乳突果(Adelostemma gracillimum)及其分离的化合物的神经保护作用

摘要

本发明提供来自乳突果(Adelostemma gracillimum)精制级分的分离的化合物以及含有所述化合物的组合物。本发明还提供了乳突果精制级分及其提取方法。本发明还提供了所述化合物和乳突果精制级分在用于抑制NMDA受体或β-淀粉样肽的活性，用于改善记忆和治疗神经退行性疾病、神经病理学疾病状态或癫痫中的用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年3月18日提交的美国专利申请系列第61/315,254号的优先权，在此将其内容通过引用全部并入。引用在光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序清单附录

不适用

发明背景

乳突果(Adelostemma gracillimum)(萝摩科)是见于中国西南部和缅甸的药草。该植物的提取物在民间医学中用于治疗目的已被沿用了数千年。该药草的根被用作滋补强壮药，并且用于治疗小儿惊风症。已经发现乳突果的提取物含有孕烷糖苷(Mu et al.，1992；Gao et al.，2009)。

中枢神经系统(CNS)由多种复杂的途径调控，这些途径监控重要的细胞事件，例如增殖、分化和凋亡(或细胞死亡)。由于凋亡是神经元发育的主要部分，凋亡机理中的缺陷被认为是中风、癫痫和许多神经退行性疾病的疾病病理的部分原因(Raff et al.，1993)。因此，药物开发的一个领域是理解引起神经元存活和凋亡的过程。

研究已经表明包括胰岛素、胰岛素样生长因子-1、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)和神经营养素3和4/5在内的多种生长因子和神经营养因子通过介导诸如EPK和PI 3-激酶途径的特定信号转导级联反应可以促进神经元存活(Segal and Greenberg，1996)。因此，需要鉴定和/或开发能够促进神经元存活，对抗由营养断供引起的凋亡的化合物。

NMDA受体是主要位于CNS中的配体门控离子通道。他们属于离子转移型谷氨酸受体家族，并且由于可以表达的亚基(NR1、NR2(NR2A、NR2B、NR2C、NR2D)和NR3)的不同组合而以多种亚型存在。除了激动剂结合位点，NMDA受体具有针对多种化合物的多个不同的结合位点，所述化合物可以增强、调节和抑制受体的活化。

已知NMDA受体参与神经元通讯并在突触可塑性和学习与记忆的潜在机理中起重要作用。在正常条件下，NMDA受体通过神经递质谷氨酸参与突触传递，所述谷氨酸调节和改善突触的生长和可塑性。然而，当存在异常的高水平谷氨酸(即在病理条件下)时，NMDA受体变为过度活化的，导致过量的Ca²⁺流入神经元细胞，这又导致兴奋性毒性和引发神经元凋亡的几种信号转导途径的活化。谷氨酸诱导的脑组织中的凋亡还伴随氧化应激，其引起ATP减少、线粒体膜电位降低和导致相关的细胞损伤和死亡的反应活性氧类和反应活性氮类(例如H₂O₂、NO、OONO^-、O₂^-)的释放。最终发生神经细胞功能减弱和神经元细胞死亡。如果损害细胞的能量代谢，则兴奋性毒性也发生。

NDMA受体的过度活化与神经退行性疾病和其它神经相关的疾病状态有关，因为其导致神经元缺失和认知障碍，并且还对导致多种神经退行性病症和诸如中风的疾病状态的神经元损伤的最终的共同通路起作用，所述神经退行性病症，例如肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿氏舞蹈症。NMDA受体还与许多其它神经病学病症，例如多发性硬化、脑瘫(脑室周围白质软化)和脊髓损伤，以及慢性和重度心境障碍有关(Mathew SJ et al.，Rev Bras Psiquiatr，27：243-248(2005))。

NMDA受体在调节与促进正常神经系统功能，以及导致细胞死亡从而引起致命疾病状态中起重要作用。已有越来越多的证据表明，给予细胞的信号的类型取决于活化的NMDA受体的位置。活化的突触NMDA受体导致促生长与存活的信号，而突触外的NMDA受体导致引起细胞死亡的信号。近期研究还表明，活化的突触NMDA受体导致转录因子CREB在转录调控残基Ser133上的强磷酸化，并促进CREB依赖的基因表达和神经元存活。然而，活化的突触外NMDA受体瞬时磷酸化CREB而不激活CREB依赖的基因表达，导致神经元细胞死亡(Hardingham et al.，2002)。

因此，很少有兴奋性毒性的有效治疗剂来减轻其相关的神经元病症的症状。开发有效的NMDA拮抗剂作为神经治疗药物的一个困难是许多NMDA拮抗剂还表现出致精神病和神经毒性的特性。例如，MK-801(地卓西平马来酸盐)能够在缺血性中风中提供某些程度的神经保护作用，但是与精神和不利的肌肉运动效果有关。因此，需要鉴定和/或开发能够赋予NMDA突触活性，导致神经保护作用的化合物。

B-淀粉样(Aβ)是源自淀粉样前体蛋白(APP)的裂解产物，其积累为细胞外斑块或老年斑，这是神经退行性疾病阿尔茨海默病(AD)的特征标志。尽管AD的真实原因仍然难以捉摸，在许多报道中已经提到Aβ在该疾病的引发和进展中起作用(Hock et al.，2003)。此外，研究已经表明Aβ是神经毒性的(Hartman et al.，2005)，导致神经元缺失和随后的记忆丧失和认知障碍。向原代神经元培养物添加Aβ后，引发凋亡，导致细胞死亡(Estus et al.，1997)。半胱天冬酶是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族，其通过非活性蛋白酶水解加工成活性酶的顺序活化来参与细胞凋亡。半胱天冬酶-3被认为是凋亡途径的执行者，并且是参与淀粉样前体蛋白的裂解以及Aβ的产生的主要半胱天冬酶，Aβ与阿尔茨海默病中的神经元死亡有关。向神经元培养物中外源添加Aβ启动半胱天冬酶-3依赖性凋亡。因此，开发针对半胱天冬酶-3活化的抑制剂是AD治疗中的一种治疗方法。

树突棘，来自神经元树突的小的膜突起，通常接收来自轴突的单突触输入。树突棘充当突触强度的存储位点并辅助传送电信号至神经元的细胞体。然而，棘需要在形成后成熟。未成熟的棘具有受损的信号转导能力，并且通常仅具有颈部而缺乏或具有非常小的“头部”。成熟的棘具有头部和颈部。具有强突触联系的棘通常具有大的棘头部，其通过膜颈部(蘑菇形)与树突连接(Yuste and Denk，1995)。已报道海马的CA1区以及第III层锥体层的衰老神经元中棘密度降低。在应激的动物中，观察到棘群体的整体转变，以及前额皮质中大棘的减少和小棘的增加(Radley et al.，2008)。棘的减少还与重度抑郁症以及精神分裂症有关(Law et al.，2004)。认知障碍如孤独症、精神发育迟缓、脆性X综合征、中风和慢性酒精中毒可能是树突棘异常的结果，尤其是涉及棘的数量和它们的成熟度(Bhatt et al.，2009；von Bohlen und Halbach et al.，2009)。

癫痫是由表现为痉挛的脑中神经元过度活动构成的临床现象(Fisher et al.，2005)。癫痫痉挛可以是强直性或阵挛性运动的形式，伴有偶发性抽搐和其它神经病学和生理与心理症状。痉挛瞬时发生并且可以由于激怒发生，尽管不是必然地(Aylwar R.，2008)。在世界各地的不同人群中癫痫的发病率估计为约0.3-0.5％，而癫痫的患病率估计为每千人约5-10人，这使得它成为最盛行的神经学病症之一(Shinnar andPellock，2002)。

癫痫通过病因学、可观察到的痉挛活动、脑中痉挛活动的位置、伴随的医学症状，以及引起痉挛活动的起始事件进行分类。区别不同类型的痉挛的主要特征是痉挛活动是局部性(病灶性的同义词)的还是全面性的(Brodie et al.，2009)。目前，有超过40种公认的癫痫类型，它们通过痉挛类型、EEG记录、生理表现、治疗和预后来分类(Badawyet al.，2009年)。体内实验已经表明，在电压和受体门控离子通道中的基因突变是多种类型的痉挛活动的原因(Meisler M，and Keamey J.，2005)。例如，位于GABA能神经元(GABAergic neuron)的电压门控钠通道的失调与婴儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI)有关(Yu et al.，2009)。痉挛也可能由于创伤而发生，例如局部缺血、缺氧、发热和脑炎，它们进而导致神经传递平衡失调(Bialer and White，2010)。神经炎症也与癫痫的病理生理学有关，其中细胞因子引起的炎症反应导致神经元损伤和神经元环境的变化，导致在痉挛中观察到的活动过度(RAVIZZA et al.，2008)。

治疗癫痫的药物是基于抗惊厥药物。目前，有超过20种抗癫痫药物。然而，它们已被报告对患者有副作用，包括情绪变化、嗜睡、或步态不稳(Schmitz，2006)。虽然新一代的抗癫痫药物在安全性、耐受性、和控制癫痫痉挛的药代动力学方面有相当大的改善，但是估计有30％的患者患有耐药性癫痫，从而无法响应多种药物(Andres and Antoaneta，2007)。新的候选药物的开发需要提供用于控制痉挛的具有较少副作用或无副作用的替代靶点，并且更好的疗效对于向癫痫患者提供完全的痉挛控制是必要的。

因此，有必要鉴定和/或开发能够(i)预防和/或治疗CNS病症，例如兴奋性毒性、癫痫、神经退行性疾病和神经病理学疾病状态；(ii)促进神经元的存活，以对抗由营养断供引起的凋亡；及(iii)提高大脑的认知功能的化合物。本发明满足该需求和其它需求。

发明概述

在一些实施方案中，本发明提供了式Ia的化合物：

其中式Ia的基团X是键或-O-；式Ia的R¹是OH；或式Ia的R²是H或OH。或者式Ia的R¹和R²合并成-O-。式Ia的基团R³为C_1-6烷基或C_1-6烷基-OH。式Ia的R^4a、R^4b和R^4c各自独立地为H、OH、C_1-6烷基、或C_1-6烷氧基。R^5a、R^5b、R^5c和R^5d各自独立地为H、OH、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、任选地被C_1-6烷氧基取代的C_2-6烯基、和-C(O)-C_1-6烷基。式I的化合物包括那些化合物，使得：

当X为-O-且R¹为OH时，R³为C_1-6烷基；R^4a和R⁵各自独立地为OH或C_1-6烷氧基；R^4b为OH；R^4c为H、OH或C_1-6烷氧基；R^5a和R^5c各自为H；并且R^5b为C_2-6烯基；

当X为-O-，并且R¹和R²合并成-O-时，R³为C_1-6烷基；R^4a为C_1-6烷氧基；R^4b为OH；R^4c、R^5a、R^5c和R^5d各自为H；并且R^5b为C_2-6烯基；

当X为键，并且R¹为OH时，R²、R^4b、R^5b和R^5c各自为H；R³为OH；R^4a和R^5a各自为C_1-6烷基；并且R^4c和R^5d各自为C_1-6烷氧基；

当X为键并且R¹和R²合并成-O-时，R³为C_1-6烷基或C_1-6烷基-OH；R^4a和R^5a各自为C_1-6烷氧基；R^4b为OH；R^4c为H、OH或C_1-6烷氧基；R^5b为H；R^5c为H或被C_1-6烷氧基取代的C_2-6烯基；并且R^5d为H或C(O)-C_1-6烷基，其中当R³为C_1-6烷基时，R^5d为-C(O)-C_1-6烷基，并且当R³为C_1-6烷基-OH时，R^5d为H；并且

当X为-O-，R¹为OH，R²、R^5a和R^5c各自为H，R³为Me，R^4a和R^5d都是OMe，R^4b为OH，并且R^5b为C₃烯基时，R^4c为OH或C_1-6烷基。

式Ia的化合物包括其盐和异构体。

在其它实施方案中，本发明提供了式IIa的化合物：

其中式IIa的R¹为H、C_1-6烷基或糖。式IIa的基团R²为H或C_1-6烷基。并且式IIa的基团R³为-OH或-NH₂。式IIa的化合物包括其盐和异构体。

在一些其它实施方案中，本发明提供了式III的化合物：

其中式III的R¹、R²或R³各自独立地为H或C_1-6烷基。式III的下标n为8-20的整数。式III的化合物包括其盐和异构体。

在其它实施方案中，本发明提供了式IVa的化合物：

其中式IVa的R¹为糖，其中所述糖不包含葡萄糖部分。式Iva的基团R²为OH、C_1-6烷氧基、-OC(O)-C_1-6烷基、-OC(O)O-C_1-6烷基、被1-3个R^2a基团取代的C_0-6烷基-芳基；或者与每个R²所连接的碳上的氢合并成(＝O)。式IVa的每个R^2a独立地为H、C_1-6烷基、卤素、OH、硝基或-NH₂。式IVa的基团R³为H、C_1-6烷基、C_2-10烯基、芳基、杂芳基、或C_2-6烯基-芳基，其中所述芳基或杂芳基基团任选地被1-4个R^3a取代。式IVa的每个R^3a独立地为C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或OH。式IVa的每个R⁴为H、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基胺、C_0-6烷基-OH、C_1-6烷基-CO₂H、或C_1-6烷基-C(O)NH₂。式IVa的化合物包括其盐和异构体。

在一些实施方案中，本文所述的本发明的化合物(例如，式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie、II、IIa、III、IV、IVa、IVb、IVc、V、VI或VII的化合物)是分离的化合物。

在其它实施方案中，本发明还提供了含有本发明的化合物和药学上可接受的赋形剂的组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了制备乳突果精制级分方法，包括将乳突果药草与甲醇或乙醇接触以形成醇提取物；将醇提取物与有机溶剂接触以形成有机溶剂级分；以及将有机溶剂级分与石油醚接触以形成乳突果精制级分。有机溶剂可以是如上所述的任何合适的有机溶剂。在其它实施方案中，本发明提供了通过这种方法制备的乳突果精制级分。

在一些实施方案中，上述制备的乳突果精制级分通过以下进一步分级：用约30％的乙醇水溶液从树脂柱洗脱乳突果精制级分的第一级分；用约60％的乙醇水溶液从所述树脂柱洗脱第二级分；并且用约96％的乙醇水溶液从所述树脂柱洗脱第三级分。在其它实施方案中，本发明提供了通过上述方法制备的乳突果精制级分。

在另一实施方案中，本发明提供了改善个体记忆的方法，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的本发明的化合物或组合物或乳突果精制级分。

在另一实施方案中，本发明提供了治疗个体的神经退行性疾病或神经病理学疾病状态的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的本发明的化合物或组合物或乳突果精制级分。

在另一些实施方案中，本发明提供了抑制NMDA受体活性的方法，该方法包括将NMDA受体与本发明的化合物或组合物或乳突果精制级分接触。

在另一实施方案中，本发明提供了抑制β-淀粉样肽活性的方法，该方法包括将β-淀粉样肽与本发明的化合物或组合物或乳突果精制级分接触。

在又一实施方案中，本发明提供了治疗个体的癫痫的方法，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的乳突果精制级分。

附图简要说明

图1.乳突果精制级分不会引起神经元细胞死亡。用不同浓度的乳突果精制级分(“AG-0”)预先处理体外7天(DIV)的皮层神经元24小时，测定乳酸脱氢酶(LDH)水平。细胞存活的定量以与阳性对照(Triton X-100，100％细胞死亡时设定的值)相比的百分比表示。分析进行一式三份并重复至少两次。

图2.乳突果精制级分促进抗B27取出的大鼠皮层神经元的存活。从在补充2％B27的Neurobasal培养基中培养18天的胚胎大鼠中分离皮层神经元。用不同浓度的AG-0预先处理7DIV的神经元24小时，然后将培养基更换成缺乏B27的培养基。24小时之后进行MTT分析。细胞存活以与B27存在时DMSO对照(“含B27的CTL”)相比的百分比表示。分析进行一式三份并重复至少两次。*＝P＜0.05。

图3.乳突果精制级分保护大鼠皮层神经元抗NMDA兴奋性毒性。用不同浓度的AG-0(0.1-30μg/mL)预先处理胚胎大鼠皮层神经元(11DIV)，然后与NMDA(20μM)共孵育。20分钟之后，将培养基更换为新鲜培养基。过夜孵育之后，测定释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)。细胞死亡以与溶剂对照(“不含NMDA的CTL”)相比的百分比计算。分析进行一式二份并重复至少两次。*＝P＜0.05。

图4.乳突果精制级分保护大鼠皮层神经元抗β-淀粉样肽兴奋性毒性。用不同浓度的AG-0(0.1-50μg/mL)预先处理胚胎大鼠皮层神经元(7DIV)，然后用Aβ_25-35(10μM)共孵育。过夜孵育之后，进行MTT分析。细胞存活以与介质对照(vehicle control)(“无Aβ的CTL”)相比的百分比计算。分析进行一式二份并重复至少两次。*＝P＜0.05。

图5.乳突果精制级分抑制原代皮层神经元中由Aβ诱导的半胱天冬酶-3的产生。Aβ_25-35(10μM)存在时，用不同浓度的AG-0(10-50μg/mL)处理原代皮层神经元培养物(7DIV)。过夜孵育之后，提取蛋白并进行Western印迹分析。印迹用抗半胱天冬酶-3和ERK蛋白的抗体探测。星孢菌素(STS，10μM)用作阳性对照，而DMSO作为介质对照。

图6.乳突果精制级分抑制原代皮层神经元中由Aβ诱导的半胱天冬酶-3的酶活性。Aβ_25-35(“Aβ”，10μM)存在时，用不同浓度的AG-0(0.1-50μg/mL)处理原代皮层神经元培养物(7DIV)。随后进行半胱天冬酶-3活性分析。测定的荧光单位用蛋白浓度计算并与DMSO+Aβ对照比较，然后以倍数变化表示。星孢菌素(STS，10μM)用作诱导凋亡的阳性对照。

图7.乳突果精制级分诱导胚胎大鼠皮层神经元和PC12细胞中MEK/ERK/CREB通路的磷酸化。皮层神经元(7DIV)或PC12细胞用不同浓度的AG孵育15分钟(顶部图)，或者用AG-0(30μg/mL)以不同时间间隔处理(底部图)。收集总蛋白，通过Western印迹分析来分析信号转导蛋白的表达。神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)分别用作PC12和皮层神经元的对照。

图8.乳突果精制级分增加原代皮层神经元中的BDNF表达。用AG-0以不同时间间隔孵育皮层神经元(7DIV)。提取总RNA，之后合成cDNA。使基因表达相对于看家基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)标准化，并且将由AG-0诱导的基因表达的相对变化与介质对照进行比较。分析进行一式二份并重复至少两次。*＝P＜0.05。

图9.活性指导的乳突果精制级分的分级以及PC12细胞中的ERK磷酸化。AG-0通过30％乙醇(AG-1)，60％乙醇(AG-2)和96％乙醇(AG-3)被进一步分级成三种级分。当在10μg/ml相比时，AG-3诱导PC12细胞中强的ERK磷酸化，而AG-1诱导的信号较弱。神经生长因子(NGF，10ng/ml)用作对照。

图10.缺乏B27时用乳突果精制级分或AG-3级分预先处理的皮层神经元的免疫荧光染色。AG-0通过30％乙醇(AG-1)，60％乙醇(AG-2)和96％乙醇(AG-3)被进一步分级成三种级分。7DIV的皮层神经元培养物用AG-0(30μg/mL)、AG-3(30μg/mL)或BDNF(50ng/mL)预先处理24小时，然后将培养基更换成不含B27的培养基。培养物用4％多聚甲醛固定，用III型β-微管蛋白抗体免疫染色并用FITC-偶联的抗小鼠抗体显现。通过DAPI染色突显细胞体。DMSO用作溶剂对照。图像以40倍放大率显示。

图11.乳突果精制级分和级分AG-1和AG-3通过Src激酶诱导PC12细胞中的ERK磷酸化。PC12细胞用不同的抑制剂预先处理1小时，然后将AG-0、AG-1或AG-3(30μg/mL)添加到培养物中15分钟。收集总细胞裂解物并进行Western印迹分析。UO126(1μM)、PD (PD98095，25μM)和PP2(20μM)显著减弱由AG-0诱导的ERK磷酸化。对于AG-3，发现具有相似的抑制模式，KN62(10μM)、H89(10μM)、K252a(100nM)、KT58(KT5823，1μM)及KT57(KT5720，1μM)同样降低由AG-1诱导的ERK磷酸化。由这些级分诱导的ERK磷酸化不受PP3(20μM)、Wort(渥曼青霉素，100nM)、API-2(10μM)和CHEL(白屈菜红碱，10μM)影响。神经生长因子(NGF，20ng/mL)用作阳性对照。

图12.乳突果精制级分显著减少年老小鼠在Morris水迷宫模型中的逃避潜伏期。口服给予30mg/kg的AG-0。测量结果以每只小鼠(每组n＝14-16)的平均潜伏期来计算。数据表示为平均值+SEM，且与年老小鼠/水组相比。

图13.乳突果精制级分减少小鼠在强迫游泳实验中的不动持续时间。口服给予10、30或100mg/kg的AG-0持续7天。测量结果以每只小鼠(每组n＝5-25)的平均不动持续时间来计算。数据表示为平均值+SEM，且与年老小鼠/水组相比。已确凿证明的能减少不动持续时间的抗抑郁剂丙咪嗪(Imi，腹腔内给予15mg/kg)用作对照。*＝P＜0.005；**＝P＜0.0005。

图14.乳突果精制级分在旷场实验中对小鼠的自主活动没有任何影响。口服给予100mg/kg的AG-0，并且腹腔内给予15mg/kg的丙咪嗪。测量结果以场地中走动的平均总距离(左图)或每次时间间隔之间的移动距离(右图)来计算(每组n＝14-16)。数据表示为平均值+SEM，且与介质对照组(“CTL”)相比。

图15.从乳突果精制级分分离的7种化合物促进大鼠皮层神经元抗B27取出的存活。用从AG-0分离的不同化合物(30μM)预先处理7DIV的皮层神经元培养物24小时，然后将培养基更换为不含B27的培养基。24小时之后进行MTT分析。细胞存活以与B27阳性对照相比的百分比表示。分析进行一式二份并重复至少三次。*＝P＜0.05；**＝P＜0.01。

图16.来自乳突果精制级分的保护B27取出的原代神经元的7种化合物诱导ERK磷酸化。用从AG-0分离的不同浓度的化合物(0.1-10μM)处理7DIV的皮层神经元培养物15分钟。收集蛋白裂解物，用抗磷酸化-ERK的抗体进行Western印迹分析。通过总ERK表达指示蛋白上样。BDNF(50ng/mL)用作阳性对照。“D”表示用DMSO处理15分钟的裂解物。

图17.从乳突果精制级分分离的19种化合物促进大鼠皮层神经元抗NMDA兴奋性毒性的存活。用从AG-0分离的不同浓度的化合物(30-50μM)预先处理11DIV的皮层神经元培养物2小时，之后用NMDA处理20分钟。然后将培养基更换成新鲜培养基，24小时之后进行LDH分析。细胞死亡以与介质对照(DMSO，设置为100％的细胞死亡)相比的百分比表示。分析进行一式二份。*＝P＜0.05。

图18.从乳突果精制级分分离的促进皮层神经元抗NMDA诱导的细胞死亡的存活的化合物诱导ERK磷酸化。用从AG-0分离的不同浓度的化合物(0.1-10μM)处理7DIV的皮层神经元培养物15分钟。收集蛋白裂解物，用抗磷酸化-ERK的抗体进行Western印迹分析。通过总ERK表达指示蛋白上样。BDNF(50ng/mL)用作阳性对照。“D”表示用DMSO处理15分钟的裂解物。

图19.从乳突果精制级分分离的7种化合物保护大鼠皮层神经元抗β-淀粉样肽诱导的细胞死亡。用从AG-0分离的不同浓度的化合物(50μM，除GAG-C69为30μM外)处理7DIV的皮层神经元培养物2小时，然后将培养基更换成含有Aβ_25-35(“Aβ”，10μM)的培养基。24小时之后进行MTT分析。细胞存活以与阳性对照(无Aβ)相比的百分比表示。分析进行一式二份并重复至少二次。*＝P＜0.05；**＝P＜0.005。

图20.从乳突果精制级分分离的促进皮层神经元抗β-淀粉样肽损伤的存活的化合物诱导ERK磷酸化。用从AG-0分离的不同浓度的化合物(0.1-10μM)处理7DIV的皮层神经元培养物15分钟。收集蛋白裂解物，用抗磷酸化-ERK的抗体进行Western印迹分析。通过总ERK表达指示蛋白上样。BDNF(50ng/mL)用作阳性对照。“D”表示用DMSO处理15分钟的裂解物。

图21.缺乏B27时GAG-C27处理的皮层神经元的免疫荧光染色。用AG-0(30μg/mL)、GAG-C27(30μM)或BDNF(50ng/mL)处理7DIV的皮层神经元培养物24小时，之后将培养基更换成缺乏B27的培养基。培养物用4％多聚甲醛固定，用III型β-微管蛋白抗体免疫染色并用FITC-偶联的抗小鼠抗体显现。通过DAPI染色突显细胞体。DMSO用作溶剂对照。图像以40倍放大率显示。

图22.GAG-C27促进大鼠皮层神经元抗B27取出的存活。在补充2％B27的Neurobasal培养基中培养从18天的胚胎大鼠中分离的皮层神经元。用不同浓度的GAG-C27(1-30μM)预先处理7DIV的神经元培养物24小时，然后将培养基更换成缺乏B27的培养基。24小时之后进行MTT分析。细胞存活以与B27存在时的DMSO对照(“含B27的CTL”)相比的百分比表示。分析进行一式三份并重复至少三次。

图23.GAG-C27诱导胚胎大鼠皮层神经元中的ERK磷酸化。皮层神经元(7DIV)用GAG-C27(10μM)孵育不同的时间间隔。收集总蛋白，通过Western印迹分析来分析信号转导蛋白的表达。

图24.GAG-C77促进大鼠皮层神经元抗B27取出的存活。在补充2％B27的Neurobasal培养基中培养从18天的胚胎大鼠中分离的皮层神经元。7DIV的神经元培养物用不同浓度的GAG-C77(1-30μM)预先处理24小时，然后将培养基更换成缺乏B27的培养基。24小时之后进行MTT分析。细胞存活以与B27存在时的DMSO对照(“含B27的CTL”)相比的百分比表示。分析进行一式三份并重复至少三次。*＝P＜0.05。

图25.GAG-C77诱导胚胎大鼠皮层神经元中的ERK和CREB的磷酸化。皮层神经元(7DIV)用GAG-C77(30μM)孵育不同的时间间隔。收集总蛋白，通过Western印迹分析来分析信号转导蛋白的表达。脑源性神经营养因子(BDNF，50ng/mL，处理15分钟)用作对照。

图26.GAG-C77增强原代皮层神经元中的CREB-启动子的活性。荧光素酶-CREB启动子构建体转染的原代皮层神经元培养物(7DIV)用GAG-C69或GAG-C77(浓度以[μM]表示)处理。孵育6小时之后收集细胞裂解物，测定荧光素酶活性。BDNF[ng/mL]和咯利普兰[μM]用作阳性对照。分析进行一式三份。*＝P＜0.05；**＝P＜0.005。

图27.GAG-C78促进大鼠皮层神经元抗B27取出的存活。在补充2％B27的Neurobasal培养基中培养从18天的胚胎大鼠中分离的皮层神经元。7DIV的神经元培养物用不同浓度的GAG-C78(1-30μM)预先处理24小时，然后将培养基更换成缺乏B27的培养基。24小时之后进行MTT分析。细胞存活以与B27存在时的DMSO对照(“含B27的CTL”)相比的百分比表示。分析进行一式二份并重复至少三次。*＝P＜0.05。

图28.GAG-C78诱导胚胎大鼠皮层神经元中的ERK和CREB的磷酸化。皮层神经元(7DIV)用GAG-C78(30μM)孵育不同的时间间隔。收集总蛋白，通过Western印迹分析来分析信号转导蛋白的表达。脑源性神经营养因子(BDNF，50ng/mL，处理15分钟)用作对照。

图29.GAG-C80促进大鼠皮层神经元抗B27取出的存活。在补充2％B27的Neurobasal培养基中培养从18天的胚胎大鼠中分离的皮层神经元。7DIV的神经元培养物用不同浓度的GAG-C80(1-30μM)预先处理24小时，然后将培养基更换成缺乏B27的培养基。24小时之后进行MTT分析。细胞存活以与B27存在时的DMSO对照(“含B27的CTL”)相比的百分比表示。分析进行一式二份并重复至少三次。*＝P＜0.01。

图30.GAG-C81促进大鼠皮层神经元抗B27取出的存活。在补充2％B27的Neurobasal培养基中培养从18天的胚胎大鼠中分离的皮层神经元。7DIV的神经元培养物用不同浓度的GAG-C81(1-50μM)预先处理24小时，然后将培养基更换成缺乏B27的培养基。24小时之后进行MTT分析。细胞存活以与B27存在时的DMSO对照(“含B27的CTL”)相比的百分比表示。分析进行一式二份并重复至少三次。*＝P＜0.05。

图31.GAG-C73抑制海马神经元中NMDA诱导的电流。利用全细胞膜片钳研究检测GAG-C73对大鼠海马神经元(11DIV)中NMDA活化电流的影响。添加的NMDA在锥体细胞中诱导去极化并启动内向电流。显示了施加GAG-C73(30μM)之前，期间和之后NMDA活化电流的例子。横线表示施加了GAG-C73。B-C，用GAG-C73(30μM)与NMDA共同处理减弱由NMDA诱导的电流，对于峰电流和平台电流都是如此(B)。GAG-C73剂量渐增进一步减弱NMDA诱导的电流(C)。DMSO用作溶剂对照。甘氨酸的浓度为0.1μM，膜电位保持在-70mV。n＝10；进行3次独立的实验。*＝P＜0.05。

图32.GAG-C73以剂量依赖方式减少由NMDA损伤诱导的皮层神经元细胞死亡。皮层神经元用不同浓度的GAG-C73或DMSO对照(“无NMDA的CTL”)预先孵育2小时，之后与NMDA(20μM)共同处理20分钟。过夜孵育之后，测定释放到培养基中的LDH。分析进行一式二份并重复至少三次。*＝P＜0.05；**＝P＜0.005。

图33.GAG-C73减少由高剂量NMDA诱导的原代神经元细胞死亡。皮层神经元用GAG-C73(30μM)或DMSO对照孵育2小时，之后与不同浓度的NMDA(5-100μM)共同处理20分钟。然后测定释放到培养基中的LDH。分析进行一式二份并重复至少三次。*＝P＜0.05；**＝P＜0.005。

图34.GAG-C73减少由高剂量谷氨酸盐诱导的原代神经元细胞死亡。皮层神经元用GAG-C73(30μM)或DMSO对照孵育2小时，之后与不同浓度的谷氨酸盐(10-200μM)共同处理20分钟。然后测定释放到培养基中的LDH。分析进行一式二份并重复至少三次。*＝P＜0.05；**＝P＜0.005。

图35.GAG-C69保护皮层神经元免于β-淀粉样肽诱导的毒性。胚胎大鼠神经元培养物(7DIV)用不同浓度的GAG-C69预先处理，然后与Aβ25-35(10μM)共同孵育。过夜孵育之后进行MTT分析。细胞存活以与DMSO溶剂对照(“无Aβ的CTL”)相比的百分比表示。分析进行一式三份并重复至少三次。*＝P＜0.05。

图36.GAG-C69抑制原代皮层神经元中由Aβ诱导的半胱天冬酶-3活化。Aβ_25-35(10μM)存在时，原代皮层神经元培养物(7DIV)用不同浓度的GAG-C69(10-50μg/mL)处理。过夜孵育之后提取蛋白，进行Western印迹分析。印迹用抗半胱天冬酶-3和ERK蛋白的抗体探测。星孢菌素(STS，10μM)用作阳性对照，而DMSO用作介质对照。

图37.GAG-C14诱导胚胎大鼠皮层神经元中的ERK的磷酸化。皮层神经元(7DIV)用GAG-C14(10μM)孵育不同的时间间隔。收集总蛋白，通过Western印迹分析来分析信号转导蛋白的表达。脑源性神经营养因子(BDNF，50ng/mL，处理15分钟)用作对照。

图38.GAG-C14调节棘形态发生。海马神经元在7DIV时用增强的绿色荧光蛋白(EGFP)构建体通过磷酸钙沉淀转染。然后，在14DIV时表达GFP的神经元用10μM GAG-C14或DMSO介质对照处理24小时。通过共聚焦显微镜检测海马神经元的树突棘形态发生。与DMSO对照相比，GAG-C14显著增加棘密度(底部中间图)和大棘的百分比(头部＞1μm)(底部左图)，而显著减少树突丝的百分比(底部右图)。n＝20；*＝P＜0.05。

图39.从乳突果精制级分分离的新化合物诱导胚胎大鼠皮层神经元中ERK的磷酸化。皮层神经元(7DIV)用从AG-0分离的不同的化合物孵育15分钟。收集总蛋白，通过Western印迹分析来分析磷酸化-ERK的表达。通过总ERK表达指示蛋白上样。BDNF(50ng/mL)用作阳性对照。“D”表示用DMSO处理15分钟的裂解物。

图40.AG-3表征为含有GAG-C77、GAG-C13、GAG-C14和GAG-C69。AG-3通过柱层析在硅胶上用90/10至50/50的石油醚/乙酸乙酯混合物，之后用100/1至70/30的氯仿/甲醇混合物进行梯度洗脱来分级。根据TLC分析共获得26种级分。这些级分通过HPLC进一步分析(上部图)。用80/20的石油醚/乙酸乙酯洗脱得到级分AG-3-9。此外，HPLC色谱的保留时间和单峰的UV光谱表明，级分AG-3-9含有化合物GAG-C13、GAG-C77及GAG-C69，GAG-C13的为其主要组分(底部右图)。

图41.GAG化合物增强CRE依赖的转录活性。GAG-C14(a)、GAG-C53(b)、GAG-C63(c)、GAG-C69(d)、GAG-C84(e)、GAG-C111(f)、GAG-C122(g)、GAG-C123(h)及GAG-C129(i)诱导所培养海马神经元中的CRE依赖的转录活性。在接种细胞的当天，海马神经元用含有环AMP反应(CRE)-元件的萤火虫荧光素酶报告质粒转染。然后，12DIV时的细胞用50μM的AG化合物处理6小时。数据为平均值±SEM(n＝3-4)，相比介质处理的细胞(0μM)，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01及***＝P＜0.005，学生t检验。

发明详述

I.总述

本发明提供来自乳突果(Adelostemma gracillimum)精制级分的分离的化合物。在筛选乳突果精制级分(“AG-0”)的神经保护活性的过程中，发现AG-0的弱极性子级分AG-3表现出神经保护活性。对级分AG-0及其化合物的研究也表明它们在促进神经细胞抗凋亡的存活，和在活化对于神经元存活和分化至关重要的细胞内信号转导级联的效能。AG-0及其化合物也能够通过抑制N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的活性而防止谷氨酸诱导的神经毒性，并通过抑制半胱天冬酶-3的活性而防止β-淀粉样肽的神经毒性。AG-0及其化合物也可用于治疗多种疾病状态，可以用于改善记忆，并且可用于治疗或预防癫痫。

II.定义

如本文所用，术语“烷基”是指直链或支链的，饱和的脂肪族基团，其具有所指的碳原子数。例如，C₁-C₆烷基包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。其它烷基基团包括，但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可以包括任何数目的碳原子，例如1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、2-3、2-4、2-5、2-6、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6。烷基基团通常是一价的，但也可以是二价的，例如当烷基基团将两个部分连接在一起时。

如本文所用，术语“亚烷基”是指如上所定义的烷基，其连接至少两个其它基团，即为二价烃基。连接到亚烷基的两个部分可以被连接到亚烷基的同一原子或不同原子。例如，直链亚烷基可以是二价基团-(CH₂)_n，其中n是1，2，3，4，5或6。亚烷基基团包括，但不限于，亚甲基、亚乙基、亚丙基、异亚丙基、亚丁基、异亚丁基、仲亚丁基、亚戊基和亚己基。

烷基和杂烷基基团(包括通常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、杂环烯基的那些基团)的取代基可以是一种或多种选自以下的基团，但不限于：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”‘、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”‘、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR”“、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂，数目为零至(2m′+1)，其中m′是该基团的碳原子总数。优选地，R’、R”、R”‘和R”“各自独立地指氢、烷基、杂烷基、芳基或芳烷基基团。当本发明的化合物包括一个以上的R基团时，例如当存在一个以上的这些基团时，R基团中的每一个独立地选自每个R’、R”、R”’和R”“基团。当R’和R”都连接到同一个氮原子时，它们可以与氮原子合并成5-、6、或7-元环。例如，-NR’R”是指包括但不限于，1-吡咯烷基和4-吗啉基。

如本文所用，术语“烷氧基”是指具有氧原子的烷基，所述氧原子将烷基基团与连接点连接。烷氧基包括，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基、异-丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基基团可以被本文所述的多种取代基进一步取代。例如，烷氧基基团可以被卤素取代，以形成“卤代烷氧基”基团。

如本文所用，术语“烯基”是指具有至少一个双键的2至6个碳原子的直链或支链烃。烯基的实例包括，但不限于，乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、异戊烯基、1，3-戊二烯基、1，4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1，3-己二烯基、1，4-己二烯基、1，5-己二烯基、，2，4-己二烯基或1，3，5-己三烯基。烯基基团也可以具有2至3、2至4、2至5、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6、和5至6个碳原子。烯基基团通常是一价的，但也可以是二价的，例如当烯基基团将两个部分连接在一起时。

如本文所用，术语“亚烯基”是指如上所定义的烯基，其连接至少两个其它基团，即为二价烃基。连接到亚烯基的两个基团可以被连接到亚烯基的同一原子或不同原子。亚烯基基团包括，但不限于，亚乙烯基、亚丙烯基、异亚丙烯基、亚丁烯基、异亚丁烯基、仲-亚丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。

如本文所用，术语“炔基”是指具有至少一个三键的2至6个碳原子的直链或支链烃。炔基的实例包括，但不限于，乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、异丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、异戊炔基、1，3-戊二炔基、1，4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1，3-己二炔基、1，4-己二炔基、1，5-己二炔基、2，4-己二炔基或1，3，5-己三炔基。炔基也可以具有2至3、2至4、2至5、3至4、3至5、3至6、4至5、4至6、和5至6个碳原子。炔基基团通常是一价的，但也可以是二价的，例如当炔基基团将两个部分连接在一起时。

如本文所用，术语“亚炔基”是指如上所定义的炔基，其连接至少两个其它基团，即，二价烃基。连接到亚炔基的两个部分可以被连接到亚炔基的同一原子或不同原子。亚炔基包括，但不限于，亚乙炔基、亚丙炔基、异亚丙炔基、亚丁炔基、仲-丁炔基、亚戊炔基和亚己炔基。

如本文所用，术语“烷基胺”是指具有一个或多个氨基基团的本文所定义的烷基基团。氨基集团可以是伯胺、仲胺或叔胺。烷基胺可以进一步被羟基基团取代。在本发明中有用的烷基胺包括，但不限于，乙基胺、丙基胺、异丙基胺、乙二胺和乙醇胺。氨基基团可以将烷基胺与化合物的其余部分的连接点连接、位于烷基基团的Ω位、或者将烷基基团的至少两个碳原子连接在一起。本领域技术人员将会理解，其它烷基胺在本发明中是有用的。

如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用，术语“卤代烷基”是指部分或全部的氢原子被卤素原子取代的如上文所定义的烷基。卤素(卤代)优选代表氯代或氟代，但也可以是溴代或碘代。例如，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1，2，3，4，5-五氟-苯基等。术语“全氟”定义的化合物或基团具有至少两个可用氟取代的氢原子。例如，全氟苯基是指1，2，3，4，5-五氟苯基、全氟甲基是指1，1，1-三氟甲基，并且全氟甲氧基指1，1，1-三氟甲氧基。

如本文所用，术语“卤代烷氧基”是指具有至少一个卤素的烷氧基基团。卤代烷氧基被定义为其中部分或全部氢原子被卤素原子取代的烷氧基。可以用1、2、3或更多个卤素取代烷氧基基团。当所有的氢被卤素，例如由氟所取代时，该化合物为全取代的，例如，全氟的。卤代烷氧基包括，但并不限于，三氟甲氧基、2，2，2，-三氟乙氧基、全氟乙氧基等。

如本文所用，术语“环烷基”是指饱和或部分不饱和的，单环、稠合的二环或桥连多环组件，其含有3至12个环原子，或指示的原子数。单环包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。双环和多环包括，例如，降莰烷，、十氢萘和金刚烷。例如，C_3-8环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、降莰烷。

如本文所用，术语“亚环烷基”是指如上所定义的环烷基，其连接至少两个其它基团，即为二价烃基。连接到亚环烷基的两个部分可以被连接到亚环烷基的同一原子或不同原子。亚环烷基基团包括，但不限于，亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基和亚环辛基。

如本文所用，术语“杂环烷基”是指具有3元至约20元和1至约5个诸如N，O和S的杂原子的环系统。其它杂原子也可以是有用的，包括，但不限于，B、Al、Si和P。杂原子也可以是被氧化的，例如，但并不限于，-S(O)-和-S(O)₂-。例如，杂环包括但不限于，四氢呋喃基、四氢噻吩、吗啉代、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、二氢吲哚基、奎宁环基和1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基。

如本文所用，术语“杂亚环烷基”是指如上所定义的杂环烷基基团，其连接至少两个其它基团。连接到杂亚环烷基的两个部分可以被连接到杂亚环烷基的同一原子或不同原子。

如本文所用，术语“芳基”是指单环或稠合双环、三环或更大的，含有6至16个环碳原子的芳族环组件。例如，芳基可以是苯基、苄基或萘基，优选苯基。“亚芳基”是指从芳基衍生的二价基团。芳基基团可以是由选自以下的一个、两个或三个基团单取代、二取代或三取代的：烷基、烷氧基、芳基、羟基、卤素、氰基、氨基、氨基烷基、三氟甲基、亚烷基二氧基(alkylenedioxy)和氧基-C₂-C₃-亚烷基，所有这些可任选地进一步被例如上文所定义的所取代；或者是1-或2-萘基、或1-或2-菲基。亚烷基二氧基是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如亚甲二氧基或亚乙二氧基。氧基-C₂-C₃-亚烷基也是连接到苯基的两个相邻碳原子的二价取代基，例如氧乙烯或氧丙烯。氧基-C₂-C₃-亚烷基-苯基的一个例子是：2，3-二氢苯并呋喃-5-基。

优选地，芳基是萘基、苯基或被烷氧基、苯基、卤素、烷基或三氟甲基单或双取代的苯基，特别是苯基或被烷氧基、卤素或三氟甲基单-或双取代的苯基，特别是苯基。

作为R的取代的苯基基团的实例是，例如，4-氯苯-1-基、3，4-双氯酚-1-基、4-甲氧苯-1-基、4-甲基苯-1-基、4-氨甲基苯-1-基、4-甲氧基乙基氨甲基苯-1-基、4-羟乙基氨甲基苯-1-基、4-羟乙基(甲基)-氨甲基苯-1-基、3-氨甲基苯-1-基、4-N-乙酰基氨甲基苯-1-基、4-氨基苯-1-基、3-氨基苯-1-基、2-氨基苯-1-基、4-苯基-苯-1-基、4-(咪唑-1-基)-苯-基、4-(咪唑-1-基甲基)-苯基-1-基、4-(吗啉-1-基)-苯-1-基、4-(吗啉-1-基甲基)-苯-1-基、4-(2-甲氧基乙基氨甲基)-苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)-苯-1-基、4-(苯硫基)-苯-1-基、4-(3-噻吩基)-苯-1-基、4-(4-甲基哌嗪-1-基)-苯-1-基、以及4-(哌啶基)-苯基和4-(吡啶基)-苯基，在杂环中任选地被取代。

如本文所用，术语“亚芳基”是指如上所定义的芳基基团，其连接至少两个其它基团。连接到亚芳基的两个部分被连接到亚芳基的不同原子。亚芳基基团包括，但不限于，亚苯基。

如本文所用，术语“亚芳基-氧基”是指如上所定义的亚芳基，其中连接到亚芳基的一个部分是通过氧原子连接的。亚芳基-氧基的基团包括，但不限于，亚苯基-氧基。

同样地，芳基和杂芳基基团的取代基不同，并选自：卤原子、-OR’、-OC(O)R’、-NR’R”、-SR’、-R’、-CN、-NO₂、-CO₂R’、-CONR’R”、-C(O)R’、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR”C(O)₂R’、-NR’-C(O)NR”R”‘、-NH-C(NH₂)＝NH，-NR’C(NH₂)＝NH、-NH-C(NH₂)＝NR’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-N₃、-CH(Ph)₂、全氟(C₁-C₄)烷氧基和全氟(C₁-C₄)烷基，数目为从0至芳香环系统上开放的化合价总数，并且其中R’，R”和R”‘独立地选自氢、(C₁-C₈)烷基和杂烷基、未取代的芳基和杂芳基、(未取代的芳基)-(C₁-C₄)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C₁-C₄)烷基。

如本文所用，术语“烷基-芳基”是指具有烷基组分和芳基组分的基团，其中烷基组分连接芳基组分与连接点。烷基组分如上文所定义的，除了烷基组分至少是二价的，以便连接芳基组分和连接点。在某些情况下，烷基组分可以是不存在。芳基组分是如上面所定义的。烷基-芳基的实例包括，但不限于，苄基。

如本文所用，术语“烯基-芳基”是指同时具有烯基组分和芳基组分的基团，其中烯基组分连接芳基组分与连接点。烯基组分如上文所定义的，除了烯基成分至少是二价的，以便连接芳基组分和连接点。芳基组分是如上面所定义的。烯基-芳基的实例，包括乙烯基-苯基等。

如本文所用，术语“杂芳基”是指含有5至16个环原子的单环、或稠合的双环、或三环的芳族环组件，其中1至4个环原子是各自为N、O或S的杂原子。例如，杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、恶唑基、异恶唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、或任何其它被取代的基团，特别是被诸如烷基、硝基或卤素单取代或二取代的。吡啶基表示2-、3-或4-吡啶基，优选为2-或3-吡啶基。噻吩基表示2-或3-噻吩基。喹啉基优选表示2-、3-或4-喹啉基。异喹啉基优选表示1-、3-或4-异喹啉基。苯并吡喃基，硫代苯并吡喃基分别优选表示3-苯并吡喃基，或3-硫代苯并吡喃基。噻唑基优选表示2-或4-噻唑基，并且最优选为4-噻唑基。三唑基优选是1-、2-或5-(1，2，4-三唑基)。四唑基优选是5-四唑基。

优选地，杂芳基是吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、异恶唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、异喹啉基、苯并噻吩基、恶唑基、吲唑基、或任何被取代的所述基团，特别是单取代或二取代的。

如本文所用，术语“糖”是指单糖、二糖和低聚糖。本发明中有用的单糖包括，但不限于，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖和核糖。在本发明种有用的二糖包括，但不限于，蔗糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖。低聚糖中含有3-10个单糖，并包括，但不限于，低聚果糖、低聚半乳糖和低聚甘露糖。在本发明中有用的其它糖类包括，但不限于，Cym-Ole-Ole、Cym-Ole-Cym和Cym-Dig。

如本文所用，术语“葡萄糖部分”是指作为较大分子的组分的葡萄糖分子。

如本文所用，术语“盐”是指在本发明的方法中使用的化合物的酸盐或碱盐。药学上可接受的盐的示例性例子是无机酸(盐酸、氢溴酸、磷酸等)的盐，有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)的盐，季铵(甲基碘、乙基碘等)的盐。应该理解药学上可接受的盐是无毒的。合适的药学上可接受的盐的其它信息见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，通过引用将其并入本文。

如本文所用，术语“个体”是指动物，如哺乳动物，包括但不限于，灵长类动物(例如，人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在某些实施方案中，个体是人。

如本文所用，术语“治疗有效量或剂量”或“足够的治疗量或剂量”或“有效或足够的量或剂量”指的是对其所给药的对象产生治疗效果的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并由本领域技术人员利用已知技术确定(参见，例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(药物剂型)(vols.1-3，1992)；Lloyd，The Art，Science和Technology ofPharmaceutical Compounding(药物组合的技艺、科学与技术)(1999)；Pickar，Dosage Calculations(剂量计算)(1999)；和Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(雷明顿制药科学)，20th Edition，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams & Wilkins)。在致敏细胞中，治疗有效剂量通常可以低于非致敏细胞的常规的治疗有效剂量。

如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指有助于将活性药剂给予个体并为个体所吸收的物质。在本发明中有用的药用赋形剂包括，但不限于，粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、涂料、甜味剂、调味剂和颜料。本领域技术人员将会认识到，其它药用赋形剂在本发明中是有用的。

如本文所用，术语“给药”或“给予”指口服给药、栓剂给药、局部接触、肠胃外给药、静脉内给药、腹膜内给药、肌内给药、病灶内给药、鼻内给药或皮下给药、鞘内给药、或向个体植入缓释植入体，例如，微型渗透泵。

如本文所用，术语“改善学习和/或记忆”是指改善或增强指示学习和记忆的至少-个参数。改善或增强是参数变化至少10％，任选至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％等。学习和记忆的改善可以由本领域中已知的任何方法进行测量。例如，本文所述的改善学习和记忆的化合物可以采用Morris水迷宫筛选(参见，例如，材料和方法章节)。还参见Gozes et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：427-432(1996)。记忆和学习也可以使用本文所述的任何方法或本领域技术人员所公知的其它方法筛选，例如，雷德记忆测试(Randt MemoryTest)、韦氏记忆量表(Wechler Memory Scale)、正向数字跨度测试(Forward Digit Span test)、或加州言语学习测试(California VerbalLearning Test)。

如本文所用，术语“记忆”包括记忆的所有医疗分类，例如，感官记忆，即时记忆，近期记忆和远期记忆，以及在心理学中使用的术语，如参考记忆，它指的是从先前的经验获得的信息，近期或远期的(参见，例如，Harrison’s Principles of Internal Medicine(哈里逊内科学)，volume 1，pp.142-150(Fauci et al.，eds.，1988))。将受益于本发明的治疗和诊断应用的病理学或神经病理学，包括，例如以下：

中枢运动系统疾病，包括影响基底神经节的退行性疾病状态(亨廷顿氏病、威尔逊氏病、纹状体黑质变性、皮层基底神经节变性)、抽动秽语综合征、帕金森氏病、进行性核上性麻痹、进行性延髓麻痹、家族性痉挛性截瘫、脊髓性肌萎缩、ALS及其变型、齿状红核萎缩、橄榄体脑桥小脑萎缩、肿瘤形成性小脑变性、和多巴胺毒性作用；

影响感觉神经元的疾病，如弗里德共济失调、糖尿病、周围神经病变、视网膜神经元变性；

边缘和皮层系统疾病，如大脑淀粉样变性病、皮克氏萎缩、Retts综合征；

涉及多种神经系统和/或脑干的神经退行性病理，包括阿尔茨海默病、艾滋病相关的痴呆症、利氏疾、弥漫性路易体病、癫痫、多系统萎缩、格林-巴利综合征、溶酶体储存紊乱如脂褐质沉淀症、唐氏综合征的晚期退行性阶段、阿尔珀斯疾、作为CNS退行结果的眩晕；

与发育迟缓和学习障碍相关的病理，以及唐氏综合征和氧化应激引起的神经元死亡；

由老龄化和慢性酗酒或药物滥用引起的病理，例如，由酗酒引起的蓝斑、小脑、胆碱能基底前脑中的神经元退化；由老龄化引起的小脑神经元和皮层神经元的退行导致的认知和运动障碍；由慢性安肺他明滥用引起的基底神经节神经元退化导致的运动障碍；

由诸如中风、局部缺血、血管供血不足、缺氧缺血性脑病、高血糖、低血糖、闭合性颅脑外伤、或直接外伤的局部创伤引起的病理改变；和

由治疗药物和治疗的副作用(例如，对NMDA类谷氨酸受体拮抗剂的抗惊厥剂量有反应的扣带回神经元和内嗅皮层神经元退化)引起的病理。

如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指、在损伤、病理、疾病状态或症状(例如，疼痛)的治疗或改善中成功的任何标记，包括任何客观或主观的参数，如减轻；缓解；减少症状，或使症状、伤害、病理或疾病状态对于患者是更可容忍的；降低症状或疾病状态的频率或持续时间，或在某些情况下，防止症状或疾病状态的发作。症状的治疗或改善可以基于任何客观或主观的参数，包括，例如体检结果。

如本文所用，术语“有机溶剂”指的是与水不混溶的溶剂。有机溶剂可以是任何合适的有机溶剂，如，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、戊烷、己烷和石油醚。本领域技术人员将会理解，其它有机溶剂在本发明中是有用的。

如本文所用，术语“树脂柱”是指用于柱层析的柱，包含能够结合目的靶标的固体材料。柱中使用的树脂可以是适合于特定类型的柱层析的任何材料或材料的组合，包括但不限于，氧化铝、二氧化硅、硅胶、十八烷基硅胶(ODS)、纤维素、葡聚糖、琼脂糖、肝素、蛋白质、或金属(例如，镍、钴、铜、锌、铁和镓)。本领域技术人员将认识到，用于特定应用的特定类型的树脂柱的适用性将取决于要进行的柱层析的类型(例如，亲和层析、离子交换层析、排阻层析、反相高效液相色谱等)和待结合的靶标。本领域技术人员将会认识到，其它类型的树脂柱在本发明中是有用的。

如本文所用，术语“癫痫”是指脑功能异常，其特征为周期性和不可预测地发生痉挛(参见，Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basisof Therapeutics(治疗的药理学基础)和Harrison’s Principles of InternalMedicine(哈里森内科学))。

如本文所用，术语“治疗癫痫”和“预防癫痫”是指治疗或预防癫痫痉挛的发生或减轻癫痫癫痫痉挛的严重程度。治疗或预防癫痫痉挛的发生对应于痉挛发生降低至少10％，任选地至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％等。减轻癫痫痉挛的严重程度使痉挛的强度降低至少10％，任选地至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％等。癫痫痉挛的发生或严重程度的降低，可以由本领域中已知的任何方法进行测量。例如，本文所述的改善学习和记忆的化合物，可以使用听源性痉挛易感性试验筛选(参见，例如，材料和方法章节)。

III.化合物

本发明提供从乳突果精制级分分离的化合物。在一些实施方案中，本发明提供了式I的化合物：

其中式I的基团X为键或-O-；式I的R¹为OH；并且式I的R²为H或OH。或者，式I的基团R¹和R²结合成-O-。式I的R³为H、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或C_1-6烷基-OH。式I的R⁴各自独立地为H、OH、C_1-6烷基、或C_1-6烷氧基。式I的R⁵各自独立地为H、OH、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、任选地被一个R⁶基团取代的C_2-6烯基、-C(O)R⁷、或C_1-6烷基-C(O)R⁷。式I的基团R⁶为C_1-6烷氧基或-C(O)R⁷。式I的R⁷各自为H或C_1-6烷基。式I的下标m为1-5的整数；并且式I的下标p为1-4的整数。式I的化合物包括其盐和异构体。

式I的化合物包括以下：

表1.式I的化合物

  化合物  R²  R^4a  R^4c  R^5d  GAG-C13  H  OH  H  OCH₃  GAG-C58  H  OCH₃  OH  OCH₃  GAG-C59  OH  OCH₃  OCH₃  OCH₃  GAG-C114  H  OCH₃  H  OH  GAG-C121  H  OCH₃  OCH₃  OCH₃

表2.式I的化合物

  化合物  R³ R^5b  R^5d  GAG-C69  CH₃ CH＝CHCH₃  H

表3.式I的化合物

表4.式I的化合物

  化合物  R^4c  GAG-C51  H  GAG-C109  OH  GAG-C116  OCH₃

在一些其它实施方案中，本发明提供了式Ia的化合物：

其中式Ia的基团X为键或-O-；式Ia的R¹为OH；并且式Ia的R²为H或OH。或者，式Ia的R¹和R²结合成-O-。式Ia的基团R³为C_1-6烷基或C_1-6烷基-OH。式Ia的R^4a、R^4b和R^4c各自独立地为H、OH、C_1-6烷基、或C_1-6烷氧基。R^5a、R^5b、R^5c和R^5d各自独立地为H、OH、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、任选地被C_1-6烷氧基取代的C_2-6烯基、和-C(O)-C_1-6烷基。式Ia的化合物包括那些化合物，使得：

当X为-O-且R¹为OH时，R³为C_1-6烷基；R^4a和R⁵各自独立地为OH或C_1-6烷氧基；R^4b为OH；R^4c为H、OH或C_1-6烷氧基；R^5a和R^5c各自为H；并且R^5b为C_2-6烯基；

当X为-O-，并且R¹和R²结合成-O-时，R³为C_1-6烷基；R^4a为C_1-6烷氧基；R^4b为OH；R^4c、R^5a、R^5c和R^5d各自为H；并且R^5b为C_2-6烯基；

当X为键，并且R¹为OH时，R²、R^4b、R^5b和R^5c各自为H；R³为OH；R^4a和R^5a各自为C_1-6烷基；并且R^4c和R^5d各自为C_1-6烷氧基；

当X为键并且R¹和R²结合成-O-时，R³为C_1-6烷基或C_1-6烷基-OH；R^4a和R^5a各自为C_1-6烷氧基；R^4b为OH；R^4c为H、OH或C_1-6烷氧基；R^5b为H；R^5c为H或被C_1-6烷氧基取代的C_2-6烯基；并且R^5d为H或C(O)-C_1-6烷基，其中当R³为C_1-6烷基时，R^5d为-C(O)-C_1-6烷基，并且当R³为C_1-6烷基-OH时，R^5d为H；以及

当X为-O-，R¹为OH，R²、R^5a和R^5c各自为H，R³为Me，R^4a和R^5d都是OMe，R^4b为OH，并且R^5b为C₃烯基时，R^4c为OH或C_1-6烷基。

式Ia的化合物包括其盐和异构体。

在其它实施方案中，本发明提供了式Ib的化合物：

其中R²为H；R³为C_1-6烷基；R^4a和R^5d各自独立地为OH或C_1-6烷氧基；R^4c为H、OH或C_1-6烷氧基；并且R^5b为C_2-6烯基。式Ib的化合物包括其盐和异构体。在一些其它实施方案中，式Ib的化合物包括化合物GAG-C13、GAG-C58和GAG-C59：

在其它实施方案中，本发明提供了式Ic的化合物：

其中R³为C_1-6烷基；R^4a为C_1-6烷氧基；并且R^5b为C_2-6烯基。式Ic的化合物包括其盐和异构体。在其它实施方案中，式Ic的化合物包括化合物GAG-C69：

在一些其它实施方案中，本发明提供了式Id的化合物：

其中R^4a和R^5a各自为C_1-6烷基；并且R^4c或R^5d各自为C_1-6烷氧基。式Id的化合物包括其盐和异构体。式Id的化合物包括GAG-C80：

在其它实施方案中，本发明提供了式Ie的化合物：

其中R³为C_1-6烷基或C_1-6烷基-OH；R^4a和R^5a各自为C_1-6烷氧基；R^4c为H、OH或C_1-6烷氧基；R^5c为H或被C_1-6烷氧基取代的C_2-6烯基；并且R^5d为H或C(O)-C_1-6烷基，其中当R³为C_1-6烷基时，R^5d为-C(O)-C_1-6烷基，并且当R³为C_1-6烷基-OH时，R^5d为H。式Ie的化合物包括其盐和异构体。

在其它实施方案中，式Ie的化合物包括化合物GAG-C51、GAG-C76、GAG-C109和GAG-C116：

在其它实施方案中，式Ia的化合物包括GAG-C13、GAG-C69和GAG-C80：

在另一实施方案中，本发明提供了式II的化合物：

其中式II的X为键或-C(CH₃)₂-。式II的基团R¹为H、C_1-6烷基或糖。式II的基团R²为H或C_1-6烷基。式II的基团R³为-OH或-NH₂。式II的基团R⁴为H、C_1-6烷基、或C_2-6烯基，使得当X为键时，R⁴为C_2-6烯基。式II的化合物包括其盐和异构体。式II的化合物包括GAG-C74：

在其它实施方案中，本发明提供了式IIa的化合物：

其中式IIa的R¹为H、C_1-6烷基或糖。式IIa的基团R²为H或C_1-6烷基。并且式IIa的基团R³为-OH或-NH₂。式IIa的化合物包括其盐和异构体。在一些其它实施方案中，式IIa的化合物包括化合物GAG-C73：

在其它实施方案中，本发明提供了式III的化合物：

其中式III的R¹、R²或R³各自独立地为H或C_1-6烷基。式III的下标n为8-20的整数。式III的化合物包括其盐和异构体。

在其它实施方案中，式III的R¹为H。在其它实施方案中，式III的R¹为H；式III的R²和R³各自为Me；并且式III的下标n为10。在其它实施方案中，式III的化合物为GAG-C78：

在另一实施方案中，本发明提供了式IV的化合物：

其中式IV的R¹为糖。式IV的基团R²为OH、C_1-6烷氧基、-OC(O)-C_1-6烷基、-OC(O)O-C_1-6烷基、被1-3个R^2a基团取代的C_0-6烷基-芳基；或与每个R²所连接的碳上的氢合并成(＝O)。式IV的R^2a各自独立地为H、C_1-6烷基、卤素、OH、硝基或-NH₂。式IV的基团R³为H、C_1-6烷基、C_2-10烯基、芳基、杂芳基、或C_2-6烯基-芳基，其中所述芳基或杂芳基基团任选地被1-4个R^3a基团取代。式IV的R^3a各自独立地为C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或OH。式IV的基团R⁴为H、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基胺、C_0-6烷基-OH、C_1-6烷基-CO₂H、或C_1-6烷基-C(O)NH₂。式IV的R^5a和R^6a各自为OH。式IV的R^5b和R^6b各自为H，或R^5a与R^5b以及R^6a与R^6b结合成(＝O)。或者，式IV的R^5b和R^6b结合成键。式IV的化合物包括其盐和异构体。

在其它实施方案中，本发明提供了式IVa的化合物：

其中式IVa的R¹为糖，其中所述糖不包含葡萄糖部分。式IVa的基团R²为OH、C_1-6烷氧基、-OC(O)-C_1-6烷基、-OC(O)O-C_1-6烷基、被1-3个R^2a基团取代的C_0-6烷基-芳基；或与每个R²所连接的碳上的氢合并成(＝O)。式IVa的R^2a各自独立地为H、C_1-6烷基、卤素、OH、硝基或-NH₂。式IVa的基团R³为H、C_1-6烷基、C_2-10烯基、芳基、杂芳基、或C_2-6烯基-芳基，其中所述芳基或杂芳基基团任选地被1-4个R^3a基团取代。式IVa的R^3a各自独立地为C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或OH。式IVa的R⁴各自为H、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基胺、C_0-6烷基-OH、C_1-6烷基-CO₂H、或C_1-6烷基-C(O)NH₂。式IVa的化合物包括其盐和异构体。

在一些实施方案中，是IVa的基团R³可以与其所连接的-C(O)O-基团结合成肉桂酰、烟酰、苯甲酰、乙酰、水杨酰、巴豆酰或牛皮消酰基团等。

在一些其它实施方案中，本发明提供了式IVb的化合物：

其中基团R¹、R²和R⁴与上述对式IVb中的定义相同。式IVb的化合物包括其盐和异构体。

表5.式IVb的糖苷化含物，其具有乳突果苷元(Gracigenin)作为糖苷配基；

在其它实施方案中，本发明提供了式IVc的化合物：

其中式IVc的基团R¹为糖Cym-Ole-Ole、Cym-Ole-Cym或Cym-Dig。式IVc的基团R²为OH、C_1-6烷氧基、-OC(O)-C_1-6烷基或-OC(O)O-C_1-6烷基，或与每个R²所连接的碳上的氢合并成(＝O)。式IVc的化合物包括其盐和异构体。

表6.式IVc的糖苷化合物，其具有本波苷元(penupogenin)作为糖苷配基

式IVc的其它化合物包括以cynanforridin作为糖苷配基的糖苷化合物，例如GAG-C87：

本发明还提供表7中的式V的化合物。

表7.乙酰苯化合物

  化合物  R₁  R₂  R₃  R₄  R₅  R₆  GAG-C02  COCH₃  H  OCH₃  OH  H  H  GAG-C23  COCH(OH)  H  OCH₃  OH  OCH₃  H  GAG-C113  COCH₃  OH  D-Cym  H  H  D-Ole

本发明还包括表8中的式VI的化合物。

表8.类固醇化合物

本发明还包括表9中的式VII的化合物。

表9.呋喃香豆素(furanocoumarin)

本发明还包括以下化合物：

本发明的化合物，包括式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie、II、IIa、III、IV、IVa、IVb、IVc、V、VI或VII的化合物，可以是分离的化合物。

本发明的酸性化合物的药学上可接受的盐是与碱形成的盐，即阳离子的盐，如碱金属和碱土金属的盐，如钠、锂、钾、钙、镁，以及铵盐，如铵、三甲基铵、二乙基铵和三(羟甲基)-甲基铵盐。

同样地，也可以向诸如无机酸、有机羧酸和有机磺酸(例如盐酸、甲磺酸、马来酸)的酸加成盐提供诸如吡啶基的碱性基团，构成结构的一部分。

可以通过将所述盐与碱或酸接触，并以常规的方式分离母体化合物来产生化合物的中性形式。化合物的母体形式与多种盐形式在某些物理性质上不同，如在极性溶剂中的溶解度，但在其它方面，该盐与用于本发明目的化合物的母体形式等效。

本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单独的异构体都旨在被包括在本发明的范围之内。

本发明的化合物可以通过本领域技术人员已知的各种方法来制备，例如参见，Richard C.Larock，Comprehensive OrganicTransformations(综合有机转换)1989，VCH Publishers，Inc.。

在一些实施方案中，本发明的化合物是分离的化合物。如本文所用，术语“分离的”是指基本上从自然中分离。在一些实施方案中，本发明的分离的化合物是从诸如乳突果的天然存在的化合物中分离的。任选地，本发明的分离的化合物具有比天然存在的浓度更高的浓度。在一些实施方案中，如通过既定的分析方法所确定的，分离的化合物具有至少为80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的纯度。

IV.组合物和给药

本发明还提供了本发明的化合物与药学上可接受的赋形剂的组合物。在一些实施方案中，本发明的化合物是式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie、II、IIa、III、IV、IVa、IVb、IVc、V、VI或VII的分离的化合物。在本发明中有用的药用赋形剂包括，但不限于，粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、涂料、甜味剂、调味剂和颜料。本领域技术人员将会认识到，其它药用赋形剂在本发明中是有用的。

在一些实施方案中，包括分离的化合物的组合物包含至少约10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高重量比的化合物。在一些实施方案中，包含本发明的分离的化合物的药物组合物是单位剂量的形式。单位剂量的形式可以是包装的制剂，该包装包含离散量的制剂，例如分装的片剂、胶囊、和小瓶或安瓿中的粉末。另外，单位剂量形式可以是胶囊，片剂，扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是适当数量的任何这些包装形式。根据特定的应用和分离的化合物的效力，单位剂量制剂中分离的化合物的量可以不同或在0.1mg至10000mg、1.0mg至1000mg或10mg至500mg的范围内调整。

本发明的化合物可以根据需要的频率给药，包括每小时、每天、每周或每月。在本发明的制药方法中使用的化合物的给药初始剂量为每天约0.0001mg/kg至约1000mg/kg。可以使用的每日剂量范围为约0.01mg/kg至约500mg/kg、或约0.1mg/kg至约200mg/kg、或约1mg/kg至约100mg/kg、或约10mg/kg至约50mg/kg。然而，剂量可以根据患者的需求、待治疗疾病状态的严重程度、以及利用的化合物而变化。例如，剂量可考虑在特定患者中诊断的疾病类型和阶段根据经验来确定。在本发明的上下文中，向患者给药的剂量应该足以随着时间在患者中产生有益治疗反应。剂量的大小也将取决于伴随向特定患者给予特定化合物的任何不良副作用的存在，性质和程度。针对特定情况的适当的剂量的确定在从业者的技能内。一般来说，用小于化合物的最佳剂量的小剂量开始治疗。此后，按小的增量增加剂量，直到在一定情况下达到最佳效果。为方便起见，如果需要的话，总的日剂量可被分成多份，并在每天分多份给药。剂量可每天或隔天给予，由主治医生决定。剂量也可在较长的一段时间(数周、数月或数年)定期或连续给予，例如通过皮下囊、袋或贮库的使用，或通过贴片。

可以用多种方式向患者给予药物组合物，包括通过局部、非肠道、静脉内、皮内、肌内、结肠、直肠或腹腔内。优选地，通过非肠道、局部、静脉内、肌内或口服给予药物组合物。

在实施本发明的方法时，药物组合物可以单独使用，或与其它治疗剂或诊断剂组合使用。在本发明的组合方案中使用的其它抗癌药物可以单独给药，或在组合方案中使用的一种或多种抗癌药物可以一起给药，如在混合物中。如果一种或多种抗癌药物单独给药，每种药物的给药时间和日程表可以有所不同。其它治疗剂或诊断剂可以与化合物在相同的时间、单独或在不同的时间给药。

在临床研究中，病变的数量、肿瘤大小、肿瘤的生长速度可以通过放射照相术、X线断层照相术监测，并在可能的情况下，直接测量肿瘤块。也可以使用分子生物学和生物化学技术测量抗肿瘤效果，如ELISA、PCR、免疫印迹或免疫细胞化学。

作为剂量所需的组合物的药学上的有效量将依赖于给药途径、待治疗的癌症的类型和患者的身体特性。可以调整剂量以实现期望的效果，但是仍取决于下列因素：如体表面积、体重、饮食、同时进行的疗法以及医学领域技术人员将认识到的其它因素。

上述仅是一般准则，可以在例如疾病类型和等级、患者年龄、健康状况、性别、联合使用的具体药物、给药途径和频率以及使用多药联合的实验和临床研究结果的基础上扩大或改变。

V.乳突果精制级分

在本发明中也有用的是乳突果精制级分。这些级分包括通过从药草本身提取化合物得到的级分，乳突果精制级分(AG-0)。进一步分级乳突果的精制级分制备的其它级分包括：AG-1、AG-2和AG-3。

乳突果精制级分可以通过本领域中已知的任何方法来制备。例如，可以用任何合适的溶剂，如醇、水、水性溶剂或有机溶剂，提取乳突果药草。用作为本发明中的溶剂的醇包括，但不限于，甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和乙二醇。有机溶剂可以是任何合适的有机溶剂，如，二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、戊烷、己烷和石油醚。

在一些实施方案中，本发明提供了制备乳突果精制级分方法，包括将乳突果药草与甲醇或乙醇接触，以形成醇提取物；将醇提取物与有机溶剂接触，以形成有机溶剂级分；和将有机溶剂级分与石油醚接触以形成乳突果精制级分。有机溶剂可以是如上所述的任何合适的有机溶剂。在其它实施方案中，本发明提供了通过这种方法制备的乳突果精制级分。

乳突果精制级分可以由本领域中已知的任何手段进一步分级，包括通过柱层析、HPLC和其它方法。在一些实施方案中，上述制备的乳突果精制级分通过以下进一步分级：用约30％的乙醇水溶液从树脂柱洗脱乳突果精制级分的第一级分；用约60％的乙醇水溶液从所述树脂柱洗脱第二级分；并且用约96％的乙醇水溶液从所述树脂柱洗脱第三级分。在其它实施方案中，本发明提供了通过上述方法制备的乳突果精制级分。

VI.改善记忆的方法

本发明还提供了改善记忆和学习的方法，其通过给予乳突果精制级分(AG-0)，或给予从乳突果精制级分中分离出的化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予个体AG-0或从AG-0提取的第一级分(AG-1)、第二级分(AG-2)或第三(AG-3)级分。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的式I、Ia、Ib、Ic、Id或Ie的任何化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予个体式II或IIa的化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的式III的化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的式IV、Iva、IVb或IVc的任何化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的从式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie、II、IIa、III、IV、IVa、IVb、IVc、V、VI或VII的任意一种分离的化合物，或其药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的本发明的乳突果精制级分。

多种参数可以被测量，以确定本发明的化合物或乳突果精制级分(AG-0)是否能改善个体的学习和记忆。例如，可以在对照(例如，未经本发明的化合物或AG-0处理的)和用本发明的化合物或AG-0预处理的组之间比较学习和记忆的改善程度。学习和记忆的改善可以被评估，例如，使用啮齿类动物的Morris水迷宫(参见，例如，实施例章节)，或如上述的用于人类的任何合适的测试。如果用本发明的化合物或AG-0处理的组与对照组比较，这些参数中的任何一个或多个被改变例如，约10％，任选地至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％等，那么可以说，本发明的化合物或AG-0改善个体的学习和记忆。另外，采用连续变量的ANOVA、非参数数据的曼-惠特尼U、分类变量的卡方、或Fisher精确检验的统计分析，P＜0.05被认为是显著的。

一般来说，训练用本发明的AG-0或化合物处理的小鼠和对照小鼠(即不用本发明的化合物处理)，通过学习隐藏的平台的位置，并攀上它来逃避游泳任务。完成这个任务所花费的时间被定义为逃避潜伏期。此测试可在数天内每天进行一次或更多次。表示改善学习和记忆的一个参数是，通过攀到隐藏的平台而逃避游泳任务的潜伏期的缩短(见下面的实施例章节)。还参见Gozes et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：427-432(1996)中所述的方法，通过引用将其并入本文。用合适的本发明的化合物或级分处理的动物与不用本发明的化合物或级分处理的对照相比，在其学习和记忆能力方面表现出改善。本发明的实施方案并不限于用于测量表现的测试的实例。可以使用任何合适的测试方法测量诸如学习和记忆的表现。

在本领域中已知的其它方法可用于人类个体内，以确定本发明的化合物或化合物组合或乳突果精制级分是否能在体内改善表现(例如，学习和记忆)。例如，这些方法包括利用以下随着时间评估学习或记忆：雷德记忆测试(Randt et al.，Clin.Neuropsychol.，1980，2：184)、韦氏记忆量表(J.Psych.19：87-95(1945)、正向数字跨度测试(Handbook of thePsychology of Aging(老龄化心理学手册)，Birren，J.，和Schaie，K.(Eds.)，New York，Van Nostrand(1977)中的Craik，Age Differences in HumanMemory(人类记忆年龄差异)、简易精神状态检查(Folstein et al.，J.ofPsych.Res.12：189-192(1975)、或加州言语学习测试(CVLT)。还参见，美国专利第6,030,968号。在这些测试中，与本发明的化合物或级分的影响无关的因素(如，焦虑、疲劳、愤怒、抑郁、精神错乱或精力)受到控制。参见，美国专利第5063206号。评估和控制主观因素的方法是领域内已知的并且通过以下标准临床试验确定，如贝克抑郁量表、斯皮尔伯格特质焦虑状态测试和POMS测试(情绪状态曲线)。

VII.治疗由NMDA受体和β-淀粉样肽调制的疾病和病症的方法

本发明还提供了抑制NMDA受体活性而用于治疗CNS病症的方法。在一些实施方案中，本发明提供了抑制NMDA受体活性而用于治疗CNS病症的方法，其通过将乳突果精制级分(AG-0)或从AG-0提取的第一级分(AG-1)、第二(AG-2)级分和/或第三级分(AG-3)与NMDA受体接触。在一些实施方案中，该方法包括将式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie、II、IIa、III、IV、IVa、IVb、IVc、V、VI或VII的化合物，或其药物组合物与NMDA受体接触。在一些实施方案中，化合物是分离的化合物。优选地，NMDA受体是活化的NMDA受体。

本发明还提供了抑制β-淀粉样肽的活性，从而保护神经元免受β淀粉样肽诱导的毒性的方法。在一些实施方案中，该方法包括将表达β-淀粉样肽的神经元与乳突果精制级分(AG-0)或从AG-0提取的第一级分(AG-1)、第二级分(AG-2)和/或第三级分(AG-3)接触。在一些实施方案中，该方法包括将表达β-淀粉样肽的神经元与式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie、II、IIa、III、IV、IVa、IVb、IVc、V、VI或VII的化合物，或其药物组合物接触。在一些实施方案中，化合物是分离的化合物。

本发明提供了神经保护作用，并且改善认知障碍。本发明的化合物和级分对CNS的急性和慢性病症的治疗是有用的，范围为从神经病理学疾病状态到与兴奋性毒性有关的神经退行性疾病和疾病状态。可以使用本发明的化合物或级分进行治疗的疾病状态，包括，但不限于，神经退行性疾病、头部和脑外伤、遗传性疾病、传染病、炎症性疾病、药物治疗、药物和酒精紊乱、神经性疼痛、癌症、代谢紊乱、智力低下以及学习和记忆障碍，诸如例如年龄相关的记忆丧失、阿尔茨海默病、轻度认知功能障碍、肌萎缩性侧索硬化症、亨廷顿氏舞蹈病、失忆、B1缺乏病、精神分裂症、抑郁症和双相情感障碍、脑血管疾病、中风、脑积水、蛛网膜下腔出血、血管供血不足、脑肿瘤、癫痫、帕金森氏病、脑微血管病变、止痛药治疗、化疗、缺氧如由心肺机、麻醉、或短期溺水引起的、痴呆症(血管、额颞叶引起的、路易体、语义、原发性进行性失语、皮克氏)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、桥本脑病、ADD、ADHD、诵读困难症、唐氏综合征、脆性X综合征、特纳氏综合征、胎儿酒精综合征、抑郁症、焦虑、食欲不振、多发性硬化症、自闭症和恶病质。

在一些实施方案中，本发明的化合物和级分可用于治疗选自以下的疾病：肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿氏病、急性或慢性神经性疼痛、中风、脑外伤、癫痫、中风、痴呆症、多发性硬化症、抑郁症、精神分裂症和自闭症。在其它实施方案中，本发明提供了治疗个体的神经退行性疾病或神经病理学疾病状态的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的本发明的化合物或组合物或乳突果精制级分。

通常，本文所提供的治疗方法包括给予个体有效量的乳突果精制级分(AG-0)和/或从AG-0提取的第一级分(AG-1)和/或第二级分(AG-2)和/或第三级分(AG-3)，或从本文提供的AG-0分离出的一种或多种分离的化合物。在一些实施方案中，本发明的级分(们)和/或化合物(们)可以被口服给予个体(例如，人)。有效量可以是足以调节NMDA受体和/或β-淀粉样肽活性的量和/或足以减轻或缓解个体呈现的症状的量。给药量是足以产生足够高的级分或化合物血浆浓度，以在体外可检测地抑制NMDA受体和/或β-淀粉样肽。

VIII.治疗癫痫的方法

本发明还提供了治疗癫痫的方法，其通过给予乳突果精制级分(AG-0)，或给予从乳突果精制级分中分离出的化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予个体AG-0或从AG-0提取的第一级分(AG-1)、第二级分(AG-2)或第三级分(AG-3)。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的I、Ia、Ib、Ic、Id或Ie的任何化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予个体式II或IIa的化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的式III的化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的式IV、IVa、IVb或IVc的任何化合物。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie、II、IIa、III、IV、IVa、IVb、IVc、V、VI或VII的任意一种分离的化合物，或其药物组合物。在一些实施方案中，该方法包括给予有需要的个体治疗有效量的本发明的乳突果精制级分。

多种参数可以被测量，以确定本发明的化合物或乳突果精制级分(AG-0)是否能治疗个体的癫痫。例如，可以在对照(例如，未经本发明的化合物或AG-0处理的)和用本发明的化合物或AG-0预处理的组之间比较治疗或预防癫痫的程度。可以使用以下来评估对癫痫痉挛的预防，例如，啮齿动物听源性痉挛易感性测试(参见，例如，实施例章节)；通过EEG分析或行为建模(自主活动、场景性恐惧反应、肌肉强度和协调性)监测个体痉挛活动的增加或减少，或如上所述的用于人类的任何其它合适的测试。如果用本发明的化合物或AG-0处理的组与对照组比较，这些参数中的任何一个或多个被改变例如，约10％，任选地至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％等，那么可以说，本发明的化合物或AG-0治疗或预防个体的痉挛。另外，采用连续变量的ANOVA、非参数数据的曼-惠特尼U、分类变量的卡方、或Fisher精确检验的统计分析，P＜0.05被认为是显著的。

用于评估对癫痫痉挛的预防的动物模型通常是任何种类的哺乳动物，但通常为小鼠。合适的动物的具体例子包括DRA/2J品系小鼠，或者Frings小鼠品系小鼠，Frings小鼠可以是优选的，由于Frings小鼠对听源性痉挛的易感性保持到成年这一事实(Shradski et al.，1998，Genomics 49，188-192)。一般来说，将用本发明的化合物或AG-0处理的小鼠暴露于刺激，如听源性刺激，然后对痉挛的各种指征进行评分，包括但并不限于，预定时间周期的狂奔、阵挛、前肢伸展/后肢弯曲，前肢和后肢伸展和/或通过旋转杆测试评估的运动障碍(参见，例如，实施例章节)。用合适的本发明的化合物或级分处理的动物与不用本发明的化合物或级分处理的对照相比，表现出对癫痫痉挛的预防的增加。

IX.实施例

实施例1：乳突果精制级分不会引起任何细胞毒性

为检测乳突果精制级分(AG-0)对原代大鼠神经元的作用，培养物用不同浓度的AG-0处理。如图1所示，所测试的全部浓度均未发现可观测的细胞死亡。

实施例2：乳突果精制级分促进抗B27取出的神经元存活原代皮层神经元在补充B27的Neurobasal培养基(Life Technologies专利配方)中培养。Neurobasal培养基与B27的组合为原代神经元的体外成熟提供了稳定的生长环境。缺乏B27时，神经元经历凋亡或细胞死亡。为研究乳突果精制级分的神经保护作用，用AG-0处理7DIV的神经元，并通过MTT分析以线粒体活性测定细胞存活。如图2所示，对AG-0的剂量依赖性研究显示，其在10-30μg/ml时对缺乏B27培养的原代神经元有神经保护作用。AG-0处理的培养物中观测到的神经元存活水平与B27存在时观测到的水平相似。

实施例3：乳突果精制级分促进大鼠原代皮层神经元中抗NMDA兴奋性毒性的神经元存活进行NMDA存活分析来验证乳突果精制级分在原代皮层神经元细胞中预防NMDA受体诱导的兴奋性毒性的能力。图3显示缺乏和存在不同浓度的AG-0时，NMDA损伤对皮层细胞的影响。与DMSO对照相比，AG-0(30μg/ml时)使细胞死亡降低超过40％。

实施例4：乳突果精制级分促进大鼠原代皮层神经元中抗β-淀粉样肽损伤的神经元存活

外源添加的β-淀粉样肽(Aβ)通过凋亡启动神经元培养物的细胞死亡。进行MTT分析来研究乳突果精制级分在原代皮层神经元细胞中预防Aβ诱导的兴奋性毒性的能力。图4显示缺乏和存在不同浓度的AG-0时，Aβ损伤对皮层细胞的影响。与DMSO对照相比，AG-0(30-50μg/ml时)促进细胞存活。

实施例5：乳突果精制级分抑制β-淀粉样肽处理的原代神经元中的半胱天冬酶-3裂解

半胱天冬酶属于半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族，其通过顺序活化由无活性酶原的水解加工形成活性酶而参与细胞凋亡。半胱天冬酶-3被认为是凋亡途径的刽子手，而且是参与裂解淀粉样前体蛋白以及产生β-淀粉样肽(Aβ)的主要的半胱天冬酶，所述β-淀粉样肽(Aβ)与阿尔茨海默病中的神经元死亡有关。将Aβ外源添加到神经元培养物来启动半胱天冬酶-3依赖性凋亡。由于乳突果精制级分保护由Aβ诱导的神经元死亡(如MTT分析所显示)，所以检测了Aβ存在时AG-0对皮层神经元中的半胱天冬酶-3活化的作用。

如图5所示，添加Aβ导致裂解的半胱天冬酶-3(17kDa，活性形式)的蛋白表达增加。然而，AG-0存在时，裂解的半胱天冬酶-3的表达水平以剂量依赖的方式显著降低至与不添加Aβ的表达水平相当。

实施例6：乳突果精制级分抑制β-淀粉样肽处理的原代神经元中的半胱天冬酶-3活性

为进一步检测半胱天冬酶-3裂解产物的减少是否导致半胱天冬酶-3酶活性降低，采用荧光分析来研究乳突果精制级分对半胱天冬酶-3活性的作用。半胱天冬酶是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶，而半胱天冬酶-3裂解包含DEVD氨基酸序列的底物。为测定半胱天冬酶-3的活性，将人工底物DEVD与荧光染料相结合，其中裂解导致荧光染料的释放及随后任意荧光单位的增加。如图6所示，添加Aβ导致半胱天冬酶-3活性增加。然而，AG-0存在时相对荧光单位以剂量依赖的方式显著减少至与未添加Aβ时相当。

实施例7：乳突果精制级分活化原代皮层神经元和PC12细胞中的MEK/ERK/CREB

已证明MEK/ERK/CREB通路参与神经元存活和分化。因而研究乳突果精制级分对这些信号转导蛋白的作用。检测AG-0对7DIV的皮层神经元(A&B)和12-15代的PC12(C&D)的瞬时作用和剂量依赖性作用。如图7所示，孵育15分钟之后，AG-0明显诱导皮层神经元(1-100μg/ml)和PC12细胞(10-100μg/ml)中的ERK磷酸化。从瞬时研究来看，AG-0通过ERK和MEK磷酸化诱导CREB的活化。

实施例8：在用乳突果精制级分处理的神经元中诱导BDNF表达

AG-0诱导原代皮层神经元中的ERK和CREB磷酸化。因此，检测CREB活化之后乳突果精制级分对BDNF和bc1-2(两者都是CREB活化后的下游靶基因)的下游作用。利用实时PCR分析，在不同时间间隔研究用AG-0处理的神经元培养物中的基因表达变化。如图8所述，AG-0显著增加BDNF的表达，但未增加bcl-2的表达。

实施例9：活性指导的分级

为分离对由乳突果精制级分所表现出的活性有贡献的化合物，对AG-0进行进一步分级。将AG-0通过30％乙醇(AG-1)，60％乙醇(AG-2)和96％乙醇(AG-3)进一步分成第一部分、第二部分和第三部分。皮层神经元用这三个部分预先处理，并分析ERK的表达。如图9所示，AG-3在10μg/ml时显示出强的ERK磷酸化，而AG-1和AG-2却未发现活化。AG-1仅在30μg/ml之后观测到ERK活化。

实施例10：缺乏B27时用乳突果精制级分处理的皮层神经元的免疫荧光染色

AG-0和AG-3的神经保护作用通过皮层神经元的免疫荧光染色可视地显现。皮层神经元用AG-0和AG-3预先处理，将培养基更换成缺乏B27的培养基。将神经元固定并用神经元标记物免疫染色。如图10所示，取出B27之后，AG-0和AG-3保护原代皮层神经元免于细胞死亡。

实施例11：AG-0、AG-1和AG-3通过Src激酶诱导PC12细胞中的ERK磷酸化

为检测乳突果精制级分以及其它部分AG-1、AG-2和AG-3对ERK磷酸化的信号转导机制，在用AG-0、AG-1、AG-2或AG-3处理之前，PC12细胞用不同的抑制剂预先处理。如图11所示，发现U0126(MAP激酶激酶，MEK-1和MEK-2抑制剂)，PD98059(MEK抑制剂)和PP2(Src抑制剂)明显减弱由AG-0和AG-3诱导的ERK磷酸化，表明MEK和Src激酶的参与。另一方面，U0126，PD98059，KN62(CAMKII抑制剂)，H89 & KT5720(PKA抑制剂)，K252a(非特异的蛋白激酶抑制剂)，PP2和KY5823(PKG抑制剂)减弱由AG-1诱导的ERK磷酸化。观察到用PP3(PP2的失活对照)，渥曼青霉素(PI3K抑制剂)，API-2(Akt抑制剂)和白屈菜红碱(PKC抑制剂)的处理没有影响。

实施例12：乳突果精制级分明显提高年老小鼠在Morris水迷宫中的学习技能

如图12所示，利用Morris水迷宫任务(研究海马依赖性学习和记忆的有利实验)来证明新化合物对小鼠的空间学习和记忆的治疗作用。Morris水迷宫是测定测试个体学习和记忆能力的通用动物模式。其由具有隐藏的水下逃生平台的水池组成。小鼠必须在连续几天的时间内利用背景或位置线索记住平台的位置。定位隐藏平台所耗费的时间(逃避潜伏期)是动物认知能力的度量。

在5天时间内，使年老小鼠(18月龄，口服给予AG-0或水)和年幼的小鼠(4周龄，口服给予水)进行Morris水迷宫实验。每一天，测定小鼠发现水迷宫中隐藏的平台所耗费的时间，以秒计。与年幼小鼠相比，年老小鼠能记住但需耗费更多的时间到达平台。AG-0处理的小鼠定位隐藏平台时显示出明显的改善。如图12所示，与水处理的年老小鼠相比，AG-0处理的小鼠的逃避潜伏期从第1-3天开始减少。

实施例13：乳突果精制级分在强迫游泳实验中显示出抗抑郁剂的作用

已证明乳突果精制级分能提高大鼠神经元中的BDNF表达和CREB磷酸化。最近的发现已表明，BDNF和CREB蛋白的表达是治疗抑郁症的关键因素。因而，检测AG-0在建立完好的抑郁症动物模型——强迫游泳实验(FST)中的作用。口服给予年幼小鼠AG-0或水持续7天。第8天时，将小鼠放到装满水的圆筒中，由此形成防止任何逃生且诱导绝望的环境。24小时之后，将这些小鼠再次放到圆筒中，测定它们停止挣扎的时间(不动持续时间)。抗抑郁剂可有效减少不动持续时间。如图13所示，AG-0(10、30和100mg/kg)明显减少小鼠在FST中的不动时间。

实施例14：乳突果精制级分在旷场实验中显示出对自主活动没有影响

为确定在FST中AG-0处理的小鼠的不动时间的减少是否是由于AG-0对测试个体自主活动的影响，对AG-0处理的小鼠进行旷场实验(OFT)。OFT是已建立的测定化合物对测试个体的自主活动影响的模型。测试个体进行AG-0的相似处理模式，然后使这些测试个体进行OFT。如图14所示，这三组小鼠之间没有显著差异：对照(CTL)，AG-0处理的小鼠(AG_100)和丙咪嗪(IMI_15)。

实施例15：从乳突果精制级分分离的化合物促进抗B27取出的神经元存活

为鉴定对乳突果精制级分的神经保护作用作出贡献的化合物，从AG-0中分离出129种天然化合物。使全部化合物进行B27取出实验。如图15所示，其中的7种化合物促进缺乏B27时的皮层神经元的细胞存活。将它们命名为GAG-C13、GAG-C27、GAG-C77、GAG-C78、GAG-C80、GAG-C81和GAG-C82。这些阳性化合物的表征鉴定出GAG-C13、GAG-C27、GAG-C78和GAG-C80为新结构。

实施例16：从乳突果精制级分分离的保护B27取出的神经元的化合物诱导ERK磷酸化

测试促进抗B27取出的神经元存活的化合物诱导ERK磷酸化的能力。对用不同剂量的化合物处理15分钟的神经元裂解物进行Western印迹分析。如图16所示，它们全部以剂量依赖的方式诱导ERK磷酸化，尽管是不同的程度。

实施例17：从乳突果精制级分分离的化合物促进抗NMDA诱导的细胞死亡的神经元存活

为鉴定对乳突果精制级分的神经保护作用作出贡献的化合物，从AG-0中分离出129种天然化合物。对全部化合物进行NMDA兴奋性毒性实验，如图17所示，其中的19种化合物促进NMDA处理之后的神经元存活，尽管是不同的程度。将这些化合物命名为GAG-C12、GAG-C13、GAG-C35、GAG-C51、GAG-C61、GAG-C65、GAG-C70、GAG-73、GAG-C86、GAG-C87、GAG-C90、GAG-C91、GAG-C92、GAG-C96、GAG-C97、GAG-C101、GAG-C102、GAG-C103以及GAG-C104。通过表征鉴定出GAG-C13、GAG-C51、GAG-C61、GAG-C65、GAG-C73、GAG-C90、GAG-C96、GAG-C102及GAG-C104为新结构。

实施例18：从乳突果精制级分分离的促进抗NMDA兴奋性毒性的神经元存活的化合物诱导ERK磷酸化

检测促进抗NMDA兴奋性毒性的神经元存活的化合物诱导ERK磷酸化的能力。对用不同剂量的化合物处理15分钟的神经元裂解物进行Western印迹分析。如图18所示，除了GAG-C51和GAG-C97之外，所有化合物在特定剂量时都诱导ERK磷酸化，尽管是在不同的程度。

实施例19：从乳突果精制级分分离的化合物促进抗β-淀粉样肽诱导的细胞死亡的神经元存活

为鉴定对乳突果精制级分的神经保护作用作出贡献的化合物，从AG-0中分离出129种天然化合物。研究这些化合物对β-淀粉样肽(Aβ_25-35)处理的原代皮层神经元的作用。如图19所示，10种化合物(GAG-C13、GAG-C30、GAG-C59、GAG-C69、GAG-C70、GAG-73、GAG-C74、GAG-C76、GAG-C104及GAG-C121)促进用Aβ_25-35处理的皮层神经元的细胞存活。通过进一步表征，鉴定出GAG-C13、GAG-C30、GAG-C59、GAG-C69、GAG-C73、GAG-C76及GAG-C104为新结构。

实施例20：从乳突果精制级分分离的促进抗β-淀粉样肽兴奋性毒性的神经元存活的化合物同样诱导ERK磷酸化

检测促进抗β-淀粉样肽损伤的神经元存活的分离化合物诱导ERK磷酸化的能力。对已用不同剂量的化合物处理15分钟的神经元裂解物进行Western印迹分析。除了GAG-C59之外，所有化合物(实施例18中给出的GAG-C70和GAG-C73)诱导ERK磷酸化，尽管是不同的程度，如图20所示。

实施例21：GAG-C27保护神经元抗B27取出

皮层神经元用GAG-C27预先处理，并将培养基更换成缺乏B27的培养基。将神经元固定并用神经元标记物免疫染色。如图21所示，B27取出之后，GAG-C27保护皮层神经元免于细胞死亡。GAG-C27由新结构组成。

实施例22：B27缺乏时GAG-C27促进皮层神经元的存活

利用7DIV的原代神经元研究化合物GAG-C27的神经保护作用，通过MTT分析以线粒体活性测定细胞存活。对GAG-C27的剂量依赖研究表明其在30μM时对缺乏B27培养的原代神经元有神经保护作用，如图22所示。

实施例23：GAG-C27诱导原代皮层神经元中的ERK磷酸化

利用Western印迹分析检测GAG-C27对7DIV的皮层神经元中ERK磷酸化的影响。如图23所示，15分钟之后，GAG-C27诱导皮层神经元中的ERK磷酸化，持续60分钟。对AKT蛋白磷酸化没有影响，但是观测到孵育30分钟之后，GAG-C27处理的裂解物中磷酸化P38减少。

实施例24：GAG-C77促进抗B27取出的神经元存活

利用7DIV的原代皮层神经元研究化合物GAG-C77的神经保护作用。使神经元细胞经受B27取出，接着通过MTT分析以线粒体活性测定细胞存活。如图24所示，剂量依赖研究表明GAG-C77在10-30μM时对缺乏B27培养的原代皮层神经元发挥其神经保护作用。

实施例25：GAG-C77诱导原代皮层神经元中的ERK磷酸化

检测GAG-C77对ERK磷酸化的影响。如图25所示，GAG-C77(30μM)从15分钟持续至180分钟显著诱导皮层神经元中的ERK磷酸化。此外，GAG-C77在孵育15分钟时还诱导CREB磷酸化。

实施例26：GAG-C77诱导CREB启动子活性

GAG-C77诱导原代皮层神经元中的ERK和CREB磷酸化。因此，检测GAG-C77在CREB活化之后的下游效应。利用连接报告基因(荧光素酶)的CREB启动子分析，发现GAG-C77显著诱导由CREB启动子驱动的荧光素酶活性(参见图26)。

实施例27：GAG-C78促进抗B27取出的神经元存活

利用7DIV的原代皮层神经元研究化合物GAG-C78的神经保护作用。使神经元细胞经受B27取出，接着通过MTT分析以线粒体活性测定细胞存活。如图27所示，剂量依赖研究表明GAG-C78在10-30μM时对缺乏B27培养的原代皮层神经元发挥其神经保护作用。

实施例28：GAG-C78诱导原代皮层神经元中的ERK磷酸化

检测GAG-C78对ERK磷酸化的影响。如图28所示，GAG-C78(30μM)从15分钟持续至180分钟显著诱导皮层神经元中的ERK磷酸化。此外，GAG-C78在孵育15分钟时还诱导CREB磷酸化。

实施例29：GAG-C80剂量依赖性促进抗B27取出的神经元存活

利用7DIV的原代皮层神经元检测化合物GAG-C80的神经保护作用，并通过MTT分析以线粒体活性测定细胞存活。如图29所示，GAG-C80以剂量依赖的方式(10-30μM)对缺乏B27培养的原代神经元显示出神经保护作用。观测到GAG-C80处理的培养物中的神经元存活水平与存在B27时培养的神经元类似。

实施例30：GAG-C81促进抗B27取出的神经元存活

利用7DIV的原代皮层神经元检测化合物GAG-C81的神经保护作用，并通过MTT分析以线粒体活性测定细胞存活。如图30所示，GAG-C81以剂量依赖的方式对缺乏B27时培养的原代神经元显示出神经保护作用。

实施例31：GAG-C73在全细胞膜片钳研究中显示出NMDA受体拮抗剂活性

进行全细胞膜片钳研究来测定存在或缺乏新化合物时穿过海马神经元表面的离子流，从而证明NMDA受体活性。NMDA受体是门控离子通道，其允许神经冲动过程中的电流流入。受体的拮抗剂将防止电流的流入。如图31所示，添加的NMDA在锥体细胞中诱导去极化并启动内向电流。

实施例32：GAG-C73以剂量依赖的方式保护神经元抗NMDA诱导的细胞死亡

皮层神经元用不同浓度的GAG-C73预先处理，随后经受中毒剂量(20μM)的NMDA。然后进行存活分析以检测GAG-C73有效保护神经元细胞免于NMDA诱导的兴奋性毒性的能力。如图32所示，与DMSO对照相比，用GAG-C73预先处理时存在剂量依赖性细胞死亡的显著减少。

实施例33：GAG-C73保护神经元抗不同浓度的NMDA

皮层神经元用GAG-C73预先处理，随后经受不同浓度的NMDA。然后进行存活分析以测定GAG-C73有效保护神经元细胞免于NMDA诱导的兴奋性毒性的能力。如图33所示，与NMDA中毒剂量的DMSO对照相比，用GAG-C73预先处理时存在细胞死亡的显著减少。

实施例34：GAG-C73保护神经元抗谷氨酸盐损伤

谷氨酸盐是活化NMDA受体的生理神经递质。然而，过量的谷氨酸盐会导致兴奋性毒性和可能的细胞死亡。进行存活分析来测定GAG-C73有效保护神经元细胞免于谷氨酸盐诱导的兴奋性毒性的能力。如图34所示，在所检测的全部浓度的谷氨酸盐时，与DMSO对照相比，用GAG-C73预先处理时存在细胞死亡的显著减少。

实施例35：GAG-C69保护神经元抗β-淀粉样肽损伤

GAG-C69是从AG分离的促进抗Aβ损伤的神经元存活的化合物中的一种。如图35所示，GAG-C69使抗Aβ损伤的神经元存活增加至与对照水平(无Aβ处理)相当。

实施例36：GAG-C69抑制淀粉样肽处理的原代神经元中的半胱天冬酶-3活性

如MTT分析所显示，GAG-C69保护神经元抗由Aβ诱导的死亡。因而通过Western印迹分析检测化合物对Aβ存在时皮层神经元中的半胱天冬酶-3活化的影响。如图36所示，Aβ处理存在时裂解的半胱天冬酶-3(17kDa，半胱天冬酶-3的活性形式)的蛋白表达增加。添加GAG-C69的情况下，裂解的半胱天冬酶-3的表达水平显著降低至与无Aβ时相当的水平。

实施例37：GAG-C14诱导原代皮层神经元中的ERK磷酸化

利用Western印迹分析，在7DIV的皮层神经元中检测GAG-C14对ERK磷酸化的影响。如图37所示，15分钟之后GAG-C14诱导皮层神经元中的ERK磷酸化，并且该作用持续90分钟。化合物对AKT蛋白磷酸化没有可观测的影响。

实施例38：GAG-C14调节棘形态发生

树突棘，来自神经元树突的小的膜突起，通常接收来自轴突的单突触输入，充当突触强度的存储位点并辅助传送电信号至神经元的细胞体。在海马神经元中鉴定出两类树突棘(棘)：成熟棘(蘑菇形的)和未成熟棘(树突丝)。未成熟棘，其具有受损的信号转导能力，通常仅具有颈部且没有或具有非常小的“头部”。成熟棘具有头部和颈部，并且具有强突触接触的棘通常具有大的棘头，所述棘头通过蘑菇形膜颈部与树突连接。已报道海马的CA1区以及第III层锥体层的衰老神经元中棘密度降低(Duanet al.，2003；von Bohlen und Halbach et al.，2009)。棘的减少还与重度抑郁症以及精神分裂症有关(Law et al.，2004)。认知障碍如孤独症、精神发育迟缓、脆性X综合征、中风和慢性酒精中毒可能是树突棘异常的结果，尤其是涉及棘的数量和它们的成熟度(Bhatt et al.，2009；von Bohlen undHalbach et al.，2009)。

如图38所示，用GAG-C14处理神经元细胞时，GAG-C14处理的神经元的棘密度增加，尤其是棘的头部大于1μm。此外，与对照相比，树突丝的频度下降。

实施例39：来自乳突果精制级分的新化合物诱导原代皮层神经元中的ERK磷酸化

利用Western印迹分析，在7DIV的皮层神经元中检测从乳突果精制级分分离的化合物对ERK磷酸化的影响。将不同浓度的化合施加到培养物中，处理15分钟之后，检测皮层神经元中的ERK磷酸化。如图39所示，用这些化合物处理后刺激ERK磷酸化，尽管是在不同的程度。每种化合物的最佳剂量也不同。

实施例40：乳突果精制级分在Frings小鼠中显示出抗惊厥作用

为确定乳突果精制级分(AG-0)对动物癫痫模型的影响，腹腔内给予AG-0之后评估Frings小鼠的听源性痉挛易感性。Frings小鼠对听源性痉挛敏感，并且它们的痉挛表现包括响应于高强度声音刺激的狂奔、丧失翻正反射、强直性屈曲以及强直性伸展。声音刺激之后，并未表现出后肢强直性伸展的测试个体被认为是受保护的。

为测定AG-0对Frings小鼠抗听源性痉挛的峰效应的时间，在AG-0处理之后的不同时间间隔诱导痉挛。如表10所示，在听源性痉挛之前4小时给予的AG-0达到峰值。在诱导痉挛之前4小时，对Frings小鼠腹腔注射AG-0(50mg/kg)导致对50％测试个体的保护效应。

表10：腹腔注射后AG-0抗Frings小鼠听源性痉挛易感性的时间效应

通过用不同浓度的AG-0处理Frings小鼠，获得更多关于AG-0的抗惊厥效应的定量数据。处理之后4小时进行小鼠评分。如表11所示，给予100mg/kg和150mg/kg的AG-0分别对63％和100％的测试个体显示出保护效应。

表11：腹腔注射后AG-0对Frings小鼠的听源性痉挛易感性的剂量效应

^a表明95％置信区间。

实施例41：AG-3表征为包含GAG-C77、GAG-C13、GAG-C14和GAG-C69

AG-3通过柱层析在硅胶上用90/10至50/50的石油醚/乙酸乙酯混合物，之后用100/1至70/30的氯仿/甲醇混合物进行梯度洗脱来分级。如图40所示，基于TLC分析，获得总共26种级分。通过HPLC进一步分析这些级分。用80/20的石油醚/乙酸乙酯洗脱得到级分AG-3-9。此外，单峰的HPLC色谱的保留时间和UV光谱表明，级分AG-3-9部分包含化合物GAG-C13、GAG-C77和GAG-C69，GAG-C13作为其主要组分。

实施例42：GAG化合物增强CRE依赖的转录活性

长时记忆存储涉及突触强度的长效变化。突触强度的这种改变需要从头合成蛋白。cAMP反应元件结合蛋白(CREB)是在调控参与突触可塑性和记忆形成的蛋白表达中起重要作用的转录因子。CREB将来自膜的神经信号传送至细胞核，从而通过结合启动子区含有cAMP反应性元件(CRE)结构域的基因来调控基因转录。由于CREB是形成记忆所必需的，CREB通路是用于寻找认知增强剂的靶标之一。CRE启动子分析是研究CREB通路活化的功能性显示。

所培养的海马神经元用包含环AMP反应(CRE)元件的萤火虫荧光素酶报告质粒转染。12DIV时，细胞用50μM的化合物处理6小时，然后通过测定荧光素酶水平来分析CRE依赖的转录活性。如图41所示，GAG化合物GAG-C14、GAG-C53、GAG-C63、GAG-C69、GAG-C84、GAG-C111、GAG-C122、GAG-C123以及GAG-C129中的每一种都增强海马神经元中的CRE依赖的转录。

实施例43：化合物的制备

本发明化合物的制备。于1997年7月在中国云南省西北部的中甸采集乳突果[Adelostemma gracillimun Hook f.(Asclepiadaceae)]的根，由中国科学院昆明植物研究所的Mu，Quan-zhang教授鉴定。

将乳突果的根清洗、干燥并研磨成粉。然后以1∶5的w/v在乙醇(或甲醇)中浸润30分钟，回流1.5小时3次或2小时2次。将乙醇提取物悬浮于水中，利用氯仿(或二氯甲烷或乙酸乙酯)以1∶1的v/v分相3次。然后将这些粗氯仿级分混合并通过蒸发干燥。接着通过用石油醚(PE，60-80℃)以1∶10的w/v回流1小时来精制混合的氯仿级分。将不溶于PE的物质收集并干燥，发现主要含有该草药的总糖苷。将精制的氯仿级分以1∶10的w/v再次溶解于70％乙醇，通过滤纸(3M)并在旋转蒸发器中干燥。接着将精制的氯仿级分溶解于100％二甲亚砜，并进行不同的体外和体内生物活性分析。精制的氯仿级分在本文简写为“AG-0”。

对乳突果精制的氯仿级分(AG-0～200g)进行微孔树脂柱(D-101)层析。柱由水冲洗(丢弃)，接着用30％乙醇(EtOH)/H₂O (AG-1)、60％EtOH/H₂O(AG-2)和96％ EtOH/H₂O(AG-3)连续洗脱以产生第一、第二和第三级分AG1-AG3。将这三种级分AG1-AG3干燥成6g(AG-1)、28g(AG-2)和170g(AG-3)。从级分AG-1分离出化合物GAG-C02和GAG-C23，从级分AG-3分离出其余化合物。

采用硅胶柱对级分AG-3进行层析分级，用石油醚/乙酸乙酯和氯仿/甲醇进行梯度洗脱，获得26种级分。从AG-3获得的其它子级分进行如下的下一步分离步骤：(1)硅胶柱层析，(2)硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析，(3)硅胶柱层析和Sephadex LH-20柱层析及最后的半制备和/或制备HPLC，(4)硅胶柱层析和ODS柱层析，(5)硅胶柱层析和ODS柱层析及最后的半制备和/或制备HPLC，(6)硅胶柱层析和最后的半制备和/或制备HPLC。通过实施以上的分离步骤中的一种，可以得到纯化合物。对于诸如GAG-C27和GAG-C28的一些化合物，需要通过制备HPLC分离的额外纯化步骤来得到纯化合物。

本发明化合物的分析。采用PERKIN-ELMER 241旋光仪在室温下在MeOH中测定旋光度。UV采用Waters HPLC系统的2996PDA检测器记录。¹H ¹³C和2DNMR谱图采用Varian Mercury 300MHz NMR质谱仪记录。将化合物溶解于CD₃OD或CDCl₃(3-10mg/ml)中，并在室温22℃下获得全部谱图。以溶剂峰作为基准，将化学位移记录为ppm(对于CD₃OD，¹H化学位移为3.31ppm和¹³C化学位移为49.05ppm，对于CDCl₃，¹H化学位移为7.19为ppm，¹³C化学位移为77.0ppm)。根据样品性质，用三种不同的离子源ESI、MALDI和CI来测定HR-MS谱图。对于ESI HR-MS，使用Applied Biosystem的配备涡轮式离子喷雾源(turbo-ion spray source)的QSTAR XLM^TM，N₂作为帘气，与0.1％甲酸混合的MeCH₃/H₂O(1∶1)作为溶剂。室温下使用正和负离子模式获得以[M+H]⁺/[M+Na]⁺或[M-H]^-表示的质谱。利用CHCA作为基质，通过MALDI微MX^TM(Waters micromas)获得MALDI-TOF谱图。对于CI谱图，在压力1.5x10^-4torr下以CH₄作为载气，采用Waters micromass的GCTPremier。ESI-MS谱图采用Finnigan MAT LCQ在鞘气60psi，辅助气20psi，喷雾电压4.5kV和毛细管电压30V下获得。

柱层析采用大孔树脂D101(Tianjin Le Tai Chemical Ltd.，China)、硅胶(40-63μm，Merck，Darmstadt，Germany)、Sephadex LH-20(40-70μm，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)和LiChroprep RP-C18凝胶(40-63μm，Merck，Darmstadt，Germany)进行。制备反相HPLC在配备2996光电二极管阵列检测器的Waters 2545二元梯度模块泵系统上，利用X-bridge ODS柱(19x150mm，内径5μm Waters)和Nova-Pak C-18柱(19x300mm，内径6μm，Waters)进行。半制备HPLC采用相同的Waters系统和Nova-Pak C-18柱(7.8x300mm，内径6μm，Waters)进行。

得到的化合物GAG-C13为淡黄色油状，旋光度为[α]_D+1.5(C＝0.4，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)259nm处。根据正离子HR MALDI-MS的m/z[M+Na]⁺353.1380和[M+H-H₂O]⁺313.1190处的分子离子测得GAG-C13的分子式为C₁₉H₂₂O₅。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C13为3，4，7-三羟基-3′-甲氧基-(7′E)-(8-O-4’)-新木脂素-7’-烯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.98(1H，d，1.8，H-2)，6.73(1H，d，8.1，H-5)，6.81(1H，d，1.8，H-6)，6.84，6.85(2H，d，1.2，6.6，H-2’5’)，6.70(1H，dd，2.1，8.1，H-6’)，6.26(1H，dd，1.5，15.6，H-7’)，6.07(1H，m，H-8’)，4.61(1H，d，6.6，H-7)，4.24(1H，m，H-8)，3.83(3H，s，OCH₃-3’)，1.14(3H，d，6.2，CH₃-9)，1.82(3H，d，6.6，CH₃-9’)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.1(C-3)，148.8(C-3′)，146.3(C-4)147.2(C-4′)，133.9(C-1)，134.2(C-1′)，120.9(C-6)，118.0(C-6′)，115.8(C-5)，118.5(C-5′)，111.4(C-2)，113.9(C-2′)，131.7(C-7′)，124.5(C-8′)，78.5(C-7)，82.5(C-8)，17.2(C-9)，18.5(C-9′)，56.3(OCH₃-3’)。

得到的化合物GAG-C51为粘性油状，旋光度为[α]_D+2.3(C＝0.94，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)346和231nm处。根据正离子HR ESI-MS的m/z[M+H]⁺ 315.1241处的分子离子测得GAG-C51的分子式为C₁₈H₁₈O₅。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C51的结构为3-甲氧基-4，4′-二羟基-1′-乙酮-3′7-环氧基-8，2′-新木脂素。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.86(1H，H-2)，6.74(2H，H-5，6)，6.84(1H，d，8.7，H-5’)，6.70(1H，d，8.7，H-6’)，2.59(3H，CH₃-8’)，5.14(1H，d，4.5，H-7)，3.69(1H，H-8)，3.79(3H，s，OCH₃-3)，1.30(3H，d，6.9，CH₃-9)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：147.3(C-3)，149.0(C-4)，153.6(C-3′)，153.4(C-4′)，134.5(C-1)，119.3(C-6)，116.0(C-5)，110.1(C-2)，120.8(C-1′)，132.4(C-2′)，117.4(C-6′)，115.0(C-5′)，204.8(C-7′)，32.1(C-8′)，92.6(C-7)，47.3(C-8)，20.7(C-9)，56.4(OCH₃-3)。

得到的化合物GAG-C58为粘性油状，旋光度为[α]_D+24.6(C＝0.38，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)258nm处。根据正离子HR ESI-MS的m/z[M+Na]⁺383.1478和[M+H-H₂O]⁺ 343.1551处的分子离子测得GAG-C58的分子式为C₂₀H₂₄O₆。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C58为3，3′-二甲氧基-4，5，7-三羟基-(7′E)-(8-O-4′)-新木脂素-7′-烯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.84(1H，d，1.8，H-2)，6.72(1H，d，1.8，H-6)，6.70(1H，d，1.8，H-2’)，6.83(1H，d，8.4，H-5’)，6.69(1H，dd，1.8，8.4，H-6′)，6.27(1H，dd，1.2，15.6，H-7’)，6.09(1H，m，H-8’)，4.62(1H，d，6.3，H-7)，4.28(1H，m，H-8)，3.82(6H，s，OCH₃-3，3’)，1.17(3H，d，6.3，CH₃-9)，1.82(3H，dd，1.2，6.6，CH₃-9’)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.0(C-3)，149.1(C-3′，C-5)146.2(C-4′)，133.2(C-1)，134.2(C-1′)，136.2(C-4)，118.6(C-6′)，117.8(C-5′)，113.9(C-2′)，105.6(C-2)，105.7(C-6)，131.8(C-7′)，124.5(C-8′)，78.6(C-7)，82.2(C-8)，17.2(C-9)，18.6(C-9′)，56.8(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C59为粘性油状，旋光度为[α]_D-5.3(C＝0.34，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)260nm处。ESI-MS谱图对于正离子模式在m/z[M+Na]⁺413.11处显示分子离子，而对于负离子模式在[M-H]^- 389.07处显示分子离子。然而，HR MALDI-MS质谱在m/z373.1660处显示最大丰度的离子，相当于[M+H-H₂O]⁺。还观测到[M+H]⁺ 391.1743和[M+Na]⁺ 413.1576的分子离子，但是强度分别为25％和30％。因此，根据以上信息推断GAG-C59的分子式为C₂₁H₂₆O₇。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C59的结构为4，5′，7-三羟基-3，3′，5-三甲氧基-羟基-(7′E)-(8-O-4′)-新木脂素-7′-烯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.67(2H，s，H-2，6)，6.50(1H，dd，2.0，6.5，H-2’)，6.51(1H，dd，2.0，6.5，H-6′)，6.27(1H，dd，1.5，15.5，H-7’)，6.16(1H，m，H-8’)，4.58(1H，d，6.3，H-7)，3.98(1H，m，H-8)，3.80(3H，s，OCH₃-5)，3.83(6H，s OCH₃-3，3’)，1.13(3H，d，6.3，CH₃-9)，1.84(3H，dd，1.5，6.5，CH₃-9’)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：152.1(C-5′)，154.7(C-3′)，149.2(C-3，5)，133.2(C-1)，135.8(C-5)，135.9(C-4′)，132.3(C-1′)，105.5(C-2，6)，102.6(C-2′)，107.9(C-6′)，132.2(C-7′)，125.6(C-8′)，79.9(C-7)，86.7(C-8)，17.9(C-9)，18.5(C-9′)，56.3(OCH₃-5)，56.8(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C69为淡黄色油状，旋光度为[α]_D-12.7(C＝0.3，MeOH)；UV吸收在λ_最大(CH₃CN)261nm处。根据正离子HR MALDI-MS的m/z[M+H]⁺313.1408处的分子离子测得GAG-C69的分子式为C₁₉H₂₀O₄。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C69为3-甲氧基-4-羟基-(7′E)-5′7-环氧基-8，4′-氧化新木脂素-7′-烯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.96(1H，d，1.5，H-2)，6.87(1H，d，1.8，H-6’)，6.82(1H，d，1.8，H-2′)，6.83(1H，H-3′)，6.76(1H，d，8.4，H-5)，6.84(1H，m，H-6)，6.28(1H，dd，1.5，15.9，H-7’)，6.10(1H，m，H-8’)，4.54(1H，d，8.1，H-7)，4.11(1H，dd，6.6，8.1，H-8)，3.87(3H，s，OCH₃-3)，1.13(3H，d，6.3，CH₃-9)，1.82(3H，dd，1.5，6.3，CH₃-9’)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：148.3(C-4)，149.2(C-3)，145.5(C-4′)，144.0(C-5′)，133.0(C-1)，130.1(C-1′)，111.9(C-2)，117.7(C-5)，121.8(C-6)，116.2(C-3′)，120.2(C-2′)，114.9(C-6′)，131.8(C-7′)，124.4(C-8′)，82.3(C-7)，75.5(C-8)，17.6(C-9)，18.5(C-9′)，56.5(OCH₃-3)。

得到的化合物GAG-C76为淡黄色油状，旋光度为[α]_D+14.6(C＝0.82，MeOH)；UV吸收在λ_最大(CH₃CN)220和278nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺409.1627处的分子离子测得GAG-C76的分子式为C₂₂H₂₆O₆。HRMS谱图在m/z 357.1358[M+Na-29]⁺和341.1415[M+Na-45]⁺处显示离子峰，对应于分别从母体分子失去乙基(-CH₂CH₃)和羟乙基(-OCH₂CH₃)部分。因此，根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C76的结构为4，9-二羟基-9’-羟乙基-3，5’-二甲氧基-(7′E)-4′7-环氧基-8，3′-新木脂素-7’-烯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.94(1H，d，1.5，H-2)，6.77(1H，d，8.1，H-5)，6.82(1H，dd，1.5，8.1，H-6)，6.96(1H，d，1.8，H-2’)，6.93(1H，d，1.8，H-6’)，6.54(1H，d，15.9，H-7’)，6.17(1H，dtt，15.9，6.0，6.3，H-8’)，5.51(1H，d，6.3，H-7)，3.49(1H，m，H-8)，3.75，3.82(2H，m，H-9)，4.08(2H，dd，1.5，6.3，H-9’)，3.79，3.85(6H，s，OCH₃-3，3’)，3.54(2H，q，6.9，OCH₂-)，1.20(3H，t，6.9，CH₃-9)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.1(C-3)，149.3(C-4′)，147.5(C-4)，145.4(C-5′)，130.4(C-3’)，134.4(C-1)，134.1(C-1′)，119.8(C-6)，116.2(C-2′)，116.6(C-5)，110.5(C-2)，112.1(C-6′)，132.3(C-7′)，124.6(C-8′)，89.3(C-7)，55.1(C-8)，64.8(C-9)，72.4(C-9′)，66.4(OCH₂-)，15.5(-CH₃)，56.7，56.4(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C78为淡黄色粘胶状，旋光度为[α]_D+5.8(C＝0.2，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)267nm处。根据m/z 315.2147([M+H]⁺，计算为314.2093)处的HR ESI-MS峰测得GAG-C78的分子式为C₁₇H₃₀O₅。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C78的结构为(E)-甲基15-羟基-15-甲氧基-12-氧代十五碳烯酸-13-酯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：2.32(2H，m，H-2)，1.60(4H，m，H-3，H-10)，1.29(12H，m，H-4 to H-9)，2.65(2H，t，H-11)，6.34(1H，d，H-13)，6.62(1H，dd，H-14)，4.97(1H，d，H-15)，3.34(3H，s，OCH₃-15)，3.65(3H，s，OCH₃-1)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：175.9(C-1)，34.8(C-2)，26.0(C-3)，30.1(C-4 to C-9)，25.1(C-10)，41.3(C-11)，202.7(C-12)，132.5(C-13)，141.7(C-14)，102.6(C-15)，53.6(OCH₃-15)，52.0(OCH₃-1)。

得到的化合物GAG-C80为淡黄色粘胶状，旋光度为[α]_D+11.1(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)236和186nm处。根据m/z 325.1441([M+Na]⁺，计算为302.1518)处的HR ESI-MS峰测得GAG-C80的分子式为C₁₈H₂₂O₄。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C80为2-(2-甲氧基-5-甲苯基)-1-(3-甲氧基-5-甲苯基)-乙烷-1，2-二醇。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：2.09(3H，s，H-7’)，2.40(3H，s，H-7”)，4.08(1H，d，H-1)，3.81(1H，d，H-2)，3.66(3H，s，H-8’)，3.85(3H，s，H-8”)，6.65(1H，d，H-3’)，6.94(1H，d，H-4’)，7.38(1H，H-6’)，7.03(1H，s，H-2”)，6.64(1H，H-4”)，6.76(1H，d，H-6”)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：70.9(C-1)，79.4(C-2)，128.9(C-1’)，148.8(C-2’)，106.5(C-3’)，116.6(C-4’)，134.2(C-5’)，126.8(C-6’)，131.5(C-1”)，110.4(C-2”)，148.6(C-3”)，124.3(C-4”)，138.5(C-5”)，115.1(C-6”)，56.7(OCH₃-8”)，55.9(OCH₃-8’)，21.2(C-7”)，17.9(C-7’)。

得到的化合物GAG-C61为淡黄色粘胶状，旋光度为[α]_D+7.9(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)269nm处。根据m/z 493.1872([M+H]⁺，计算为492.1784)处的HR MALDI-MS峰测得GAG-C61的分子式为C₂₈H₂₈O₈。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C61的结构为4-羟基-3′-甲氧基-(7′E)-5′7-环氧基-8，4′-氧化新木脂素-7′-烯。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.94(1H，H-2)，6.79(1H，H-5)，6.50(1H，d，H-3’)，7.74(1H，d，H-4’)，6.77(1H，H-2”)，6.69，6.73(2H，H-5”，6”)，3.32(1H，H-7)，2.42(1H，H-8)，2.80，2.87(2H，H-9)，2.84(1H，H-7’)，2.75，(1H，H-8’)，3.96，4.13(2H，H-9’)，2.71(3H，s，CH₃)，3.78，3.84(6H，s，OCH₃-3，3”)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：129.8(C-1)，109.6(C-2)，149.3(C-3)，148.7(C-4)，116.8(C-5)，133.0(C-6)，113.6(C-1’)，162.1(C-2’)，115.2(C-3’)，132.5(C-4’)，108.5(C-5’)，164.3(C-6’)，132.8(C-1”)，116.3(C-2”)，149.6(C-3”)，146.6(C-4”)，122.7(C-5”)，120.1(C-6”)，80.6(C-7)，43.6(C-8)，39.5(C-9)，41.7(C-7′)，55.3(C-8′)，74.1(C-9′)，205.3(C＝O)，27.6(CH₃)，56.9，56.8(OCH₃-3，3”)。

得到的化合物GAG-C62为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D+49.1(C＝0.0.37，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)286和224nm处。根据正离子HR ESI-MS的m/z[M+H⁺] 313.1852处的分子离子测得GAG-C62的分子式为C₂₀H₂₄O₃。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS鉴定GAG-C62的结构为4，6，15-三烯-16-羧酸-3-氧代-雄甾烷。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：5.66(1H，H-4)，6.21(1H，H-6)，6.27(1H，H-7)，6.77(1H，H-15)，1.72，2.05(2H，H-1)，2.37，2.62(2H，H-2)，1.33(1H，H-8)，2.49(1H，H-9)，1.43，1.67(2H，H-11)，1.57，2.33(2H，H-12)，1.64(1H，H-14)，2.24，2.47(2H，H-17)，1.02(3H，s，CH₃-18)，1.18(3H，s，CH₃-19)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：202.2(C-3)，168.1(C-20)，123.9(C-4)，167.1(C-5)，129.0(C-6)，142.7(C-7)，144.1(C-15)，148.6(C-16)，34.8(C-1)，34.9(C-2)，52.7(C-8)，37.63(C-9)，37.59(C-10)，21.7(C-11)，35.9(C-12)，47.7(C-13)，55.4(C-14)，32.2(C-17)，16.4(C-18)，16.6(C-19)。

得到的化合物GAG-C63为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D +50.5(C＝0.22，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)287nm处。根据正离子HRESI-MS的m/z [M+H]⁺ 315.1994处的分子离子测得GAG-C63的分子式为C₂₀H₂₆O₃。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS鉴定GAG-C63的结构为4，6-二烯-16-羧酸-3-氧代-雄甾烷。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：5.65(1H，H-4)，6.18(1H，H-6)，6.24(1H，H-7)，1.74，2.07(2H，H-1)，2.38，2.63(2H，H-2)，1.28(1H，H-8)，1.34(1H，H-9)，1.49，1.64(2H，H-11)，1.35，1.87(2H，H-12)，1.37(1H，H-14)，1.94，2.13(2H，H-15)，2.42(1H，H-16)，2.12，2.28(2H，H-17)，0.82(3H，s，CH₃-18)，1.16(3H，s，CH₃-19)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：202.6(C-3)，177.2(C-20)，124.1(C-4)，167.4(C-5)，129.1(C-6)，143.3(C-7)，34.9(C-1)，35.2(C-2)，52.4(C-8)，39.4(C-9)，37.6(C-10)，21.8(C-11)，25.1(C-12)，45.8(C-13)，54.5(C-14)，24.9(C-15)，56.4(C-16)，39.5(C-17)，13.8(C-18)，16.8(C-19)。

得到的化合物GAG-C65为晶体，旋光度为[α]_D-94.3(C＝0.67，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)214nm处。根据正离子HR ESI-MS的m/z[M+H]⁺ 249.1537处的分子离子测得GAG-C65的分子式为C₁₅H₂₀O₃。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS鉴定GAG-C63的结构为8-氧代草烷(oxohumula)-2，6(E)-二烯-1，12-内酯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：]：4.73(1H，H-1)，7.10(1H，H-2)，6.27(1H，H-6)，6.00(1H，H-7)，2.72(1H，H-9)，1.73，1.87(2H，H-4)，2.46，1.82(2H，H-5)，1.78，0.56(2H，H-10)，0.96(3H，s，CH₃-13)，1.24(3H，s，CH₃-14)，1.38(3H，CH₃-15)。

¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：88.1(C-1)，148.5(C-2)，135.4(C-3)，144.6(C-6)，133.3(C-7)，204.7(C-8)，174.5(C-12)，42.27(C-11)，46.6(C-9)，29.8(C-4)，26.1(C-5)，21.3(C-10)，12.5(C-13)，22.2(C-14)，24.8(C-15)。

得到的化合物GAG-C73为无定形粉末，旋光度为[α]_D+21(C＝0.2，CHCl₃)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)201和278nm处。根据负离子ESI-MS的m/z[M-H]^-469.65处的分子离子测得GAG-C73的分子式为C₃₀H₄₆O₄。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C73的结构为3，23-二羟基-12(13)-烯-20(29)-羽扇烯-28-酸。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃，ppm)[δ]：1.88，1.68(2H，H-1)，1.62，1.25(2H，H-2)，3.65(1H，H-3)，0.89(1H，H-5)，1.37(2H，H-6)，1.49，1.31(2H，H-7)，1.55(1H，H-9)，1.94(2H，H-11)，5.29(1H，H-12)，1.87，1.15(2H，H-15)，2.20，1.78(2H，H-16)，2.30(1H，H-18)，2.34(1H，H-19)，1.3(2H，H-21)，2.28，2.23(2H，H-22)，3.43，3.73(2H，H-23)，0.89(3H，s，CH₃-24)，0.80(3H，s，CH₃-25)，0.88(3H，s，CH₃-26)，1.14(3H，s，CH₃-27)，4.64，4.70(2H，H-29)，0.99(3H，s，CH₃-30)。

¹³C-NMR(75MHz，CDCl₃，ppm)[δ]：38.3(C-1)，26.8(C-2)，77.1(C-3)，42.1(C-4)，49.8(C-5)，18.4(C-6)，32.6(C-7)，39.4(C-8)，47.6(C-9)，36.9(C-10)，23.5(C-11)，126.1(C-12)，137.6(C-13)，38.8(C-14)，27.8(C-15)，24.3(C-16)，50.9(C-17)，54.6(C-18)，37.3(C-19)，152.6(C-20)，22.7(C-21)，32.6(C-22)，72.2(C-23)，11.4(C-24)，17.1(C-25)，15.8(C-26)，123.3(C-27)，174.3(C-28)，104.9(C-29)，16.1(C-30)。

得到的活性神经保护化合物GAG-C27和GAG-C28为白色无定形粉末。GAG-C27具有旋光度[α]_D-22.5(C＝0.41，MeOH)，UV吸收在λ_最大(CH₃CN)276和220nm处。GAG-C28具有旋光度[α]_D-18.2(C＝0.34，MeOH)，UV吸收在λ_最大(CH₃CN)286和218nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 849.4635处的分子离子测得GAG-C27和GAG-C28的分子式均为C₄₅H₆₂O₁₄。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS鉴定GAG-C27和GAG-C28的结构分别为3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-12-顺式-肉桂基-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元和3-O-β-D-磁麻吡喃糖-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-12-反式-肉桂基-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元。两种化合物之间的区别是，GAG-C27的糖苷配基的C-12被顺式肉桂酸取代，而GAG-C28的C-12被反式肉桂酸取代。

将GAG-C27和GAG-C28的质子和碳信号与低聚糖取代C-3的乳突果苷元部分得到的数据(Tripetch Kanchanapoom，etc.，Chem.Pharm.Bull.50(8)1031-1034，2002)进行比较，表明GAG-C27和GAG-C28都是在C-3用二糖取代的乳突果苷元。

在GAG-C27/GAG-C28的NMR谱图中均观测到了对应于磁麻糖和洋地黄毒糖的两个异头信号。对GAG-C27进行ESI-MS/MS分析，发现糖链部分或完全损失。m/z 557.12和701.23处观测到的离子分别对应于糖苷配基[M-18+Na]⁺离子和相同的但仍带有一个磁麻吡喃糖单元[M-18+Na]⁺的物质。随后可获得糖链的顺序，其是由m/z 849.46处的分子离子[M+Na]⁺失去一个洋地黄毒糖(130Da)和水(18Da)及进一步失去磁麻糖(144Da)后分别得到的在m/z 701.23和m/z 557.12处的离子。获自不同的1D和2D谱图的NMR数据也支持了这一点。从HMBC谱图中观测到的3.26(H-3)和97.2(Cym的C-1)之间的交错峰表明磁麻糖和乳突果苷元的C-3之间以糖苷键连接。根据Cym H-4(δ3.22)和Dig C-1(δ102.2)之间以及Cym C-4(δ83.5)和Dig异头质子(δ4.65)之间的HMBC相关性确定Cym第4位上的洋地黄毒糖连接。

根据Cym和Dig异头质子在9.5Hz的³J_H-1，H-2值确定磁麻吡喃糖苷和洋地黄毒吡喃糖苷的异头构型为β型。确定绝对构型与以前报道的构型相同，为D-磁麻糖和D-洋地黄毒糖。化合物GAG-C27和GAG-C28的¹H和¹³C NMR信号列于表12中。

表12.化合物GAG-C27和GAG-C28的¹H和¹³C NMR化学位移

得到的化合物GAG-C30为无定形白色粉末，旋光度为[α]_D+2.7(C＝0.2，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)227和218nm处。根据正离子HR MALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 705.4148处的分子离子测得GAG-C30的分子式为C₃₈H₅₁O₁₁。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS鉴定GAG-C30为3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-12-反式-肉桂基-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元。

GAG-C30的¹H NMR谱图表明，仅有一个对应于洋地黄毒糖的异头信号(δ¹H 4.93，¹³C 97.2ppm)。根据异头质子在9.5Hz的³J_H-1，H-2值，确定洋地黄毒糖的异头构型为β型。根据糖苷配基H-3/C-3(δ3.24/83.1)和Dig C-1/H-1(δ97.2/4.93)的HMBC相关性可知，洋地黄毒吡喃糖苷在第3位糖苷配基上被取代。GAG-C30的ESI-MS/MS分析在m/z 557.11处产生了子体离子[M+Na]⁺，其对应于从母体离子失去一个Dig(130Da)和H₂O(18Da)，这由洋地黄毒糖的连接位置证实。

化合物GAG-C30的¹H和¹³C NMR信号列于表13。

表13.化合物GAG-C30的¹H和¹³C NMR化学位移

得到的化合物GAG-C44为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-20.1(C＝0.2，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)273nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 993.5052处的分子离子(计算为970.4926)测得GAG-C44的分子式为C₅₂H₇₄O₁₇。根据IUPAC命名法，通过不同的1D和2D NMR谱和HR-MS质谱鉴定GAG-C44的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。

GAG-C44的¹H NMR谱图表明，有对应于磁麻糖(δ¹H，4.93，¹³C 97.2ppm)、洋地黄毒糖(δ¹H，4.93，¹³C 97.2ppm)和夹竹桃糖(δ¹H，4.93，¹³C 97.2ppm)的3个异头信号。根据异头质子在9.5Hz的³J_H-1，H-2值，确定这三种单糖的异头构型为β型。根据从2D COSY、HSQC和HMBC谱图观测到的H-H和C-H相关性建立三糖的糖苷位置和顺序。化合物GAG-C44的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表16。

得到的化合物GAG-C45为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-22.0(C＝0.15，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)273nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1137.6625处的分子离子(计算为1114.5713)测得GAG-C45的分子式为C₅₉H₈₆O₂₀。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR谱和HR-MS质谱鉴定GAG-C45的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-O-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。化合物GAG-C45的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表16中。

得到的化合物GAG-C89为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-20.8(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)283nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 863.4650处的分子离子(计算为863.4296)测得GAG-C89的分子式为C₄₆H₆₄O₁₄。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2DNMR和MS鉴定GAG-C89的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。化合物GAG-C89的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表16中。

得到的化合物GAG-C90为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-22.3(C＝0.12，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)282nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1007.5393和[M+K]⁺ 1023.5203处的分子离子(计算为984.5083)测得GAG-C90的分子式为C₅₃H₇₆O₁₇。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C90的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。化合物GAG-C90的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表16中。

得到的化合物GAG-C94为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-16.9(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)282nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1007.5579处的分子离子(计算为984.5083)测得GAG-C94的分子式为C₆₀H₈₈O₂₀。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C94的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。化合物GAG-C94的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表16中。

得到的化合物GAG-C95为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D+5.9(C＝0.15，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)281nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1281.7705处的分子离子(计算为1258.6499)测得GAG-C95的分子式为C₆₆H₉₈O₂₃。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C95的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。化合物GAG-C95的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表16中。

得到的化合物GAG-C96为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D +26.5(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)279nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1151.6057处的分子离子(计算为1128.5869)测得GAG-C96的分子式为C₆₀H₈₈O₂₀。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C96的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。化合物GAG-C96的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表16中。

得到的化合物GAG-C104为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-23.1(C＝0.15，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)271nm处。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1281.62处的分子离子测得GAG-C104的分子式为C₆₆H₉₈O₂₃。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C104的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。化合物GAG-C104的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表16中。

得到的化合物GAG-C86为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D+10.1(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)280nm处。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 967.52和[2M+Na]⁺ 1912.43处的分子离子(计算为944.5133)测得GAG-C86的分子式为C₅₁H₇₆O₁₆。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C86的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。化合物GAG-C86的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表17中。

得到的化合物GAG-C87为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D+25.0(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)281nm处。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 965.53和[2M+Na]⁺ 1907.26处的分子离子(计算为942.4977)测得GAG-C87的分子式为C₅₁H₇₄O₁₆。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C87的结构为伊克马苷元(Ikemagenin)3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。化合物GAG-C87的¹H和¹³C NMR信号列于表15和表17中。

得到的化合物GAG-C99为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D+18.1(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)280nm处。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 809.41处的分子离子(计算为786.4190)测得GAG-C99的分子式为C₄₃H₆₂O₁₃。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C99的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖苷。化合物GAG-C99的¹H和13CNMR信号列于表15和表17中。

得到的化合物GAG-C91为白色无定形粉末，UV吸收在λ_最大(CH₃CN)281nm处。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1089.71处的分子离子测得GAG-C91的分子式为C₅₆H₉₀O₁₉。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2DNMR和MS数据并与以前报道的数据(Tsukamoto Sachiko；etc.；Tetrahedron 1985，41(5)，927-34)相比，鉴定GAG-C91的结构为告达亭苷元(Caudatin)3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷(隔山消苷(Wilfoside)C1N)。GAG-C91糖部分的¹H和¹³C NMR信号列于表14中。化合物GAG-C91为：

得到的化合物GAG-C92为白色无定形粉末，UV吸收在λ_最大(CH₃CN)281nm处。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1089.71处的分子离子测得GAG-C92的分子式为C₅₆H₉₀O₁₉。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2DNMR和MS数据并与以前报道的数据(Tsukamoto Sachiko；etc.；Chem.Pharm.Bull.1985，33(6)，2294-2304)相比，鉴定GAG-C92的结构为告达亭苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。GAG-C92糖部分的¹H和¹³CNMR信号列于表14中。化合物GAG-C92为：

表14.化合物GAG-C91和GAG-C92的糖部分的¹H和¹³C NMR化学位移

表15.化合物GAG-C44、GAG-C45、GAG-C89、GAG-C90、GAG-C94、GAG-C95、GAG-C96、GAG-C104、GAG-C86、GAG-C87及GAG-C99的糖苷配基部分的¹³C NMR化学位移

表16.化合物GAG-C44、GAG-C45、GAG-C89、GAG-C90、GAG-C94、GAG-C95、GAG-96及GAG-C104的糖部分的¹³C NMR化学位移

表17.化合物GAG-C86、GAG-C87及GAG-C99的糖部分的¹H和¹³C NMR化学位移

得到的化合物GAG-C43为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D+12.9(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)281nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 953.4889处的分子离子(计算为930.4977)测得GAG-C43的分子式为C₅₀H₇₄O₁₆。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2DNMR和MS鉴定GAG-C43的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖苷。化合物GAG-C43的¹H和¹³C NMR信号列于表18和表19中。

得到的化合物GAG-C46为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-11.6(C＝0.18，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)274nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 993.5181处的分子离子测得GAG-C46的分子式为C₅₂H₇₄O₁₇。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C46的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。化合物GAG-C46的¹H和¹³C NMR信号列于表18和表19中。

得到的化合物GAG-C47为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-15.1(C＝0.1，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)274nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 993.4927处的分子离子测得GAG-C47的分子式为C₅₂H₇₄O₁₇。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2D NMR和MS鉴定GAG-C47的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖苷。化合物GAG-C47的¹H和¹³C NMR信号列于表18和表19中。

得到的化合物GAG-C102为白色无定形粉末，旋光度为[α]_D-8.2(C＝0.2，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)275nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 1137.68处的分子离子(计算为1114.5713)测得GAG-C102的分子式为C₅₉H₈₆O₂₀。根据IUPAC命名法，通过不同1D，2DNMR和MS鉴定GAG-C102的结构为12-O-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-洋地黄毒吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖基-(1→4)-β-D-夹竹桃吡喃糖苷。化合物GAG-C102的¹H 和¹³C NMR信号列于表18和表19中。

表18.化合物GAG-C46、GAG-C47、GAG-C102及GAG-C43的糖苷配基部分的¹³C NMR化学位移

  位置  GAG-C46  GAG-C47  GAG-C102  GAG-C43  1  41.79  41.80  41.78  38.9  2  30.15  30.15  30.21  30.7  3  73.37  73.3  73.80  79.4  4  43.99  44.01  44.05  37.5  5  142.71  142.55  142.88  140.0  6  118.69  119.34  119.55  119.9  7  29.95  29.99  30.00  30.1  8  211.83/211.76  211.37/211.31  211.45  75.6  9  56.71  56.74  56.75  44.8  10  37.51  37.50  37.66  38.0  11  26.48/26.07  26.2  26.35  26.0  12  76.97  76.9  76.87  77.0  13  63.26/62.93  63.22/62.89  63.33  57.4  14  220.13/219.81  219.63  219.72  89.2  15  39.74  38.88  39.85  39.8  16  34.34  34.41  34.24  33.6  17  83.12  83.07  83.12  89.3

  位置  GAG-C46  GAG-C47  GAG-C102  GAG-C43  18  12.25/11.83  11.9  12.22  11.2  19  19.13  19.15  19.16  18.3  20  75.19  74.40  75.34  75.0  21  14.38  14.48  14.41  18.5  Cin-1’  168.82/167.81  168.56/167.54  168.5/167.6  2’  120.72  120.6  120.3  3’  146.93/145.13  146.68/144.91  146.6  4’  136.36/135.60  136.20/135.44  136.2  5’  129.16  129.29  129.1  6’  130.25  130.67  130.0  7’  130.81  131.60  130.6  8’  130.11  130.07  130.1  9’  129.45  129.94  129.4  Ac.，CO  171.89/171.72  171.57/171.41  CH₃  21.43  21.47

表19.化合物GAG-C46、GAG-C47、GAG-C102及GAG-C43的糖部分的¹H和¹³C NMR化学位移

从乳突果精制级分分离的聚氧孕烷糖苷是使第3位的糖苷配基由β-D-磁麻糖开始的不同低聚糖糖基化，这得到Cym-1(δ4.90～4.95ppm)和C-3糖苷配基(对于乳突果苷元，δ73.2ppm；对于本波苷元和伊克马苷元，δ79.3ppm)之间的HMBC谱图交叉峰的支持。NMR数据表明，所有化合物含有比率不同的顺式-(δ5.80和7.05，d，J＝16Hz)和反式-(δ6.34和7.55，d，J＝12.8Hz)肉桂酸酯。基于HMBC谱图的C-H相关性，所有化合物的肉桂酸酯连接在第12位的糖苷配基(δ5.1～5.2ppm/δ167.5～168.9ppm)处被取代。顺式或反式化合物的化学位移值表明，糖苷配基的某些位置(表12至表19)的¹H信号达到0.1ppm的差异，而¹³C信号达到2ppm的差异。

通过将其¹H和¹³C NMR化学位移与已公开的乳突果苷元部分的NMR数据(Mu，Quanzhang，etc.，Planta Med.，58(2)，200-4(English)1992)进行比较，将通过酸分析化合物GAG-C44、GAG-C45、GAG-C46、GAG-C47、GAG-C89、GAG-C90、GAG-C94、GAG-C95、GAG-96、GAG-C102及GAG-C104所得到的糖苷配基鉴定为乳突果苷元，即12-顺式/反式-肉桂酰-20-乙酰基-8，14-seco-肉珊瑚苷元。

将通过酸分析化合物GAG-C43、C86和C99所得到的糖苷配基确定为12-肉桂酰肉珊瑚苷元(本波苷元)，这通过将它们的NMR数据与已报道的本波苷元的NMR数据进行比较来证实。通过将其NMR数据与文献中的数据进行比较，表明通过酸分析GAG-C87所得到的糖苷配基为开德苷元(kidjolanin)。将通过酸分析GAG-C91和C92所得到的糖苷配基确定为12-牛皮消酰肉珊瑚苷元(告达亭苷元)，这通过将它们的NMR数据与已报道的告达亭苷元的NMR数据进行比较来证实。

在¹H NMR谱图中观测到三个糖单元——磁麻糖，夹竹桃糖和洋地黄毒糖。根据异头质子在9.5Hz的³J_H-1，H-2值，确定三个糖部分的异头构型为β型。确定绝对构型与以前报道的构型相同，为D-磁麻糖，D-夹竹桃糖和D-洋地黄毒糖。

得到的化合物GAG-C114为淡黄色油状，旋光度为[α]_D+2.4(C＝0.63，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)220和278nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+Na]⁺ 353.1369和[M+H-H₂O]⁺ 313.1455处的分子离子测得GAG-C114的分子式为C₁₉H₂₂O₅。根据IUPAC命名法，测得GAG-C114的结构为3-甲氧基-3′，4，7-三羟基-(7′E)-(8-O-4’)-新木脂素-7′-烯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.96(1H，d，1.5，H-2)，6.76(1H，d，8.4，H-5)，6.77(1H，m，H-6)，6.87(1H，d，1.2，H-2’)，6.76(1H，H-5’)，6.66(1H，d，8.1，H-6’)，6.18(1H，d，15.6，H-7’)，6.00(1H，m，H-8’)，4.59(1H，d，6.3，H-7)，4.21(1H，m，H-8)，3.72(3H，s，OCH₃-3)，1.09(3H，d，6.0，CH₃-9)，1.72(3H，d，6.3，CH₃-9’)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：148.8(C-3)，148.6(C-4′)，145.9(C-4)146.9(C-3′)，133.8(C-1)，134.0(C-1′)，120.8(C-6)，118.8(C-6′)，115.9(C-5)，115.8(C-5′)，111.2(C-2)，113.9(C-2′)，131.6(C-7′)，124.7(C-8′)，78.3(C-7)，82.1(C-8)，17.1(C-9)，18.5(C-9′)，56.2(OCH₃-3)。

得到的化合物GAG-C109为淡黄色油状，旋光度为[α]_D-12.7(C＝0.3，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)220和278nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+H]⁺ 331.1190处的分子离子测得GAG-C109的分子式为C₁₈H₁₈O₆。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C109的结构为3-甲氧基1-4，4′，5-三羟基-1′-乙酮-3′7-环氧基-8，2′-新木脂素。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：]：6.46(1H，d，1.5，H-2)，6.44(1H，d，1.5，H-6)，6.86(1H，d，8.7，H-5’)，6.73(1H，d，8.7，H-6’)，2.60(3H，s，CH₃-8’)，5.08(1H，d，4.6，H-7)，3.68(1H，dd，H-8)，3.79(3H，s，OCH₃-3)，1.30(3H，d，6.9，CH₃-9)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.5(C-3)，146.6(C-5)，134.0(C-4)，153.8(C-3′)，153.6(C-4′)，135.0(C-1)，107.1(C-6)，102.1(C-2)，123.8(C-1′)，132.6(C-2′)，117.6(C-6′)，115.3(C-5′)，205.2(C-7′)，32.1(C-8′)，92.8(C-7)，47.4(C-8)，20.9(C-9)，56.6(OCH₃-3)。

得到的化合物GAG-C116为淡黄色油状，旋光度为[α]_D-12.7(C＝0.3，MeOH)。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)220和278nm处。根据正离子HRMALDI-MS的m/z[M+H]⁺ 345.1340和[M+Na]⁺ 367.1162处的分子离子测得GAG-C116的分子式为C₁₉H₂₀O₆。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C116的结构为3，5-二甲氧基1-4，4′-二羟基-1′-乙酮-3′7-环氧基-8，2′-新木脂素。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：]：6.59(2H，H-2，6)，6.87(1H，d，8.7，H-5’)，6.74(1H，d，8.7，H-6’)，2.60(3H，s，CH₃-8’)，5.15(1H，d，4.5，H-7)，3.68(1H，H-8)，3.78(6H，s，OCH₃-3，5)，1.30(3H，d，6.9，CH₃-9)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.3(C-3，5)，133.8(C-4)，153.6(C-3′)，153.5(C-4′)，132.5(C-1)，103.8(C-6)，103.9(C-2)，120.8(C-1′)，132.4(C-2′)，117.6(C-6′)，115.1(C-5′)，205.3(C-7′)，32.2(C-8′)，92.9(C-7)，47.4(C-8)，20.9(C-9)，56.7(OCH₃-3，5)。

得到的化合物GAG-C113为白色无定形粉末，UV吸收在λ_最大(CH₃CN)202和274nm处。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺479.52处的分子离子测得GAG-C113的分子式为C₂₂H₃₂O₁₀。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS数据鉴定GAG-C113的结构为1-(2-羟基-3-O-β-D-磁麻吡喃糖基-6-O-β-D-夹竹桃吡喃糖基-苯基)-乙酮。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：7.26(1H，d，8.7，H-4)，6.92(1H，d，8.6，H-5)，2.62(3H，s，CH₃-8)，4.88(1H，Cym-1)，1.50，2.14(2H，Cym-2)，3.48(1H，Cym-3)，3.18(1H，Cym-4)，3.84(1H，H-5)，1.22(3H，Cym-6)，3.42(3H，Cym-OCH₃-3)，4.62(1H，dd，Ole-1)，1.53，2.20(2H，Ole-2)3.61(1H，Ole-3)，3.82(1H，Ole-4)，3.71(1H，Ole-5)，1.24(3H，Ole-6)，3.42(3H，Ole-OCH₃-3)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：124.1(C-1)，159.6(C-2)，142.2(C-3) 120.3(C-4)，117.1(C-5)，154.4(C-6)，204.8(C-7)，32.4(C-8)，96.2(Cym-1)，35.5(Cym-2)，78.7(Cym-3)，74.6(Cym-4)，70.5(Cym-5)，18.8(Cym-6)，58.1(Cym-OCH₃-3)，100.4(Ole-1)，35.3(Ole-2)，79.2(Ole-3)，75.2(Ole-4)，71.4(Ole-5)，18.6(Ole-6)，58.0(Ole-OCH₃-3)。

得到的化合物GAG-C119为白色无定形粉末，UV吸收在λ_最大(CH₃CN)213nm和275nm处。根据负离子HR-ESI-MS的m/z[M-H]^- 451.9203处的分子离子测得GAG-C119的分子式为C₂₄H₂₀O₉。根据IUPAC命名法，鉴定GAG-C119的结构为3，6，2’，6’，2”，6”-六羟基-苯乙酮(Cynandione F)。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.56(1H，H-4)，7.87(1H，d，H-4’)，6.53(1H，d，H-5’)，7.81(1H，d，9Hz，H-4”)，6.51(1H，d，9Hz，H-5”)，2.56(3H，CH₃-8)，2.18(3H，CH₃-8’)，2.57(3H，CH₃-8”)。

¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：120.5(C-1)，123.8(C-2)，154.1(C-3)，110.1(C-4)，134.3(C-5)，148.2(C-6)，114.5(C-1′)，163.6(C-2’)，115.9(C-3’)，134.2(C-4’)，106.3(C-5’)，163.7(C-6’)，112.6(C-1”)，164.9(C-2”)，116.9(C-3”)，134.4(C-4”)，108.8(C-5”)，165.7(C-6”)，207.0(C-7)，204.6(C-7’)，204.9(C-7”)，30.8(C-8)，26.7(C-8’)，26.3(C-8”)。

得到的化合物GAG-C120为白色无定形粉末。UV吸收在λ_最大(CH₃CN)213nm和280nm处。根据负离子HR-ESI-MS的m/z[M-H]^-463.9558处的分子离子测得GAG-C120的分子式为C₂₅H₂₀O₉。鉴定GAG-C120的结构为Cynandione G。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.79(1H，d，9Hz，H-4)，6.93(1H，d，9Hz，H-5)，7.78(1H，d，9Hz，H-4”)，6.51(1H，d，9Hz，H-5”)，5.01(1H，H-7’)，2.56(3H，CH₃-8)，(3H，CH₃-8’)，2.18(3H，CH₃-8”)，1.41(3H，H-9’)。

¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：127.1(C-2)，119.9(C-1)，152.1(C-3)，118.3(C-4)，121.8(C-5)，149.3(C-6)，119.6(C-1′)，149.0(C-2’)，134.3(C-3’)，149.1(C-4’)，120.5(C-5’)，131.5(C-6’)，116.0(C-1”)，146.0(C-2”)，121.7(C-3”)，134.0(C-4”)，108.9(C-5”)，163.7(C-6”)，206.9(C-7)，204.8(C-7”)，92.9(C-7’)，95.6(C-8’)，30.9(C-8)，26.4(C-8”)，30.2(C-9’)。

得到的化合物GAG-C02为白色粉末，分子量为166.17，分子式C₉H₁₀O₃。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C02为1-(4-羟基-3-甲氧基-苯基)-乙酮(乙酰香草酮)。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：7.53(1H，H-2)，6.84(1H，H-5)，7.57(1H，H-6)，2.53(3H，s，CH₃-8)，3.89(3H，s，OCH₃-3)，¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：125.0(C-1)，107.3(C-2)，154.7(C-3)143.7(C-4)，111.8(C-5)，115.7(C-6)，199.2(C-7)，26.27(C-8)，56.34(OCH₃-3’)。

得到的化合物GAG-C23为白色粉末，分子量为226.23，分子式C₁₁H₁₄O₅。通过NMR和MS鉴定GAG-C23的结构为3-羟基-楝叶吴萸素(evofolin)A。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：7.30(2H，H-2，6)，5.17(1H，H-8)，1.41(3H，d，CH₃-9)，3.90(6H，s，OCH₃-3，5)，¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：125.8(C-1)，107.6(C-2，6)，148.8(C-3，C-4，C-5)，210.5(C-7)，69.8(C-8)，22.1(C-9)，56.9(OCH₃-3，OCH₃-5)。

得到的化合物GAG-C07为粘性油状。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 383.07处的分子离子测得GAG-C07的分子式为C₂₀H₂₄O₆。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C07为3，3′-二甲氧基-4，5，9′-三羟基-(7′E)-(9-7′)-环氧木脂素。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.80(1H，H-2)，6.90(1H，H-2’)，6.75(1H，H-6)，6.63(1H-6′)，6.72(1H，H-5)，6.65(1H，H-5′)，2.38，2.45(2H，H-7)，2.72(1H，H-8)，3.72，3.97(2H，H-9)，4.75(1H，H-7’)，2.92(1H，H-8′)，3.61，3.79(2H，H-9′)，3.81，3.83(6H，s，OCH₃-3，3’)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.0(C-4，4′)，145.7(C-3) 147.0(C-3′)，135.7(C-1)，116.2(C-2)，113.5(C-5)，122.2(C-6)，133.6(C-1′)，110.8(C-2’)，116.0(C-5′)，119.8(C-6′)，33.6(C-7)，43.8(C-8)，73.5(C-9)，84.0(C-7′)，54.0(C-8′)，60.4(C-9′) 56.5(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C11为粘性油膏状。GAG-C11的分子式为C₂₀H₂₂O₆，分子量为358.39。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C11的结构为4，9-二羟基-3，3′-二甲氧基-4′，7-环氧基-8，5′-新木脂素基-9′-醛。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.77，6.80(2H，H-5，6)，6.94(1H，H-2)，7.45(1H，H-2’)，7.52(1H，H-6′)，5.65(1H，H-7)，3.55(1H，H-8)，3.48，3.75(2H，H-9)，3.91，3.81(6H，s OCH₃-3，3’)，9.78(1H，H-9’)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.0，149.1(C-3，3’)，146.1(C-4)，147.7(C-4′)，132.6(C-1)，131.0(C-1′)，133.5(C-5’)，110.4(C-2)，116.1(C-5)，122.2(C-6)，113.6(C-2′)，119.7(C-6′)，90.5(C-7)，54.3(C-8)，64.4(C-9)，32.6(C-7′)，42.7(C-8′)，192.5(C-9′)，56.6，56.4(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C12为淡黄色膏状。GAG-C12的分子式为C₁₈H₁₈O₆，分子量为330.33。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C12的结构为4，9-二羟基-3，3′-二甲氧基-4′，7-环氧基-8，5′-新木脂素基-7′-醛。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.94(1H，H-2)，7.45(1H，H-2’)，7.52(1H，H-6′)，6，78，6.81(2H，H-5，6)，5.64(1H，H-7)，3.61(1H，H-8)，3.59，3.86(2H，H-9)，9.78(1H，H-7’)，3.82，3.92(6H，s，OCH₃-3，3’)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.0，149.1(C-3，3’)，146.1(C-4)，147.7(C-4′)，132.6(C-1)，131.0(C-1′)，133.5(C-5’)，110.4(C-2)，116.1(C-5)，122.2(C-6)，113.6(C-2′)，119.7(C-6′)，90.5(C-7)，54.3(C-8)，64.4(C-9)，192.5(C-7′)，56.6，56.4(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C19为淡黄色膏状。GAG-C19的分子式为C₂₆H₃₀O₁₁，分子量为518.51。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C19的结构为4-羟基-3，3′-二甲氧基-9(-O-β-D-葡萄糖吡喃糖苷)-(7′E)-4′，7-环氧基-8，5′-新木脂素-7′-烯-9′-醛。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.78，6.84(2H，H-5，6)，6.98(1H，H-2)，7.23(1H，H-2’)，7.34(1H，H-6′)，5.67(1H，H-7)，3.65(1H，H-8)，3.79，4.11(2H，H-9)，7.62(1H，d，H-7′)，6.65(1H，dd，H-8′)，9.58(1H，H-9’)，3.91，3.81(6H，s OCH₃-3，3’)，4.33(1H，d，Glc-1)，3.41(1H，G1c-2)，3.33(1H，G1c-3)，3.50(1H，Glc-4)，3.29(1H，Glc-5)，3.22，3.76(2H，G1c-6)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：148.9(C-3)，145.8(C-3’)，147.5(C-4)，152.6(C-4′)，129.5(C-1)，130.9(C-1′)，133.5(C-5’)，110.5(C-2)，116.0(C-5)，120.1(C-6)，114.2(C-2′)，119.6(C-6′)，89.8(C-7)，52.5(C-8)，71.8(C-9)，155.9(C-7′)，126.9(C-8′)，195.9(C-9′)，56.6，56.4(OCH₃-3，3’)，105.1(Glc-1)，77.9(Glc-2)，74.9(Glc-3)，71.1(Glc-4)，74.8(Glc-5)，66.9(Glc-6)。

得到的化合物GAG-C20为淡黄色胶状，旋光度为[α]_D+10.8(C＝0.1，MeOH)。根据m/z 607.28([M+Na]⁺)，1191([2M+Na]⁺)处的ESI-MS峰测得GAG-C20的分子式为C₃₁H₃₆O₁₁。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C20的结构为4，4″，7″，9″-四羟基-3，3″，4′，5-四甲氧基-3′，8″-氧化-7，9′，7′，9-二环氧木脂素(Ficussesquilignan B)。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.67-6.96(8H，aromatic proton)，4.74(2H，H-7，7′)，3.13(2H，H-8，8′)，3.89，4.28(2Hx2，H-9，H-9′)，4.90(1H，H-7″)，4.26(1H，H-8″)，3.61，3.90(2H，H-9″)，3.82(6H，s，OCH₃-3’，4′)，3.85(6H，s，OCH₃-3″，5)。

¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：133.5(C-1)，104.1(C-2，6)，154.3(C-3，5)，130.5(C-4)，132.2(C-1′)，110.8(C-2′)，147.1(C-3′)，148.9(C-4′)，115.5(C-5′)，120.5(C-6′)，132.5(C-1″)，111.2(C-2″)，152.4(C-3″)，146.6(-4″)，115.9(C-5″)，122.3(C-6″)，87.2(C-7，7′)，55.2(C-8，8′)，72.7(C-9，9)，87.9(C-7″)，74.8(C-8″)，61.6(C-9″)，56.6 56.4，56.3，55.7(OCH₃)。

得到的化合物GAG-C49为白色膏状。从正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 367.30处的分子离子推断GAG-C49的分子式为C₂₀H₂₄O₅，分子量为344.16。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS表明GAG-C49为(7α，7′α，8β，8′β)-4，4′-二羟基-3，3′-二甲氧基-7，4′-环氧木脂素。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.98(2H，H-2，2′)，6.78，6.83(4H，H-4，4′，H-5，5’)，4.64(2H，d，H-7，H-7′)，1.82(2H，m，H-8，8′)，1.32(3H，s，CH₃-9)，3.88(6H，s，OCH₃-3，3’)，1.02(6H，d，CH3-9，9’)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：148.7(C-3，C-3′)，148.2(C-4，C-4′)，134.7(C-1，C-1′)，109.6(C-2，C-2′)，110.8(C-5，C-5’)，118.5(C-6，C-6′)，87.1(C-7，C-7′)，44.4(C-8，C-8′)，12.9(C-9，C-9′)，55.8，55.9(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C64为白色膏状。从正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 363.22处的分子离子推断GAG-C64的分子式为C₂₀H₂₀O₅₅，分子量为340.13。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS表明GAG-C64为4-羟基-3，3′-二甲氧基-(7′E)-4′，7-环氧基-8，5′-新木脂素-7′-烯-9′-醛。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.79，6.87(2H，H-5，6)，6.99，7.19，7.20(3H，H-2，H-2’，H-6′)，7.62(1H，d，H-7’)，6.68(1H，dd，H-8’)，5.18(1H，d，H-7)，3.53(1H，H-8)，1.32(3H，s，CH₃-9)，3.74，3.71(6H，s OCH₃-3，3’)，9.58(1H，H-9’)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.0(C-3)，145.8(C-3’)，147.9(C-4)，152.0(C-4′)，129.6(C-1)，132.5(C-1′)，135.5(C-5’)，110.4(C-2)，116.1(C-5)，120.3(C-6)，113.8(C-2′)，118.8(C-6′)，95.4(C-7)，46.4(C-8)，18.2(C-9)，155.9(C-7′)，126.9(C-8′)，195.5(C-9′)，56.7，56.4(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C70为白色膏状。从正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 349.40处的分子离子推断GAG-C70的分子式为C₂₀H₂₂O₄，分子量为326.15。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS表明GAG-C70为(7′α，8′β)-4，4′-二羟基-3，3′-二甲氧基-6，7′-环木脂素-7-烯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.46-6.62(5H，m，H-2，5，H-2′，5′，6′)，6.07(1H，d，H-7)，3.66(1H，H-7’)，2.33(1H，H-8’)，3.74，3.71(6H，s OCH₃-3，3’)，1.76(3H，s，CH₃-9)，1.05(3H，s，CH₃-9’)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：147.3(C-3)，146.4(C-3’)，144.7(C-4)，144.3(C-4′)，126.9(C-1)，137.7(C-1′)，112.4(C-2)，114.6(C-5)，127.7(C-6)，113.1(C-2′)，119.9(C-5′)，121.0(C-6′)，111.2(C-7)，138.4(C-8)，18.1(C-9)，51.0(C-7′)，42.6(C-8′)，21.3(C-9′)，55.4，55.2(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C77为淡黄色膏状。发现GAG-C77的分子式为C₁₈H₁₈O₅，分子量为314.33。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C77的结构为4-羟基-3，3′-二甲氧基-4′，7-环氧基-8，5′-氧化新木脂素基-7′-醛。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.99(1H，H-2)，7.44(2H，H-2’，H-6′)，6,81，6.87(2H，dd，H-5，6)，5.26(H，d，H-7)，3.55(1H，H-8)，1.28(3H，d，H-9)，9.79(1H，H-7’)，3.83，3.92(6H，s，OCH₃-3，3’)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.0(C-3)，155.7(C-3′)，145.1(C-4)，143.6(C-4′)，148.1.0(C-5′)，130.2(C-1)，133.0(C-1′)，110.8(C-2)，111.8(C-2′)，116.1(C-5)，120.4(C-6)，115.5(C-6′)，95.0(C-7)，46.1(C-8)，18.1(C-9)，192.5(C-7′)，56.7，56.5(OCH₃-3，3’)。

得到的化合物GAG-C121为粘性油状，UV吸收在λ_最大(CH₃CN)：258nm处。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 397.37处的分子离子发现GAG-C121的分子式为C₂₁H₂₆O₆。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C121为3，3′，5-三甲氧基-4，7-二羟基-(7′E)-(8-O-4′)-新木脂素-7′-烯。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.97(1H，d，1.5，H-2)，6.81(1H，d，1.5，H-6)，6.69(1H，H-2’)，6.83(1H，d，8.1，H-5’)，6.75(1H，d，8.4，H-6′)，6.34(1H，d，15.9，H-7’)，6.24(1H，m，H-8’)，4.60(1H，d，6.9，H-7)，4.08(1H，m，H-8)，3.86，3.84(9H，s，OCH₃-3，3’，5)，1.07(3H，d，6.3，CH₃-9)，1.86(3H，dd，1.2，6.3，CH₃-9’)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：149.0(C-3)，149.1(C-3′，C-5)146.2(C-4′)，133.2(C-1)，134.2(C-1′)，136.2(C-4)，121.3(C-6′)，115.8(C-5′)，111.8(C-2′)，105.6(C-2)，104.3(C-6)，132.1(C-7′)，126.2(C-8′)，79.6(C-7)，86.3(C-8)，17.3(C-9)，18.5(C-9′)，56.5，56.4(OCH₃-3，3’，5)。

得到的化合物GAG-C66为白色膏状。从正离子HRESI-MS的m/z[M+H]⁺ 285.1921处的分子离子推断GAG-C66的分子式为C₁₉H₂₄O₂，分子量为284.39。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS表明GAG-C66的结构为4，6-二烯-3，17-二氧代-雄甾烷。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：5.69(1H，s，H-4)，6.25(1H，dd，H-6)，6.34(1H，dd，H-7)，1.64，2.17(2H，m，H-1)，2.54，2.69(2H，m，H-2)，1.32(1H，H-8)，1.59(1H，H-9)，1.54，1.75(2H，m，H-11)，1.82，2.36(2H，m，H-12)，2.48(1H，H-14)，1.24，2.13(2H，m，H-15)，2.17，2.63(2H，m，H-16)，0.99(3H，s，CH₃-18)，1.19(3H，s，CH₃-19)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：201.0(C-3)，221.2(C-17)，123.0(C-4)，165.5(C-5)，128.1(C-6)，139.9(C-7)，33.6(C-1)，35.4(C-2)，51.1(C-8)，49.7(C-9)，37.4(C-10)，20.0(C-11)，21.3(C-12)，50.1(C-13)，36.5(C-14)，31.4(C-15)，33.9(C-16)，13.1(C-18)，15.6(C-19)。

得到的化合物GAG-C67为无定形粉末。从正离子HRESI-MS的m/z[M+H]⁺ 285.1903处的分子离子推断GAG-C67的分子式为C₁₉H₂₄O₂，精确质量为284.18。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS表明GAG-C67的结构为4，6，16-三烯-17-羟基-3-氧代-雄甾烷。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：5.67(1H，s，H-4)，6.22(1H，dd，H-6)，6.43(1H，d，H-7)，5.74(1H，m，H-15)，6.12(1H，d，H-16)，4.28(1H，H-17)，1.72，2.05(2H，m，H-1)，2.37，2.65(2H，m，H-2)，1.29(1H，H-8)，2.47(1H，H-9)，1.56，1.64(2H，m，H-11)，1.55，1.93(2H，m，H-12)，1.99(1H，H-14)，0.91(3H，s，CH₃-18)，1.18(3H，s，CH₃-19)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：201.1(C-3)，122.8(C-4)，165.9(C-5)，127.8(C-6)，141.3(C-7)，135.3(C-15)，129.8(C-16)，84.6(C-17)，33.6(C-1)，33.8(C-2)，52.2(C-8)，35.5(C-9)，36.5(C-10)，20.3(C-11)，34.5(C-12)，51.7(C-13)，55.0(C-14)，13.8(C-18)，16.8(C-19)。

得到的化合物GAG-C68为无定形粉末。从正离子HRESI-MS的m/z[M+H]⁺ 315.1990处的分子离子推断GAG-C68的分子式为C₂₁H₃₀O₂，分子量为314.46。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS表明GAG-C68的结构为4，6-二烯-20-羟基-3-氧代-孕烷。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：5.65(1H，s，H-4)，6.18(1H，dd，H-6)，6.25(1H，dd，H-7)，4.09(1H，dd，H-20)，1.71，2.05(2H，m，H-1)，2.37，2.60(2H，m，H-2)，1.35(1H，m，H-8)，2.36(1H，m，H-9)，1.47，1.64(2H，m，H-11)，1.55，1.85(2H，m，H-12)，1.47(1H，H-14)，1.96，2.32(2H，m，H-15)，2.04，2.62(2H，m，H-16)，2.28(1H，H-17)，0.79(3H，s，CH₃-18)，1.15(3H，s，CH₃-19)，1.21(3H，d，CH₃-21)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：202.1(C-3)，123.7(C-4)，167.2(C-5)，128.6(C-6)，143.4(C-7)，70.8(C-20)，34.8(C-1)，35.0(C-2)，52.2(C-8)，40.0(C-9)，37.5(C-10)，21.6(C-11)，24.7(C-12)，43.6(C-13)，54.8(C-14)，27.4(C-15)，38.9(C-16)，59.5(C-17)，12.8(C-18)，16.7(C-19)，24.1(C-21)。

得到的化合物GAG-C72为无定形粉末。从正离子HRESI-MS的m/z[M+H]⁺ 283.1921处的分子离子推断GAG-C72的分子式为C₁₉H₂₂O₂，分子量为282.38。根据IUPAC命名法，主要通过NMR和MS表明GAG-C72的结构为1，4，6-三烯-3，17-二氧代-雄甾烷。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：7.31(1H，d，H-1)，6.24(1H，d，H-2)，6.03(1H，s，H-4)，6.27(1H，d，H-6)，6.41(1H，d，H-7)，2.55(1H，H-8)，1.21(1H，H-9)，1.95，2.14(2H，m，H-11)，1.81，1.93(2H，m，H-12)，1.58(1H，H-14)，1.32，1.87(2H，m，H-15)，2.16，2.51(2H，m，H-16)，0.99(3H，s，CH₃-18)，1.19(3H，s，CH₃-19)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：188.3(C-3)，221.8(C-17)，128.2(C-1)，156.0(C-2)，124.1(C-4)，165.8(C-5)，128.9(C-6)，138.6(C-7)，39.0(C-8)，50.1(C-9)，43.0(C-10)，22.3(C-11)，22.4(C-12)，49.3(C-13)，50.2(C-14)，32.5(C-15)，36.5(C-16)，14.3(C-18)，21.3(C-19)。

得到的化合物GAG-C38为淡黄色油状。发现GAG-C38的分子式为C₁₃H₁₀O₅，分子量为246.22。通过NMR和MS鉴定GAG-C38的结构为5，8-二甲氧基-补骨脂素。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.29(1H，d，H-2)，8.25(1H，d，H-3)，7.23(1H，H-2′)，7.83(1H，H-3′)，4.10(3H，s，OCH₃)，4.21(3H，s，OCH₃)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：160.5(C-2)，112.8(C-3)，139.5(C-4)，144.4(C-5)，114.9(C-6)，149.9(C-7)，128.3(C-8)，143.7(C-9)，107.7(C-10)，145.3(C-2′)，105.3(C-3′)，61.9(3H，OCH₃)，61.7(3H，OCH₃)。

得到的化合物GAG-C40为淡黄色油状。发现GAG-C40的分子式为C₁₂H₁₂O₅，分子量为236.22。通过NMR和MS鉴定GAG-C40的结构为6，7，8-三甲氧基-香豆素。

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.33(1H，d，H-2)，7.87(1H，d，H-3)，6.97(1H，s，H-5)，3.88(3H，s，OCH₃)，3.93(3H，s，OCH₃)，3.97(3H，s，OCH₃)。¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：162.5(C-2)，115.4(C-3)，145.8(C-4)，105.6(C-5)，151.6(C-6)，143.8(C-7)，147.1(C-8)，142.0(C-9)，116.0(C-10)，61.8，62.2，62.3(OCH₃)。

得到的化合物GAG-C50为黄色油状。发现GAG-C50的分子式为C₁₆H₁₄O₅，分子量为286.28。通过NMR和MS鉴定GAG-C50的结构为8-(2-羟基-3-甲基丁-3-烯氧基)-补骨脂素。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.38(1H，d，H-2)，8.03(1H，d，H-3)，7.58(1H，s，H-5)，6.96(1H，d，H-2′)，7.89(1H，d，H-3′)，4.42，4.46(2H，m，H-2″)，4.54(1H，m，H-3″)，5.13，4.96(2H，H-4″)，1.67(3H，s，CH₃-4″)，1.83(3H，s，CH₃-5″)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：161.5(C-2)，113.9(C-3)，144.4(C-4)，113.8(C-5)，126.7(C-6)，147.9(C-7)，131.7(C-8)，143.1(C-9)，116.8(C-10)，147.3(C-2′)，106.8(C-3′)，145.5(C-3″)，111.9(C-4″)，76.3(C-1″)，74.2(C-2″)，17.8(C-5″)。

得到的化合物GAG-C71为淡黄色油状。发现GAG-C71的分子式为C₁₈H₂₀O₆，分子量为332.35。通过NMR和MS鉴定GAG-C71的结构为8-(3-乙氧基-2-羟基-3-甲丁氧基)-补骨脂素。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.38(1H，d，H-2)，8.04(1H，d，H-3)，7.58(1H，s，H-5)，6.96(1H，d，H-2′)，7.89(1H，d，H-3′)，4.45(1H，t，H-2″)，4.04，4.77(2H，H-1″)，1.21(6H，s，CH₃-4″)，1.27(3H，s，CH₃-5″)，3.49(2H，m，CH₂-6″)，1.11(3H，t，CH₃-7″)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：162.1(C-2)，115.0(C-3)，147.3(C-4)，114.8(C-5)，126.7(C-6)，149.7(C-7)，131.3(C-8)，144.9(C-9)，115.1(C-10)，146.6(C-2′)，107.9(C-3′)，66.9(C-1″)，76.5(C-2″)，81.0(C-3″)，22.5(C-4″)，21.9(C-5″)，63.2(C-6″)，15.8(C-7″)。

得到的化合物GAG-C81为淡黄色油状。发现GAG-C81的分子式为C₁₆H₁₄O₄，分子量为270.28。通过NMR和MS鉴定GAG-C81的结构为8-(3-甲基丁-2-烯氧基)-补骨脂素(欧前胡素(Imperatorin))。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.37(1H，d，H-2)，8.01(1H，d，H-3)，7.56(1H，d，H-5)，6.95(1H，d，H-2′)，7.88(1H，d，H-3′)，5.55(1H，m，H-2″)，4.96，4.98(2H，H-1″)，1.67(3H，s，CH₃-4″)，1.71(3H，s，CH₃-5″)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：162.6(C-2)，115.1(C-3)，148.3(C-4)，114.8(C-5)，127.7(C-6)，149.9(C-7)，132.3(C-8)，144.9(C-9)，115.1(C-10)，146.6(C-2′)，107.9(C-3′)，120.8(C-2″)，140.9(C-3″)，70.9(C-1″)，23.8(C-4″)，18.1(C-5″)。

得到的化合物GAG-C82为淡黄色油状的呋喃香豆素。发现GAG-C82的分子式为C₁₇H₁₆O₅，分子量为330.31。通过NMR和MS鉴定GAG-C82的结构为8-(3-甲基丁-2-烯氧基)-5-甲氧基-补骨脂素(珊瑚菜素(Phellopterin))。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：6.29(1H，d，H-2)，8.25(1H，d，H-3)，7.19(1H，d，H-2′)，7.80(1H，d，H-3′)，5.55(1H，m，H-2″)，4.96，4.98(2H，H-1″)，4.21(3H，OCH₃)，1.64(3H，s，CH₃-4″)，1.70(3H，s，CH₃-5″)。¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：162.5(C-2)，112.8(C-3)，141.0(C-4)，141.3(C-5)，115.8(C-6)，145.9(C-7)，128.5(C-8)，130.6(C-9)，108.3(C-10)，146.6(C-2′)，106.2(C-3′)，120.6(C-2″)，140.7(C-3″)，71.0(C-1″)，23.7(C-4″)，18.2(C-5″)，61.4(-OCH₃)。

得到的化合物GAG-C74为无定形粉末。根据报道数据发现GAG-C74的分子量为472.70，分子式为C₃₀H₄₈O₄。根据IUPAC命名法，通过NMR和MS鉴定GAG-C74的结构为3β，23-二羟基-12-烯-28-齐墩果酸。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：1.10，1.72(2H，m，H-1)，1.78，2.01(2H，m，H-2)，3.66(1H，H-3)，1.30(1H，m，H-5)，0.93，1.4(2H，m，H-6)，1.3，1.5(2H，m，H-7)，1.74(1H，m，H-9)，1.91(2H，m，H-11)，5.23(1H，t，H-12)，1.1，1.9(2H，m，H-15)，<1.2>(2H，H-16)，2.85(1H，H-18)，1.05，2.30(2H，H-19)，1.2，1.9(2H，H-21)，1.8，2.2(2H，H-22)，3.50，3.61(2H，H-23)，1.16(3H，s，CH3-24)，0.97(3H，s，CH3-25)，0.70(3H，s，CH₃-26)，0.93(3H，s，CH₃-27)，0.81(3H，s，CH₃-29)，0.90(3H，s，CH₃-30)。

¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)[δ]：39.5(C-1)，27.5(C-2)，77.1(C-3)，40.5(C-4)，55.5(C-5)，18.8(C-6)，33.6(C-7)，39.4(C-8)，47.7(C-9)，37.9(C-10)，24.0(C-11)，126.1(C-12)，138.6(C-13)，42.9(C-14)，28.9(C-15)，24.6(C-16)，48.3(C-17)，53.6(C-18)，43.0(C-19)，43.3(C-20)，31.6(C-21)，34.9(C-22)，65.4(C-23)，12.8(C-24)，16.3(C-25)，17.8(C-26)，24.5(C-27)，181.3(C-28)，33.5(C-29)，24.1(C-30)。

得到的活性神经保护化合物GAG-C14为油状。根据正离子ESI-MS的m/z[M+Na]⁺ 353.31处的分子离子，发现GAG-C14的分子量为330.50，分子式为C₁₉H₃₈O₄。通过NMR谱鉴定GAG-C14的结构为2，3-二羟丙基棕榈酸酯(甘油的棕榈酸酯)。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD，ppm)δ：0.88(3H，s)，1.65(2H，m)，1.29(2H，m)，1.31(2H，m)，1.30(20H，m)，2.35(2H，m)，4.20(2H，m)，3.68，3.59(2H，m，-OH)，3.92(1H，m，-OH).¹³C-NMR(75MHz，CD₃OD，ppm)δ：174.2，(C-1)，70.3(C-2)，65.1(C-3)，63.3(C-4)，34.2(C-5)，25.0(C-6)，32.0(C-7)，22.8(C-8)，14.1(C-9)，29.2-29.7(C-10)。

通过酸水解制备孕烷糖苷的糖苷配基。将聚氧孕烷糖苷(～5mg)溶解于1ml MeOH，并添加0.3ml 0.1M H₂SO₄。将溶液加热至80℃，持续50分钟，然后添加1ml H₂O。去除甲醇之后，用乙醚萃取水层(3x2ml)。蒸发乙醚得到～2.5mg糖苷配基。通过HPLC层析和NMR谱分析和鉴定糖苷配基。

实施例44：分析，检测及测试

原代神经元培养物

在Hanks平衡盐溶液中，从18天的胚胎(E18)雄性远交群(Sprague-Dawley)大鼠切下皮层和海马。将组织用刀片切碎并经胰蛋白酶作用，之后用热灭活的马血清处理。接着将分离的细胞接种到聚d-赖氨酸(PDL)(Sigma)包被的平板上。于37℃下，在空气中有5％CO₂的潮湿环境中，在补充2％B27、青霉素/链霉素和1mM L-谷氨酰胺的Neurobasal培养基中孵育神经元。3小时之后，将培养基更换成生长培养基(含青霉素/链霉素和B27补充物的Neurobasal培养基)。为了维持，每2-3天更换一半体积的培养基。除非另有所指，用于原代神经元培养物的所有试剂均购自Invitrogen。

细胞毒性测试

用连续稀释于Neurobasal培养基中的不同浓度的测试样品处理体外7天(7DIV)的皮层神经元。孵育24小时之后，通过细胞毒性检测试剂盒(Roche)测定释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)。数据计算为相对于1％ Triton X-100的细胞死亡百分比。

NMDA或谷氨酸盐存活分析

将皮层神经元以每孔1.1x10⁵细胞的密度接种于48-孔板(Nunc)，培养11-12天(11-12DIV)。在N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA，Sigma)或谷氨酸盐(MSG，Sigma)处理之前，神经元用测试化合物预先处理2小时。简而言之，神经元用不含Mg²⁺的洛克氏溶液(Milli-Q水中的5mM氯化钾、128mM氯化钠、2.7mM氯化钙、1mM磷酸氢二钠，5mM HEPES和10mM葡萄糖)冲洗，之后在添加甘氨酸(0.1μM)的洛克氏溶液中孵育15分钟。孵育之后，神经元用测试化合物(溶解于添加甘氨酸的洛克氏溶液)和NMDA(20μM)或谷氨酸盐共同处理20分钟。接着神经元用含Mg²⁺的洛克氏溶液冲洗并更换为新鲜生长培养基。利用乳酸脱氢酶释放实验(细胞毒性检测试剂盒，Roche)分析和定量细胞死亡。将数据与DMSO介质对照相比，以平均值±SEM表示。使用学生t-检验进行统计学分析。

B27取出时的层神经元存活分析

将神经元以每孔1.2x10⁵细胞的密度接种于48-孔板(Nunc)，培养7-8天(7-8DIV)。在正常生长培养基中，神经元用测试化合物预先处理2小时。然后用Hanks’溶液清洗细胞两次，并更换为连续稀释于Neurobasal培养基的测试化合物。孵育2天之后，将四唑、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT，5mg/ml)以1∶10的比率添加到培养基中。MTT被活细胞还原成紫色甲臜且进一步溶解于20％ SDS溶液。因此，通过分光光度计测定有色溶液，并定量细胞活力。将数据与存在B27时的DMSO介质对照相比，以平均值±SEM表示。使用学生t-检验进行统计学分析。

用β-淀粉样肽损伤的皮层神经元存活分析

将神经元以每孔1.1x10⁵细胞的密度接种于48-孔板(Nunc)，培养7-8天(7-8DIV)。在正常生长培养基中，神经元用测试化合物预先处理2小时。然后在生长培养基中，用测试样品和β-淀粉样肽片段25-35(Aβ，10μM，Sigma)孵育细胞。孵育24小时之后，将四唑、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT，5mg/ml)以1∶10的比率添加到培养基中。MTT被活细胞还原成紫色甲臜且进一步溶解于20％ SDS溶液。因此，通过分光光度计测定有色溶液，并定量细胞活力。将数据与DMSO介质对照相比，以平均值±SEM表示。使用学生t-检验进行统计学分析。

β-淀粉样肽存在时皮层神经元中的半胱天冬酶-3表达

将神经元以每板3x10⁶细胞的密度接种于60mm平板(TPP，Corning)，培养7-8天(7-8DIV)。在正常生长培养基中，神经元用测试化合物预先处理2小时。然后在生长培养基中，用测试样品和β-淀粉样肽片段25-35(Aβ，10μM，Sigma)孵育细胞。孵育24小时之后，将培养物立即放到冰上，用添加蛋白酶抑制剂的冷D-PBS冲洗。通过添加RIPA缓冲液收集总蛋白裂解物并通过离心去除碎片。定量裂解物，将等分试样保存于-80℃备用。在上样之前，将裂解物加热至95℃持续10分钟，然后涡旋振荡并于15,000xg离心7分钟。提取的蛋白在10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并将其印迹转移到醋酸纤维膜上。用溶解有5％(w/v)奶粉的含0.1％ TritonX-100的PBS清洗膜，之后用同样检测裂解的半胱天冬酶-3的抗半胱天冬酶-3的一抗(1∶1000，Cell Signaling Technology)于4℃过夜孵育。清洗膜并用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育。利用ECL Western印迹试剂盒显现信号。然后将印迹剥离并探测总ERK表达。

全细胞膜片钳

将海马神经元以每板3x10⁵细胞的密度接种到PDL包被的35mm培养皿(NUNC)。每2至3天用NB、B27和50mM L-谷氨酰胺更换一半的培养基。体外第12天(12DIV)时，进行全细胞膜片钳研究。内部溶液含有120mM氯化铯、20mM氯化四乙铵、2mM氯化镁、1mM氯化钙和10mM HEPES(pH 7.2)。外部溶液含有137mM氯化钠、1mM碳酸氢钠、0.34mM磷酸氢二钠、5.37mM氯化钾、0.44mM磷酸二氢钾、2.5mMHEPES(pH 7.4)和22.2mM葡萄糖。在与溶液槽相连的达到8个独立控制管(List Medical，Germany)的线性阵列中排列与NMDA(20μM)混合的最适浓度的测试样品。将移液管进行火抛光以形成3-5MΩ的移液管电阻。膜片钳细胞的保持电位保持在-70mV，并且利用Axopatch-200B放大器(Axon Instruments，USA)记录电流。河豚毒(5μM)和甲碘荷包牡丹碱(20μM)(Tocris)存在于电解液中，以阻断分别由电压门控钠通道和GABAergic通道介导的突触传递。通过pClamp9软件分析数据，并与DMSO溶剂对照相比来表示对NMDA诱导电流的抑制百分比。

对皮层神经元培养物的荧光钙分析

将皮层神经元以每孔3x10⁴接种到聚赖氨酸包被的透明底96孔黑色板(BD Bioscience)。将体外9天(9DIV)至13DIV的培养物用于NMDA受体活性分析。分析当天，于37℃下，使原代培养物在由10μM HEPES(pH 7.4)、丙磺舒和钙敏感荧光染料Fluo4-AM(Molecular Probes)(4μM)组成的平衡盐缓冲溶液中孵育1小时。然后将细胞连同相应的含有连续稀释的测试样品的平板一起放置到荧光成像读板仪(FLIPR，MolecularDevices)上。FLIPR以每秒50μl的注射速度将测试化合物自动转移到孔中。通过荧光染料监测随后从胞外膜移动到胞内膜的钙离子2分钟。通过FLIPR测定相对荧光变化。将数据与DMSO介质对照相比，并以平均值±SEM表示。使用学生t-检验进行统计学分析。

B27取出之后神经元的免疫细胞化学分析

将皮层神经元以每板1x10⁶细胞的密度接种到35-mm培养皿(NUNC)，所述培养皿利用补充2％ B27(Invitrogen)的Neurobasal培养基(Invitrogen)。使体外7-8天(7-8DIV)的神经元进行测试化合物的处理。如上所述，在B27取出之前，神经元用测试化合物预先处理2小时。孵育48小时之后，于室温下用4％多聚甲醛固定神经元20分钟，并用4％山羊血清和0.4％ Triton X-100渗透和封闭。神经元通过用对III型β-微管蛋白特异的小鼠单克隆抗体(1∶1000；Sigma)于4℃过夜孵育，之后通过FITC-偶联的山羊抗小鼠抗体(1∶1000；Invitrogen)的孵育进行双重染色。神经元用DAPI(1∶5000)复染，以在封片之前显现细胞核。然后利用40倍物镜的荧光显微镜(DMRA；Leica)分析细胞形态。用RT Slider数码相机(#2.3.1，Diagnostics Instruments)获取荧光图像，用SPOT软件(DiagnosticsInstruments)采集并用Adobe图像软件合成。

信号转导蛋白的Western印迹检测

将PC12细胞和皮层神经元用于Western印迹分析。从ATCC获得冻存的PC12细胞，维持于存在链霉素和青霉素的补充5％马血清和6％胎牛血清的DMEM中。每3天将PC12细胞进行亚培养，第25代之后丢弃。将皮层神经元以每板3x10⁶细胞的密度接种到60mm平板(TPP，Corning)。体外7-8天(DIV)之后进行实验。神经元和PC12细胞用不同浓度的测试样品处理15分钟，或者用最适浓度的测试样品处理不同的时间间隔。将培养物立即放到冰上，用添加蛋白酶抑制剂的冷D-PBS冲洗。通过添加RIPA缓冲液收集总蛋白裂解物，并通过离心去除碎片。定量裂解物，将等分试样保存于-80℃备用。在上样之前，将裂解物加热至95℃持续10分钟，涡旋振荡并于15,000xg离心7分钟。提取的蛋白在10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并将其印迹转移到醋酸纤维膜上。用溶解有5％(w/v)奶粉的含0.1％ Triton X-100的PBS清洗膜，之后用抗磷酸化ERK(P-ERK，1∶1000)、P-CREB Ser¹³³(1∶1000)、P-Akt(1∶1000)、P-P38(1∶1000)或P-MEK(1∶1000)的一抗(购自Cell Signaling Technology)于4℃过夜孵育。清洗膜，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育。利用ECL Western印迹试剂盒显现信号。然后将印迹剥离并探测总ERK、CREB、Akt、P38和MEK表达。

棘的量化

将培养的海马神经元接种于12-孔板(Falcon)中聚D-赖氨酸包被的18mm盖玻片上。接着神经元在补充2％ B27(Invitrogen)和0.5mM谷氨酰胺的Neurobasal培养基(Invitrogen)中培养。为显现树突棘的形态，通过利用磷酸钙沉淀法，用GFP DNA构建体转染7-9DIV之间的神经元。为检测树突棘的发育，用测试化合物在14DIV时处理神经元。接着用4％多聚甲醛固定神经元，利用共聚焦显微镜检测形态。为定量培养的海马神经元中的树突棘，利用60倍物镜采集大量的图像(z轴步进，0.5μm)。合并图像，利用MetaMorph软件(Universal Imaging Corp)分析。对以树突表面至少0.5μm的突起来定义的树突棘进行评分，以树突的每微米长度表示。以双盲方式随机选择并定量每个神经元的三个树突。对于每个实验条件，分析来自3次独立实验的20至30个神经元。数据以平均值±SEM表示。

RNA提取、cDNA合成和实时定量PCR

7-8DIV的皮层神经元用乳突果精制级分以不同的时间间隔进行处理。将细胞在D-PBS(DEPC处理的)中清洗，利用RNA Shredder试剂盒之后是RNeasy Mini试剂盒(Invitrogen)按照厂商方案提取总RNA。接着通过甲醛变性凝胶电泳显现RNA的质量。利用SuperScript II反转录酶(Invitrogen)和寡-dT引物，将总RNA逆转录成单链cDNA。在7500 FastReal-Time PCR System(Applied Biosystems)上利用Power SYBR GreenPCR Master Mix进行实时定量PCR。热循环于95℃，10分钟变性步骤启动，之后是40个循环：95℃，30秒；60℃，1分钟及72℃，30秒。终产物在反应结束时进行溶解检测。相对于管家基因次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，使基因表达的调控标准化。实时PCR引物如下：

BDNF正向：TTGAGCACGTGATCGAAGAG

BDNF反向：CCAGCAGAAAGAGCAGAGGA

NT-3正向：GGGGGATTGATGACAAACAC

NT-3反向：ACAAGGCACACACACAGGAA

Bc1-2正向：ATAACCGGGAGATCGTGATG

Bc1-2反向：CAGGCTGGAAGGAGAAGATG

c-fos正向：GGAGCCGGTCAAGAACATTA

c-fos反向：TGCTGCATAGAAGGAACCAG

HPRT1正向：TGACACTGGTAAAACAATGCA

HPRT1反向：GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT

GAPDH正向：TGCACCACCAACTGCTTAGC

GAPDH反向：GGCATGGACTGTGGTCATGAG

CREB启动子分析

利用Lipofectamine 2000(基于阳离子脂质体的试剂)(Invitrogen)按照ACM脂质体法，用与CREB活化连接的荧光素酶报告基因(Cre-Luc)转染新鲜分离的胚胎皮层神经元。接着将所转染的细胞以每孔1.3x10⁵细胞的密度接种到PDL包被的48孔板(NUNC)，并在含B27补充物的Neurobasal培养基中培养7-12天(7-12DIV)。利用每孔1μL Lipofectamine2000和0.4μg DNA进行转染。接着神经元用测试样品处理6小时的时间。处理之后，将细胞用冰冷的DPBS清洗并添加100μL的1倍荧光素酶裂解缓冲液(Promega)。将平板放置于-20℃使细胞冷冻，之后使它们解冻以促进裂解。将裂解物转移到白色底的平板上，利用荧光素酶分析试剂盒(Promega)来分析海肾荧光素酶。神经元中CREB活化的增多导致荧光素酶产生增强，这利用Promega GloMax^TM 96微孔板发光检测仪来定量。数据与DMSO介质对照相比，以平均值±SEM表示。使用学生t-检验进行统计分析。BDNF和咯利普兰用作阳性对照。

Morris水迷宫

6-8周龄(年幼)或18月龄(年老)的远交系雄性I.C.R.小鼠以每笼五只养在12小时光照/黑暗交替、控制气候的动物房中(23-25℃)。允许动物随意获得水和食物。在测试期之前的3天，将用于实验的小鼠带到特定的实验室条件下，所有实验都在14:00至18:00之间进行。将小鼠分配到三组中的一组：组1，给予介质对照的年幼小鼠；组2：给予介质对照的年老小鼠；或组3，给予AG-0(30mg/kg)的年老小鼠。每天在实验之前将AG-0溶解于生理盐水中。在任务的第一天开始口服给予(p.o.)AG-0，按照10mL/kg体重的量给予。在游泳任务之前45分钟给予化合物，连续5-6天每天进行直到任务结束。

每只小鼠每天进行4次测试。当保持面向池壁的小鼠浸入水中时开始测试。然后给小鼠60秒去寻找隐藏的平台。如果小鼠在这个时期之内未能逃避(定位平台)，将它引导并放在平台上。无论小鼠是否发现平台，使它在那里逗留20秒。测试之间有45分钟的恢复时间。从位于平台最远处的2点(西和北)开始4次测试。由于小鼠在行为实验中的逃避潜伏期和游泳距离表现出相似的组间差异，因此仅使用逃避潜伏期(定位平台所耗费的时间)来评估测试小鼠的记忆表现。使用重复测量的双向ANOVA来分析潜伏期值，计算每只小鼠的平均潜伏期时间。数据利用双向ANOVA，以平均值±SEM表示。

强迫游泳实验

使用5周龄重达22-26g的远交系雄性I.C.R.小鼠。小鼠可自由获取食物(啮齿动物饲料#2053，5g/小鼠/天)和水。笼底用木刨花覆盖，每周处理小鼠一次，同时清洁鼠笼。将小鼠随机分成4组：组1，介质对照(口服)；组2，30mg/kg(口服)的AG-0；组3，100mg/kg(口服)的AG-0；或组4，15mg/kg(腹腔注射)的丙咪嗪。每组小鼠的数量是大约10只。为便于适应新环境，在实验前至少一周将小鼠从中心动物机构运送到实验区。所有实验时间都在上午9:00am至12:00pm之间进行。在诱导绝望之前，连续6天每天一次给予AG-0和丙咪嗪。

将高为30cm，直径为11.5cm的Pyrex圆筒装满水(10cm)到小鼠不能触碰底部这样的水平。第一天，将小鼠放到其不能逃离的圆筒中15分钟来诱导绝望。24小时之后，将其放到圆筒中6分钟，并且利用XT移动检测器(Noldus软件)监测或记录该过程。在6分钟时限之内的最后4分钟，测定并计算小鼠停止挣扎的持续时间。

旷场实验

使用5周龄重达22-26g的远交系雄性I.C.R.小鼠。小鼠可自由获取食物(啮齿动物饲料#2053，5g/小鼠/天)和水。笼底用木刨花覆盖，每周处理小鼠一次，同时清洁鼠笼。将小鼠随机分成4组：组1，介质对照(口服)；组2，30mg/kg(口服)的AG-0；组3，100mg/kg(口服)的AG-0；或组4，15mg/kg(腹腔注射)的丙咪嗪。每组小鼠的数量是大约10只。为便于适应新环境，在实验前至少一周将小鼠从中心动物机构运送到实验区。所有实验时间都在上午9:00am至12:00pm之间进行。在测试小鼠的自主活动之前，连续6天每天一次给予AG-0和丙咪嗪。

将小鼠放到50cmx50cmx40cm大小的场地适应40分钟，然后给予测试样品(最后一次给予)。45分钟之后，将小鼠放到场地中，利用XT移动检测器(Noldus软件)记录小鼠在30分钟时限内的移动距离。在控制温度、噪音和光照的房间进行实验。在每次实验前，用70％乙醇清洁并用湿棉擦拭场地，以防止前面小鼠留下的气味线索可能产生的偏差。

Frings听源性痉挛易感性小鼠模型

Frings小组在50年代中期建立Frings小鼠。其是由瑞士白化病背景的自发突变产生的近交系。Frings小鼠品系在痉挛表型方面优于传统的DRA/2J品系，因为其对听源性痉挛的易感性保持到成年(Shradski et al.，1998，Genomics 49，188-192)。

将处理的小鼠(18-25g)单独放在圆形的塑料室(直径为14.5cm，高度为30cm)中，暴露于110-dB、11-KHz的声音20秒。当引起后肢完全强直性伸展时，对痉挛评分，其中没有表现出后肢强直性伸展的那些小鼠归类为受保护。根据White et al.，1992，Epilepsy Res 12：217-226L报道的评分表来定量痉挛的严重程度：无反应，0；狂奔＜10秒，1；狂奔＞10秒，2；阵挛，3；前肢伸展/后肢弯曲，4；以及前肢和后肢伸展，5。

将滚轮测试(rotorod test)用于评估由处理引起的可能的运动损伤。训练测试个体在旋转杆(直径为1英寸，6rpm)上连续走动2分钟。测试期间，给动物3次机会来在滚筒上连续保持1分钟。以在单次试验中测试个体在转动杆上不能保持1分钟认定是神经学上的损伤。AG-0的剂量需要引起50％测试个体的抗惊厥效应(ED50)，根据Litchfield and Wilcoxon，1949(J.Pharmacol.Exp.Ther.96，99-105)的方法，利用商购的计算机程序(PHARM/PCS；MicroComputer Specialists)，计算其相关的95％置信区间。

CRE依赖的转录分析

利用Lipofectamine 2000(基于阳离子脂质体的试剂)(Invitrogen)按照ACM脂质体法，用与CREB活化连接的荧光素酶报告基因(Cre-Luc)转染新鲜分离的胚胎皮层神经元。接着将所转染的细胞以每孔1.3x10⁵细胞的密度接种到PDL包被的48孔板(NUNC)，在含B27补充物的Neurobasal培养基中培养7-12天(7-12DIV)。利用每孔1μL Lipofectamine 2000和0.4μg DNA进行转染。然后用测试样品处理神经元6小时的时间。处理之后，将细胞用冰冷的DPBS清洗并添加100μL的1倍荧光素酶裂解缓冲液(Promega)。将平板放置于-20℃使细胞冷冻，之后使它们解冻以促进裂解。将裂解物转移到白色底的平板上，利用荧光素酶分析试剂盒(Promega)来分析海肾荧光素酶。神经元中CREB活化的增多导致荧光素酶产生增强，这利用Promega GloMax^TM 96微孔板发光检测仪来定量。数据与DMSO介质对照相比，以平均值±SEM表示。使用学生t-检验进行统计分析。BDNF和咯利普兰用作阳性对照。

虽然为清楚理解的目的，上述发明已以说明和示例的方式相当详细地进行了描述，但是本领域技术人员将理解的是，在所附权利要求的范围内可实施某些改变和修饰。此外，本文所提供的每篇文献通过引用全文并入，程度如同每篇文献通过引用单独并入一样。当本申请与本文所提供的文献之间存在分歧时，以本申请为主。