/mL，优选地，与DNA的复合质量比为15:1~25:1（壳聚糖接枝聚 乙烯亚胺:DNA），所达到的基因转染效率高于高分子量的PEI，与Lipofectamin 相当。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例1：

反应溶液为PBS缓冲液(PBS，1mM EDTA，0.02%叠氮钠,pH7)，取5mg 分子量1800Da的聚乙烯亚胺溶于1mL的PBS缓冲液中，2.5mg SPDP先溶于25 μL的DMSO中，然后滴加到聚乙烯亚胺的溶液中，常温搅拌反应24h，用截留 分子量1000Da的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫代 聚乙烯亚胺。取10mg分子量10000Da脱乙酰度92%的壳聚糖先溶于50mM醋酸 缓冲溶液中，然后溶于总体积为1mL的反应溶液中，将1.25mg SPDP先溶于25 μL的DMSO中，然后滴加到壳聚糖的溶液中，常温搅拌反应24h，用截留分子 量3500Da的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫代壳聚 糖。

在硫代壳聚糖水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子量 3500Da的透析袋在氮气保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化壳聚 糖；在硫代聚乙烯亚胺水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子 量1000Da的透析袋在氮气保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化聚乙 烯亚胺。

将巯基化壳聚糖和巯基化聚乙烯亚胺水溶液混合，空气中搅拌氧化4天，用 截留分子量12000Da的透析袋在去离子水中透析两天除去未反应的硫化壳聚糖 和硫化聚乙烯亚胺，冷冻干燥得到白色固体，获得所述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺 非病毒转基因载体。

实施例2：

反应溶液为PBS缓冲液(PBS，1mM EDTA，0.02%叠氮钠,pH7)，取5mg 分子量1800Da的聚乙烯亚胺溶于1mL的PBS缓冲液中，常温搅拌反应24h，用 截留分子量1000Da的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到 硫代聚乙烯亚胺。取5mg分子量10000Da脱乙酰度92%的壳聚糖先溶于50mM 醋酸缓冲溶液中，然后溶于总体积为1mL的反应溶液中，将1.25mg SPDP先溶 于25μL的DMSO中，然后滴加到壳聚糖的水溶液中，常温搅拌反应24h，用截 留分子量3500Da的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫 代壳聚糖。

在硫代壳聚糖水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子量 3500Da的透析袋在氮气保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化壳聚 糖；在硫代聚乙烯亚胺水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子 量1000Da的透析袋在氮气保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化聚乙 烯亚胺。

将巯基化壳聚糖和巯基化聚乙烯亚胺水溶液混合，空气中搅拌氧化4天，用 截留分子量12000Da的透析袋在去离子水中透析两天除去未反应的硫化壳聚糖 和硫化聚乙烯亚胺，冷冻干燥得到白色固体，获得所述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺 非病毒转基因载体。

实施例3：

反应溶液为PBS缓冲液(PBS，1mM EDTA，0.02%叠氮钠,pH7)，取5mg分 子量1800Da的聚乙烯亚胺溶于1mL的PBS缓冲液中，常温搅拌反应24h，用截 留分子量1000Da的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫 代聚乙烯亚胺。取2.5mg分子量10000Da脱乙酰度92%的壳聚糖先溶于50mM醋 酸缓冲溶液中，然后溶于总体积为1mL的反应溶液中，将1.25mg SPDP先溶于 25μL的DMSO中，然后滴加到壳聚糖的水溶液中，常温搅拌反应24h，用截留 分子量3500Da的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫代 壳聚糖。

在硫代壳聚糖水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子量 3500Da的透析袋在氮气保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化壳聚 糖；在硫代聚乙烯亚胺水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子 量1000Da的透析袋在氮气保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化聚乙 烯亚胺。

将巯基化壳聚糖和巯基化聚乙烯亚胺水溶液混合，空气中搅拌氧化4天，用 截留分子量12000Da的透析袋在去离子水中透析两天除去未反应的硫化壳聚糖 和硫化聚乙烯亚胺，冷冻干燥得到白色固体，获得所述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺 非病毒转基因载体。

实施例4：

反应溶液为PBS缓冲液(PBS，1mM EDTA，0.02%叠氮钠,pH7)，取5mg分 子量1800Da的聚乙烯亚胺溶于1mL的PBS缓冲液中，常温搅拌反应24h，用截 留分子量1000Da的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫 代聚乙烯亚胺。取1.25mg分子量10000Da脱乙酰度92%的壳聚糖先溶于50mM 醋酸缓冲溶液中，然后溶于总体积为1mL的反应溶液中，将1.25mg SPDP先溶 于25μL的DMSO中，然后滴加到壳聚糖的水溶液中，常温搅拌反应24h，用截 留分子量3500Da的透析袋在去离子水中透析一天除去未反应的SPDP，得到硫 代壳聚糖。

在硫代壳聚糖水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子量 3500Da的透析袋在氮气保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化壳聚 糖；在硫代聚乙烯亚胺水溶液中加入二硫苏糖醇，常温反应2h后用用截留分子 量1000Da的透析袋在氮气保护下于去离子水中透析一天纯化，得到巯基化聚乙 烯亚胺。

将巯基化壳聚糖和巯基化聚乙烯亚胺水溶液混合，空气中搅拌氧化4天，用 截留分子量12000Da的透析袋在去离子水中透析两天除去未反应的硫化壳聚糖 和硫化聚乙烯亚胺，冷冻干燥得到白色固体，获得所述壳聚糖接枝聚乙烯亚胺 非病毒转基因载体。

将实施例4制备的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体与溴化钾混合 后压片，在Perkin-Elmer spectrum BX的红外光谱仪上，扫描红外光谱，参见图 1。图谱上可见壳聚糖位于1640cm^-1处的C=O伸缩振动峰，1563cm^-1处N-H 对称弯曲振动和位于1077cm^-1处C-O的伸缩振动峰；同时可见PEI位于1660 cm^-1处NH₂的振动峰和1139cm^-1处C-N伸缩峰；以及再形成聚合物后出现在 910cm^-1和840cm^-1处的C-S伸缩振动峰。

壳聚糖接枝聚乙烯亚胺基因载体的细胞毒性

COS-1细胞(1×104/孔)接种于96孔培养板，过夜培养至细胞贴壁。用PBS 洗涤后，加入含不同量的以过滤除菌的壳聚糖、实施例4制备的还原敏感壳聚 糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载体(Chitosan-ss-PEI)和PEI25K的100μL/孔培 养基，不含材料的培养基作为对照。培养24小时后换成新鲜培养基再培养48 小时。用PBS洗涤，加入新鲜培养基100μL和10μL MTT(5mg/mL)溶液，继 续培养4h后，去除培养基，加入100μL/孔的DMSO，震荡10分钟后，用酶 标仪上测570nm和690nm的吸光值，按以下公式计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=×100%

结果表明还原敏感壳聚糖接枝聚乙烯亚胺基因载体的细胞毒性远小于 PEI25K，当浓度达到100μg/mL时一直保持80%以上的细胞存活率，表明载体 具有良好的生物相容性，对比结果参见附图2。

壳聚糖接枝聚乙烯亚胺基因载体的细胞转染效率的测定

pGL-3 control转染细胞：COS-1细胞（6×104/孔）接种于24孔培养板， 过夜培养至细胞融合度为70～80%时，用PBS洗涤后加入450μL不含抗生素 的培养基。将壳聚糖、实施例4制备的壳聚糖接枝聚乙烯亚胺非病毒转基因载 体（Chitosan-ss-PEI）和PEI25K用0.22μm过滤除菌后，按不同的质量比用灭 菌纯水稀释后与pGL-3control质粒DNA溶液混合，培育30分钟后得到复合物。 将含不同复合物总体积为50μL的溶液加入到细胞中，每孔的DNA含量为1μg。 以PEI25K和脂质体Lipofectamine 2000为阳性对照，单纯加质粒DNA为阴性 对照。培养24h后，吸去转染液后，加入完整培养基继续培养48h后测量荧光 素酶的表达。吸去培养基用PBS洗涤后，加入150μL的细胞裂解液裂解30分 钟后，转移至1.5mL的离心管中，12000rpm高速离心5分钟。取50μL上清 液与50μL荧光素梅检测试剂（Promega）反测定相对光单位。另取20μL上清 液进行BCA蛋白含量测试。以每毫克蛋白的相对光单位作为转染效率的评价指 标，结果见图3。结果表明还原敏感壳聚糖接枝聚乙烯亚胺基因载体在最佳质 量比时的转染效率明显高于PEI25K，与Lipofectamine相当。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。