hSCARB2基因转殖鼠的制造及其做为肠病毒感染动物模式的应用

摘要

本发明是关于EV71接受体SCARB2基因转殖鼠的制造，本发明所制得的SCARB2基因转殖鼠可做为手足口病，例如肠病毒71型或克沙奇病毒16型(Coxsackie A16)感染的动物模式，以供评估肠病毒疫苗免疫保护功效，及肠病毒感染的病理研究上的应用。

说明书

技术领域

本发明是关于肠病毒感染动物模式的制备，更特别地是关于SCARB2基因 转殖鼠的制造，以及其做为手足口病的动物模式上的应用。

背景技术

肠病毒71型(EV71)已被证实会引起手足口病(HFMD)、疱疹性咽峡炎，和 神经系统的病变如无菌性脑膜炎、脑炎及类小儿麻痹症候群，甚至在婴幼儿造 成致死疾病，并且在全世界爆发严重的疫情(AbuBakar et al.，1999，Virus Res 61(1)， 1-9；Chang，Huang，and Lin，1998，Lancet 352(9125)，367-8；Bible et al.，2007，Rev  Med Virol 17(6)，371-9)。及至今日，透过公共卫生对肠病毒71型疫情的控制与 医疗照护仍显不足。目前并没有疫苗可供临床适用。因此，研究肠病毒71型感 染的机制，以供开发有效的治疗药物或预防性疫苗实属重要。

现已知有多种动物模式被发展，欲应用于研究EV71感染的致病原因(参见， 例如Chen et al.，2004，J Gen Virol 85(Pt 1)，69-77；Nagata et al.，2004，J Gen Virol 85(Pt 10)，2981-9；Ong et al.，2008，J Neuropathol Exp Neurol 67(6)，532-42；Weng  et al.，2010，Infect 12(7)，505-10)。而目前使用的肠病毒动物模式，是利用新生一 天大的ICR小鼠，以EV71感染进行人为发展而得，新生的ICR小鼠在EV71 感染后会出现后肢麻痹，并且最后在受感染2周内死亡(Wu et al.，2001，Vaccine 20(5-6)，895-904)。然而，由于该ICR小鼠仅适用于，评估小鼠对于肠病毒感染 或疫苗引起的免疫反应，无法真正模拟在人类受到感染后所引发的免疫反应。 同时，由于该小鼠模式并未呈现肠病毒感染后的HFMD症状，故利用其所进行 的研究观察只局限于，肠病毒感染后小鼠的存活率及神经性毒性，无法确实应 用在评估药物或疫苗，对于肠病毒感染的治疗及/或预防功效。此外，目前使用 的ICR小鼠因为免疫系统发育不全，可能无法充分反应肠病毒EV71的毒性， 及了解其对于神经系统的影响。

再者，目前使用的ICR小鼠是利用小鼠适应过的肠病毒株(mouse-adapted EV71 strain，参见Wang et al.，2004，J Virol 78(15)，7916-24)进行感染试验，但由 于该病毒并没有存在于自然界，故无法使受感染的ICR小鼠表现出真正的，天 然流行肠病毒株感染后应有的HFMD症状及神经性毒性(Perez-Velez et al.，2007， Clin Infect Dis 45(8)，950-7)。且经研究发现，以自然界流行的肠病毒株感染已知 的成年ICR、Balb/c、CH3、C57BL/6等实验用小鼠(这些皆不表现EV71接受体) 后，都完全不会引起HFMD症状及神经性毒性(Wang，2004，如前述；Chen et al.， 2004，J Gen Virol 85(Pt 1)，69-77)。

近来研究发现，人类清道夫接受体B类，膜蛋白质2型(human scavenger  receptor class B，member 2；hSCARB2)是肠病毒71型及克沙其病毒16型 (Coxsackie A16)进入细胞的接受器(Yamayoshi et al.Nat Med 15(7)：798-801， 2009)，虽然小鼠SCARB2与人类SCARB2(hSCARB2)具有85.8％同源性，但显示 其不作为EV71的受体。本发明遂建立hSCARB2基因转殖鼠作为肠病毒实验动物 感染模式，以期仿真肠病毒的感染途径，研究其引起手足口病和神经系统病变 的致病机转，并藉以评估肠病毒疫苗在此动物模式中的免疫保护效力，以及候 选治疗性药物或疫苗对于肠病毒感染的防治功效，以增进对肠病毒感染致病机 制的了解，以及应用于有效肠病毒疫苗的研发。

发明内容

本发明是基于发现，人类清道夫接受体B类，膜蛋白质2型(以下简称 SCARB2)为肠病毒进入细胞的接受器，遂建立SCARB2基因转殖鼠作为肠病毒 71型实验动物感染模式，应用于研究EV71引起的神经系统病变机转，及分析 EV71疫苗的保护作用，以开发有效的治疗药物或是预防肠病毒感染相关疾病的 疫苗。

于是，本发明一方面是关于，一种制造SCARB2基因转殖鼠的方法，其包 含：将经由微注射入受Elongation factor-1启动子(EF-1αpromoter)驱动的人类 SCARB2蛋白基因(SEQ ID NO.1)的小鼠胚胎，转殖到同品系母鼠中使其发育成 鼠；利用PCR分析筛检出带有SCARB2蛋白基因型的阳性小鼠，与原生型同品 系小鼠互相交配，生成F0小鼠；再次以PCR分析筛选出其基因型为异核型 (heterozygous)的阳性F0小鼠，并使呈阳性F0小鼠互相交配生成F1小鼠；利用 PCR分析筛选得其基因型为同核型(homozygous)的阳性F1小鼠，而得SCARB2 基因转殖鼠；以及利用RT-PCR分析确认F1基因转殖鼠在主要器官表达SCARB2 蛋白。

于本发明的一具体实施例，用于基因转殖的小鼠是C57BL/6小鼠。于本发 明的另一具体实施例，用于基因转殖的小鼠是FVB小鼠。

本发明的SCARB2基因转殖鼠于自然界流行的肠病毒株感染后，会呈现手 足口病(HFMD)的症状和神经系统的病变。因此，该SCARB2基因转殖鼠可应用 做为手足口病的动物模式。于本发明的一具体实施例，其是用做为肠病毒71型 的感染动物模式。于本发明的另一具体实施例，其是用做为克沙奇病毒16型 (Coxsackie A16)的感染动物模式。

于另一方面，本发明是关于一种检测肠病毒疫苗保护效力的方法，利用上 述制造SCARB2基因转殖鼠的方法所制得的hSCARB2基因转殖鼠为动物模式， 评估候选肠病毒疫苗在疫苗接种后施予肠病毒攻毒时，对于已受免疫的 hSCARB2基因转殖鼠所产生的抗病毒保护效力。

于另一方面，本发明是关于一种筛选出可有效预防或治疗因肠病毒感染所 引起的手足口病的疫苗或药物的方法。于本发明的一具体实施例，该药物为一 种预防性疫苗。于本发明的另一具体实施例，该药物为一种抗-肠病毒71型的中 和抗体。

附图说明

图1为用于本发明方法的携带有人类基因的表现载体pEF-1α-hSCARB2的 图谱。

图2显示藉由使用SCARB2-专一性引子进行PCR反应，筛选出带有人类基 因的founder小鼠(A)，及所获得F1、F2 Tg小鼠(B)的结果。图2(C)显示人类 SCARB2在SCARB2-转殖基因鼠的主要器官中的表现。

图3为藉由使用VP1-专一性引子进行RT-PCR反应，测定于肠病毒 EV71/E59感染后第1至4天，病毒在SCARB2-Tg B6小鼠中的分布情形。

图4为于施予接种后4至6天，在仅接种培养基(A)、非转殖基因小鼠(C) 及以10⁷ pfu EV71/E59感染的hSCARB2-Tg转殖基因鼠(B)所观察的类手足口病 (HFMD)，包括掉毛与皮屑产生情形。

图5为感染后第8天至12天期间，所观察到的行动困难与后肢麻痹的计分 图。

图6为以VP-1专一性RT-PCR侦测病毒感染后期(感染后12天)，于小鼠 中枢神经系统及主要器官的EV-71病毒分布。

图7显示以同型抗体(□)及以抗EV-71抗体处理(■)的hSCARB2-Tg 转殖基因鼠，在对抗病毒感染EV715746-TW98的存活率。

具体实施方式

本发明的其他特色及优点将于下列实施范例中被进一步举例与说明，而该 实施范例仅作为辅助说明，并非用于限制本发明的范围。

根据本发明所呈现的各种实施例，下述各种仪器、装置、方法和其相关结 果者，实施例中为了方便读者阅读所使用的标题或副标题，并不被限制在本发 明的范围之内。此外，在此所提出和披露的某些理论，但无论他们是对还是错， 只要该创作是根据本发明所实施的，而不需考虑任何特定的理论或行动的计划， 都应被限制在本发明的范围之内。

实施例

实施例一：SCARB2基因转殖鼠的制备

将所合成得具有密码子最适化的人类SCARB2基因(SEQ ID NO.1)片段使用 EcoRI与BamHI限制酶，插入pEF-1α质体(该质体是以pcDNA3.1(-)载体 (Invitrogen)为背景经修改后而得的载体，其中原有的巨细胞病毒增效子/启动子 以增长因子1α(EF-1α)的启动子取代)中，位于启动子与牛生长激素(BGH)聚A 尾端间的多重选殖部位(multiple cloning site)，而得到pEF-1α-hSCARB2构体(图 1)。

基因转殖动物的产生是依照Brinster等人(Brinster et al.，1985)所述的操作步 骤来进行。所使用的C57BL/6小鼠购自国家应用研究实验室-实验动物中心 (National Applied Research Laboratories-Laboratory Animal Center，台湾)。进行显 微注射前先将质体以限制酵素线形化，并使用凝胶萃取套组(Qiagen，德国)将其从 琼脂糖凝胶(Thermo Fisher Scientific，IL，USA)中回收得。

将1ng线形pEF-1α-hSCARB2构体经由显微注射，导入处于单细胞阶段的 已受精的C57BL/6小鼠胚胎中，接着将该胚胎植入到同品系假怀孕的母鼠内使 其发育成鼠。利用PCR分析筛检出带有hSCARB2蛋白基因型的阳性小鼠，与 原生型同品系小鼠互相交配，生成F0小鼠。

PCR分析方法简述如下：使用组织与细胞基因组DNA萃取套组(Tissue & Cell genomic DNA extraction kit，Favorgen，台湾)从基因转殖鼠尾部萃取出基 因组DNA。藉由使用前向引子：5’-TGGACCAGAGCATCGAGAA-3’(SEQ ID  NO.2)与反向引子：5’-TAGGTGTAGGGGCCCACTT-3’(SEQ ID NO.3)于72℃下 2分钟进行的PCR反应扩增一段长度为175bp的片段(SEQ ID NO.1的98-272 bp)，以侦测hSCARB2基因是否存在基因组DNA中。用于进行PCR反应的条 件设定如下：于95℃下2分钟；随后进行40次包括于95℃下30秒、于50℃下 30秒与于72℃下10秒的循环周期；之后再于72℃下反应2分钟。

结果筛检出六只带有转殖基因的小鼠-No.2(雄性，m)、No.9(雌性，f)、 No.18(m)、No.27(f)、No.54(m)及No.62(f)(参见图2A)。再次以PCR分析 筛选出其基因型为异核型(heterozygous)的阳性F0小鼠，并使呈阳性F0小鼠互 相交配生成F1小鼠；利用PCR分析筛选得其基因型为同核型(homozygous)的阳 性F1小鼠，而得hSCARB2基因转殖鼠(结果参见图2B)。藉由将所得的 hSCARB2基因转殖鼠个体彼此进行交配，获得F1近亲交配种小鼠，以维持该 基因转殖纯系。

进一步以前述的hSCARB2特异性引子对及购自Roche Universal Probe  Library Assay Design Center(Roche，Switzerland)的探针组，进行RT-PCR分析 (The480 Real-Time PCR system)，来确认及定量人类SCARB2蛋白 在F1基因转殖鼠的主要器官中的表达。PCR产物大小为97bp。使用不同浓度 (5、0.5及0.05pg/ml)的pEF-1α-hSCARB2质体为标准物。比较用以从各器官扩 增hSCARB2基因所需要的循环次数。

结果显示，在取自基因转殖小鼠的包括脑干、大脑皮质、延脑与脊髓等中 枢神经组织，以及肺、肝、脾、肾、十二指肠、小肠等主要器官及皮肤中，皆 发现有表现hSCARB2转殖基因(图2C)。

实施例二：SCARB2基因转殖鼠受肠病毒感染后的病毒血症及手足口病 (HFMD)和神经系统病变的症状分析

将1-天或4-天大的小鼠经皮下注射，接种入肠病毒EV71E59或5746-tw98 分离株(每只小鼠施予1x10⁶或1x10⁷pfu，存在10μL RPMI培养基中)，以模拟 观察新生小鼠受病毒感染后，肠病毒于小鼠主要器官中的分部情形，及外在所 发生的病症。对照组施给VP-SFM培养基。对于肠病毒EV71的侦测，为将经 感染的小鼠于特定天数后将其牺牲，采取血液或器官组织样本，并针对VP1基 因进行专一性的即时(real-time)RT-PCR。

将自血液样本或组织均质化产物萃取得的总体RNA，进行反转录反应转变 成cDNA。再将所得的cDNA使用EV71 VP1专一性引子对，前向引子：5’ -AGAGAGTCACTTGCTTGGCAGACA-3’(SEQ ID NO.4)与反向引子：5’ -ACGACTAGTGCCGGTCGGTTTAAT-3’(SEQ ID NO.5)，进行定量PCR分析 来侦测EV71的存在量。

由图3的结果显示，于肠病毒EV71感染后1至6天，在SCARB2-Tg B6 转殖基因鼠的中枢神经(脑与脊髓)及肝脏、肺脏、小肠、肾脏、脾脏、皮肤等， 侦测到有病毒存在。此外，相对于SCARB2-转殖基因鼠，于非转殖基因鼠的神 经器官(脑，脊髓)和主要器官(肝、肺、肾、皮肤等)皆侦测不到病毒量分布，表示 hSCARB2的表现对于EV71在小鼠中的可感染力而言很重要。

除了测定病毒量分布，亦于施予病毒感染后，每天观察于对照组和实验组 小鼠产生的手足口病(HFMD)及神经性毒性(CNS)症状。病理分析发现，以肠病 毒71型E59B型病毒株感染一天大的SCARB2基因转殖鼠，会使受感染小鼠 产生类似出现在人类受肠病毒EV71-感染幼儿的红疹，且有严重毛发掉落伴随皮 屑(scurf)产生，这些症状皆为典型的类手足口病症状(HFMD-like syndrome)(参见 图4)。而且，在施予感染的转殖基因鼠亦出现包括前后足麻痹，而导致行走困 难的神经系统病症(CNS-like syndrome)。在感染后7天开始，转殖基因鼠即出现 后肢麻痹伴随行动困难的现象，而非转殖基因鼠在感染后并未呈现此类似病症， 关于在感染后第8天至12天期间，所观察到的行动困难与后肢麻痹的计分结果 列示于图5。

而且由图6的病毒分布侦测结果显示，在施予病毒感染后第12天，于已发 生后肢麻痹的小鼠的脊髓中可侦测到，但是在没有呈现任何行走困难的非转殖 基因鼠，则没有侦测到病毒，表示所观察到的CNS病症，是由于脊随受到肠病 毒感染所致。

前述的观察结果均显示，以肠病毒71型感染新生SCARB2基因转殖鼠， 确实会产生类似于肠病毒感染在人类婴儿所引起的症状。亦即，本发明的 SCARB2基因转殖鼠可有效做为，天然存在的肠病毒感染的动物模式。

实施例三：以SCARB2基因转殖鼠检测抗EV-71抗体对于肠病毒感染的防 治功效

本实施例藉由将已知具有肠病毒中和活性的抗EV-71单株抗体，投药予预 先经天然EV71 5746-TW98肠病分离毒株感染的SCARB2基因转殖鼠，并检测 该单株抗体对于保护小鼠对抗肠病毒感染的功效，以评估及证明本发明的 SCARB2基因转殖鼠，做为抗肠病毒药物筛选平台的实用性。

实验方法简述如下：将7天大的SCARB2基因转殖鼠以皮下方式，注射入 剂量为3x10⁴ pfu的EV71 5746-TW98肠病毒株进行感染。接着在注射病毒4小 时后进行投药，将该经过肠病毒株感染的SCARB2基因转殖鼠以腹膜内注射方 式，投药以200μg的同型小鼠IgG1抗体(做为对照组)，或抗EV-71单株抗 体(已被鉴定具有中和活性，参见Chang，HW et al.，Journal of Virological Methods 7(1)：62，2011)。

图7列示于同型抗体处理组(口，对照组，总数10只小鼠)，及抗EV-71 抗体处理组(■，实验组，总数12只小鼠)所得的存活率观察结果。于hSCARB2 基因转殖鼠可明显区分，EV-71抗体与对照组抗体在抑制受感染小鼠的致死性上 的功效差异，显示本发明的hSCARB2基因转殖鼠可用于评估已知或研发中药物 的抗肠病毒感染功效，或用于评估EV71疫苗在此动物模式中的免疫保护效力。

其他具体态样

本说明书中所揭示的全部特征可以任何组合方式组合。于是，本说明书中 所揭示的各别特征可由依相同、相等或类似目的的替代特征取代。因此，除非 另行清楚地指示，所揭示的各特征仅为一系列同等物或类似特征的实例。

从前述的说明，习于该项技艺人士可容易地确定本发明的基本特征，且在 未偏离其范围下，可进行本发明的各种改变与修饰，以使其适于各种不同用途 与状况。因此，于申请专利范围内亦包含其他具体态样。