破骨细胞培养试剂盒及制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种破骨细胞培养试剂盒及制备方法和应用。本发明人经研究发现骨髓单核巨噬细胞在-80℃冻存1年内，其向破骨细胞分化能力未有改变，即一次性获取足够数量骨髓单核巨噬细胞后，即可分装冻存，根据实验需要随时复苏细胞用于破骨细胞培养，省去了现有破骨细胞诱导法的动物原代取材步骤。本发明试剂盒操作简捷，在较短时间内（一周）即可获得大量具有骨吸收能力的破骨细胞。该试剂盒所培养的破骨细胞可应用于破骨细胞相关的生物学和分子生物学实验，还可应用于筛选骨吸收的抑制剂和促进剂等药物的研发以及与破骨细胞相关疾病的发病机制研究。

说明书

技术领域

本发明涉及一种破骨细胞培养试剂盒及其制备方法和应用，具体地说涉及一种 利用细胞冻存技术长期保持骨髓单核巨噬细胞向破骨细胞分化的能力；在此基础 上，再联合细胞因子诱导培养破骨细胞的方法。属于医学与生物技术领域。

背景技术

目前，破骨细胞（Osteoclast，OC）是机体内唯一具有骨吸收功能的细胞。在 骨代谢过程中，破骨细胞与成骨细胞相互协作，保障骨重建顺利进行，维持骨代谢 的动态平衡。破骨细胞缺失或功能异常均能导致骨代谢疾病，如骨质硬化和骨质疏 松等；除此之外，破骨细胞还参与肿瘤、炎症和自身免疫性疾病的发生、发展，影 响疾病的转归和预后。

近二十年来，体外培养破骨细胞方法主要应用于如下研究领域：一、研发破骨 细胞生成和功能促进剂和抑制剂，人们正在不断努力尝试把上述发现应用到代谢性 和免疫性骨病的临床治疗；二、将破骨细胞引入骨组织工程领域，将其与成骨细胞 共同种植于矿化支架上，改善了组织工程化骨的重建结构；三、不断发现新的破骨 细胞生物标志物应用于临床，用来监测骨吸收状态，反映机体骨代谢稳态；四、应 用于代谢性和免疫性骨病的发病机制研究中，极大的促进了骨骼疾病分子发病机制 研究进展。综上所述，建立体外破骨细胞培养方法是在细胞与分子水平研究各种因 素（激素、细胞因子和环境元素等）影响骨吸收机制的基础，也是研究代谢性骨病 （骨硬化症、骨质疏松症等）、肿瘤、炎症和自身免疫性疾病发病机制和治疗药物 的有效手段。

破骨细胞体外培养开始于20世纪80年代，Chambers首先成功地从兔四肢骨 分离培养出成熟破骨细胞（吕明波,陈克明,刘兴炎.国际骨科学杂志,2006年9月,第 27卷,第5期:308页-310页）。但是，由于破骨细胞在动物体内数量少、体积大、 紧贴骨髓腔内表面生长、胞体分离时容易损伤，分离后不易培养；而且，分离法获 得的是终末期破骨细胞，难以用于进行分化和增殖方面的研究。近年来，随着分子 生物学和干细胞技术等领域的进展，发现破骨细胞由造血干细胞系中的单核巨噬细 胞分化发育而来。人们进一步研究发现，骨髓、脾脏和外周血来源的单核细胞在含 有诱导剂核因子kB受体活化子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） 培养基中培养就能诱导生成破骨细胞。培养法所得细胞具有破骨细胞的典型特征： 单个细胞所含细胞核数≥3个；抗酒石酸性磷酸酶（TRAP）组化阳性；在体外破骨 细胞可以降解骨片、象牙片或者人工骨组织等钙化成分，形成吸收性陷窝（Duplomb L,Dagouassat M,Jourdon P，Heymann D.Stem Cells.2007Mar;25(3):544-52.）。但是， 诱导培养法也有如下缺点：（1）外周血单核细胞诱导培养法。外周血中造血干祖细 胞细胞数目极少，破骨细胞的获得效率较低。（2）脾脏细胞诱导培养法。该法操作 步骤繁琐，需要无菌摘取脾脏，研磨后获取脾细胞悬液，然后使用淋巴细胞分离液 制备单核细胞悬液，但其中所含的造血祖干细胞含量很少，需要进一步在细胞因子 作用增殖数天后获得足够数量的单核细胞用于破骨细胞诱导实验。（3）骨髓诱导培 养法。近年来，人们通过细胞差异贴壁法，把骨髓细胞中的内皮细胞、脂肪细胞、 成纤维细胞等杂细胞剔除，获得纯度较高的骨髓单核细胞，从而使破骨细胞纯度和 数量有了显著提高，可以模拟骨髓微环境对破骨细胞分化发育的影响。但是，骨髓 细胞的获得需剥离动物肌肉，分离出长骨，然后反复冲洗骨髓，操作费时费力。

除了上述细胞培养方法外，还有把骨髓间充质干细胞与单核细胞联合细胞因子 共培养破骨细胞的方法。该法是先提取骨髓中的间充质干细胞，经过4至6代的增 殖（大概需要12天），然后与从脾脏分离获得的单核细胞在含有细胞因子的培养基 中共培养，再经过3至15天，才能获得破骨细胞。该法实质是把骨髓诱导破骨细 胞培养法和脾细胞诱导法相结合，使破骨细胞培养步骤更加繁琐，实验周期延长（专 利申请号：200710120072.X）。

目前，诱导培养法由于其能观察处理因素对破骨细胞分化、生长和增殖的作用， 是进行破骨细胞研究主流细胞培养方法。但由于其实验操作步骤繁琐，对实验操作 者有较高的实验技能要求，限制了该技术的广泛应用。因此，开发一种操作简捷、 长期稳定和经济实用的破骨细胞培养试剂盒是开展破骨细胞相关研究的迫切需要。

经检索，到目前为止，还没有发现一种操作简捷、破骨细胞得率高的培养试剂 盒及其制备方法。

发明内容

本发明的目的在于克服了现有技术中操作步骤繁琐，费时费力等缺点，提供了 一种操作简捷、长期稳定和经济实用的破骨细胞培养试剂盒及制备方法和应用。

发明人经研究发现骨髓单核巨噬细胞在-80℃冻存1年内，其向破骨细胞分化能 力未有改变，即一次性获取足够数量骨髓单核巨噬细胞后，即可分装冻存，根据实 验需要随时复苏细胞用于破骨细胞培养，省去了现有破骨细胞诱导法的动物原代取 材步骤。

本发明提供的一种破骨细胞培养试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包括如下三 个试剂：试剂A，即冻存的骨髓单核巨噬细胞；试剂B，即骨髓单核巨噬细胞培养 液和试剂C，即破骨细胞诱导培养液；

其中，试剂A为-80℃冻存的雄性C57BL/6小鼠骨髓单核巨噬细胞；

其中，试剂B是通过将M-CSF、胎牛血清和青链霉素溶于α-MEM培养液中制 备得到；

其中，试剂C是通过将RANKL、M-CSF、胎牛血清和青链霉素溶于α-MEM 培养液中制备得到。

在本发明中，优选的，试剂B中各组分终浓度为M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的 体积百分数为10％，青链霉素浓度为100U/ml。

在本发明中，优选的，试剂C中各组分终浓度为RANKL 100ng/ml，M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的体积百分数为10％，青链霉素浓度为100U/ml。

在本发明中，优选的，试剂A，即冻存的骨髓单核巨噬细胞，是按照以下方法 的制备得到：从已脱颈处死的雄性C57BL/6小鼠身上无菌取出股骨和胫骨，剥净其 上软组织，减去骨两端，用吸满α-MEM培养液的5ml注射器从骨的一端插入骨髓 腔，冲洗出腔内红色骨髓块；用玻璃吸管轻轻吹打骨髓细胞液以获得单一细胞悬液； 用含10%胎牛血清和100U/ml青链霉素的α-MEM培养液清洗2次，重悬后，接种 于6孔培养板内，培养条件为37℃，5%CO₂，孵育24小时，收集未贴壁细胞， 将所得细胞悬液，800转/min，离心5min，弃去上清液，根据细胞团大小添加适量 冻存液，重悬后，分装于细胞冻存管内，所得细胞即为骨髓单核巨噬细胞；细胞冻 存管在4℃，放置2h，然后转到-20℃，冻存4h，最后于-80℃长期保存。

进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的破骨细胞培养试剂盒在诱导或培 养破骨细胞中的应用。

一种利用本发明所述的试剂盒诱导或培养破骨细胞的方法，其特征在于包括以 下步骤：

（1）复苏试剂A中的细胞；

（2）将复苏的试剂A中的细胞，即骨髓单核巨噬细胞以1×10⁵个/孔接种于96 孔板内，用试剂B培养3天后，换液，更换为试剂C，每3天使用试剂C换液一次， 即可达到诱导或培养破骨细胞的目的。

在本发明中，优选的，步骤（1）中所述的复苏包括将试剂A的冻存管置于42℃ 水浴中，并不时摇动，使其快速解冻融化，然后在无菌条件下取出细胞，1000转/min， 离心5分钟，弃去上清液，加入适量α-MEM培养液，重悬细胞，重复上述步骤一 次，以达到去除细胞冻存液以及复苏细胞的目的。

按照本发明方法在试剂C培养3天时即有破骨细胞出现，培养5-6天就能获得 大量体积较大、成熟的破骨细胞。

上述细胞因子RANKL（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，核因 子κB受体活化因子配体）和M-CSF（macrophage colony stimulating factor,巨噬细 胞集落刺激因子）均能在市场上购得。干粉状细胞因子的溶解方法，按试剂生产厂 家说明书操作。上述培养液、青链霉素及培养板等均可以从市场上购买。

相较于现有技术，本发明所具有的优点和有益效果是：

（1）本发明方法简化了破骨细胞诱导法操作步骤。一次性获取足够数量骨髓 单核巨噬细胞后，即可分装冻存，根据实验需要随时复苏细胞用于破骨细胞培养；

（2）本发明方法所得破骨细胞数量多，可以满足相关细胞生物学和分子生物 学实验的要求；

（3）本发明方法培养的破骨细胞分化成熟度高，骨片吸收能力强，能够用于 进行破骨细胞功能的研究；

（4）本发明方法所用试剂和材料均可在市场上购得，简便易行。

附图说明

图1为试剂A（冻存的骨髓单核巨噬细胞）在-80℃冻存0月、3月、6月和12 月时，诱导培养获得的破骨细胞形态比较；

图2为试剂A（冻存的骨髓单核巨噬细胞）在-80℃冻存0月、3月、6月和12 月时，诱导培养获得的破骨细胞骨片吸收实验结果。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施 例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1破骨细胞培养试剂盒的制备

1、药品及其来源

α-MEM培养液（α-Minimal essential medium，货号：SH30265.01B)、青链霉素 （货号：SV30010）、胎牛血清（fetal bovine serum（FBS)货号：SV30087.01）购 自Thermo Scientific HyClone Company(USA)；

M-CSF（货号：315-02）、RANKL（货号：315-11）购自美国peprotech公 司。

2、方法

（1）试剂A，即冻存的骨髓单核巨噬细胞的制备

从已脱颈处死的雄性C57BL/6小鼠身上无菌取出股骨和胫骨，剥净其上软组织， 减去骨两端，用吸满α-MEM培养液的5ml注射器从骨的一端插入骨髓腔，冲洗出 腔内红色骨髓块；用玻璃吸管轻轻吹打骨髓细胞液以获得单一细胞悬液；用含10% 胎牛血清和100U/ml青链霉素的α-MEM培养液清洗2次，重悬后，接种于6孔培 养板内，培养条件为37℃，5%CO₂，孵育24小时，收集未贴壁细胞，将所得细 胞悬液，800转/min，离心5min，弃去上清液，根据细胞团大小添加适量冻存液， 重悬后，分装于细胞冻存管内，所得细胞即为骨髓单核巨噬细胞；细胞冻存管在4℃， 放置2h，然后转到-20℃，冻存4h，最后于-80℃长期保存。

（2）试剂B，即骨髓单核巨噬细胞培养液的制备

将M-CSF、胎牛血清和青链霉素溶于α-MEM培养液，使得试剂B中各组分终 浓度为M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的体积百分数为10%，青链霉素浓度为100U/ml。

（3）试剂C，即破骨细胞诱导培养液的制备

将RANKL、M-CSF、胎牛血清和青链霉素溶于α-MEM培养液中，使得试剂C 中各组分终浓度为RANKL 100ng/ml，M-CSF 30ng/ml，胎牛血清的体积百分数为 10％，青链霉素浓度为100U/ml。

（4）将试剂A、试剂B以及试剂C组装成试剂盒，-80℃保存。

实施例2用本发明试剂盒培养的破骨细胞的抗酒石酸性磷酸酶（TRAP）染色 实验

试剂A（冻存的骨髓单核巨噬细胞）分别在-80℃冻存0月、3月、6月和12 月时，分别将试剂A的冻存管置于42℃水浴中，并不时摇动，使其快速解冻融化， 然后在无菌条件下取出细胞，1000转/min，离心5分钟，弃去上清液，加入适量 α-MEM培养液，重悬细胞，重复上述步骤一次，以达到去除细胞冻存液的目的； 将复苏的试剂A中的细胞，即骨髓单核巨噬细胞以1×10⁵个/孔接种于96孔板内， 用试剂B培养3天后，换液，更换为试剂C，每3天使用试剂C换液一次。在培养 第5天时，终止实验，每组做5个平行孔。使用TRAP染色试剂盒（购自中国上海 太阳生物公司）进行破骨细胞TRAP染色。TRAP染色阳性细胞表现为含有红色颗 粒状物质。TRAP染色阳性并且细胞核大于等于3个的细胞计数为破骨细胞。光学 显微镜下观察形态并拍照。

结果本发明方法冻存的骨髓单核巨噬细胞在-80℃冻存12个月内向破骨细胞的 分化能力无差异。由图1可以看到，各时间点破骨细胞形态无差别，均表现为细胞 体积大，所含细胞核数可达数十个，TRAP染色阳性。由表1可见，各时间点破骨 细胞形成数量无统计学差异（F=3.345，P=0.064）。

表1破骨细胞计数结果

实施例3用本发明试剂盒培养的破骨细胞的骨片吸收实验

将直径为6mm的牛骨切片（购自英国IDS公司）放置于96孔培养板孔内，超 净台内紫外照射1小时消毒，培养液清洗3次。分别将-80℃冻存0月、3月、6月 和12月时的试剂A的冻存管置于42℃水浴中，并不时摇动，使其快速解冻融化， 然后在无菌条件下取出细胞，1000转/min，离心5分钟，弃去上清液，加入适量 α-MEM培养液，重悬细胞，重复上述步骤一次，以达到去除细胞冻存液的目的； 将复苏的试剂A中的细胞，即骨髓单核巨噬细胞以1×10⁵个/孔接种于96孔板内， 用试剂B培养3天后，换液，更换为试剂C，每3天使用试剂C换液一次。在培养 第5天时终止实验。取出骨片，0.25mol/L氢氧化铵超声清洗5min×3次，使用1% 甲苯胺蓝染液室温染色1－2min，蒸馏水清洗，室温晾干后在光学显微镜下观察。 每组做3个平行孔。

结果本发明方法所得的破骨细胞在牛骨切片上能够形成骨吸收陷窝，而且，各 冻存时间点培养所得的破骨细胞骨吸收能力无明显差异（见图2）。证实本发明获得 的破骨细胞具有骨吸收能力，且本发明的冻存方法对破骨细胞的功能无影响。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性 的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进 行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。