公开/公告号CN102914495A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-02-06
原文格式PDF
申请/专利权人 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所;
申请/专利号CN201210379982.0
申请日2012-10-10
分类号G01N15/14(20060101);
代理机构
代理人
地址 100850 北京市海淀区太平路27号院
入库时间 2024-02-19 17:18:13
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-04-15
授权
授权
2013-03-27
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N15/14 申请日:20121010
实质审查的生效
2013-02-06
公开
公开
技术领域
本发明涉及细胞的检测方法,具体涉及一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价 方法。
技术背景
外周血淋巴细胞是电离辐射的敏感细胞,是研究电离辐射致DNA损伤的细胞模型之一。 γ-H2AX蛋白质是DNA损伤后发生改变的分子,是DNA损伤的特异性分子。对γ-H2AX 蛋白质的检测可以评价DNA损伤情况,对于研究DNA损伤的分子机制有广泛地应用。流式 细胞仪具有快速、高通量等特点,可以检测细胞内γ-H2AX蛋白质的含量。目前利用流式细 胞仪分析外周血淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质的含量的方法存在实验重复性差,不同个体来源 外周血样品之间差异大等问题,这些问题是因为缺少对照细胞,增加实验误差所引起的。
发明内容
本发明的目的是解决流式细胞仪分析外周血淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质含量的方法存在 实验重复性差,不同个体之间差异大等问题。我们的研究发现电离辐射后外周血淋巴细胞中 γ-H2AX蛋白质含量增加,而粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量不受电离辐射影响,可以作为分 析淋巴细胞中γ-H2AX蛋白质含量的对照细胞,采用γ-H2AX的RL/G值(淋巴细胞的γ -H2AX蛋白质含量与粒细胞中γ-H2AX蛋白质含量的比值)来评价电离辐射后外周血淋巴细 胞DNA损伤程度。本发明提供一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法。该方 法操作简单,结果稳定,可以广泛应用于诊断、细胞生物学研究等领域。
本发明的一种电离辐射致外周血淋巴细胞DNA损伤的评价方法包括下列步骤:
1)外周血样品有核细胞的固定;
2)洗涤细胞,去除固定液;
3)加入破膜剂对有核细胞破膜,裂解红细胞;
4)洗涤细胞,去除破膜剂;
5)加入荧光标记的抗γ-H2AX蛋白质的特异性抗体;
6)洗涤细胞,去除未结合的抗体;
7)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值,即为γ-H2AX蛋白质的含量;
8)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值,即为γ-H2AX蛋白质的含量;
9)计算步骤7)中淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与步骤8)中粒细胞中γ-H2AX蛋白 质含量的比值——γ-H2AX的RL/G值;
10)DNA损伤程度的判断方法
γ-H2AX的RL/G值<1.5为正常;γ-H2AX的RL/G值>1.5为DNA损伤,γ-H2AX的 RL/G值越大,DNA损伤越严重。
附图说明
图1:不同剂量γ射线照射后外周血淋巴细胞和粒细胞中γ-H2AX蛋白含量变化。
图2:62名未受照射人外周血γ-H2AX的RL/G值,平均值为1.21±0.12(1.01~1.54)。
图3:不同剂量γ射线照射后外周血γ-H2AX的RL/G值的变化。
具体实施方式
实施例
1)利用肝素抗凝管取健康人外周血0.9ml,平均分为3份,每份0.3ml,其中第1份未照 射,第2份经2Gyγ射线照射,第3份经6Gyγ射线照射;
2)血样加入1.5ml固定液(2%多聚甲醛溶液),室温作用30分钟;
3)室温离心(500g)5分钟,去上清;
4)利用1.5ml PBS缓冲液对细胞沉淀进行洗涤,室温条件下离心(500g)5分钟,去除 上清,保留沉淀;
5)加入1.5ml浓度为0.4%的Triton-100溶液,混匀细胞沉淀,室温作用15min;
6)室温条件下离心(500g)5分钟,去上清;
7)加入1.5ml PBS缓冲液洗涤细胞,室温离心(500g)5分钟,去除上清,保留细胞沉 淀;
8)重复步骤6);
9)在细胞沉淀中加入小鼠抗人γ-H2AX抗体100μl(1∶200倍稀释),混匀后37℃条件 下作用30min;
10)1.5mlPBS洗涤细胞,保留细胞沉淀,去除未结合的抗体;
11)重复步骤9);
12)加入100μl FITC标记的兔抗小鼠IgG(第二抗体,1∶200倍稀释),混匀后37℃避光 作用30分钟;
13)1.5mlPBS缓冲液洗涤细胞,弃上清;
14)重复步骤12);
15)流式细胞仪检测样品中淋巴细胞对应的荧光强度值,即为淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质 的含量;
16)流式细胞仪检测样品中粒细胞对应的荧光强度值,即为粒细胞的γ-H2AX蛋白质的含 量;
17)计算步骤15)中淋巴细胞的γ-H2AX蛋白质含量与步骤16)中粒细胞中γ-H2AX蛋 白质含量的比值——γ-H2AX的RL/G值;
18)DNA损伤程度的判断方法:
19)γ-H2AX的RL/G值<1.5为正常;γ-H2AX的RL/G值>1.5为DNA损伤,γ-H2AX 的RL/G值越大,DNA损伤越严重。
机译: 稳定感染HIV的个体的CD4细胞数量的过程。用于降低HIV阳性和个体外周血中血清IL6的血浆病毒载量和外周血淋巴细胞凋亡程度,用于制备用于稳定个体HIV阳性的CD4细胞的组合物,以及用于降低血浆中病毒载量和淋巴细胞凋亡程度的组合物u00ecduos HIV阳性外周血
机译: 测定外周血外周血细胞外DNA组成中基因组(GC-DNA)富含GC序列的测定,作为确定妊娠细胞死亡水平的一种方法
机译: 用于从外周血中诱导活化的T淋巴细胞的培养物组合物,包含其的培养盒以及使用该方法从外周血中诱导活化的T淋巴细胞的方法