一种mPEG化盐酸表阿霉素磁性脂质体的制备方法

摘要

本发明涉及脂质体，具体公开了一种制备mPEG化盐酸表阿霉素磁性脂质体的方法。通过简单沉淀法制备纳米四氧化三铁，乙醇注入法制备空白mPEG化磁性脂质体，硫酸铵梯度法包载盐酸表阿霉素。通过透射电镜表征，制备的mPEG化盐酸表阿霉素纳米磁性脂质体体颗粒为近球形，平均粒径约为50nm，所制备的脂质体具有较好的包封率、体外稳定性和缓释效果。本发明制备工艺简便，成本低廉，易于进行规模制备。

说明书

技术领域

    本发明涉及脂质体，特指一种以乙醇注入法结合硫酸铵梯度法制备mPEG化盐酸表阿霉素磁性脂质体的方法，尤其是一种制备工艺简单，成本低廉，产品具有良好包封率和稳定性的纳米磁性阿霉素脂质体的制备方法。

技术背景

脂质体是指采用类脂质双分子层将药物包封于内而形成的类似微型胶囊的超微型球状制剂，自从上世纪60 年代，有人首先将脂质体作为药物载体以来, 脂质体由于其具有高度的靶向性、能有效保护被包裹药物并可控释、缓释药物等特殊优势, 已成为国际医药界研究的热点；四氧化三铁纳米微粒是一种具有反尖晶石结构的磁性材料，因其独特的磁性可调性能被人们广泛研究和应用，近年来，四氧化三铁被广泛应用于磁共振成像、给药系统、生物医药、生物传感器等系统中；但是，由于单独的磁性粒子生物相容性差，易团聚等原因，副作用小的物质包覆的磁性粒子正逐渐取代单独的磁性粒子应用于生物体内，因此将四氧化三铁纳米微粒包埋于生物相容性良好的脂质体内，作为磁靶向给药系统的磁性材料，具有很好的应用前景。

盐酸表阿霉素（Doc）是一种广谱的蒽环类化疗药物，抗癌谱广，疗效显著，可治疗多种肿瘤，但该药严重的毒副作用，尤其是严重的心脏损害、骨髓抑制等副反应限制了它在临床上的应用；将药物包封于脂质体内，可以有效保护被包裹药物、提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量、降低药物的毒副作用、减轻变态反应及免疫反应并延缓药物释放；研究结果表明，脂质体包裹阿霉素的毒性比游离药物的毒性降低50％～70％，为避免脂质体易被网状内皮系统识别而被吞噬, 延长阿霉素脂质体的体内循环时间, 可采用亲水性高分子链对脂质体表面进行修饰，磁性脂质体是近年来国内外大力研究的一种新型靶向制剂，这种制剂可使药物同时具有生物功能、主动磁靶向功能和治疗功能，因此具有更大的应用前景；但是目前的磁性脂质体大都存在着许多不可避免的缺点，例如体内循环时间短，物理和化学稳定性不足，囊泡表面缺少靶向位点及磁性脂质体水溶液中分散性不好等，因此，开发一种具有优良性能的盐酸表阿霉素磁性长循环磁性脂质体势在必行。

发明内容

本发明目的是提供一种以乙醇注入法结合硫酸铵梯度法制备mPEG化盐酸表阿霉素磁性脂质体的方法。

本发明通过以下步骤实现：

（1）纳米四氧化三铁的制备：

在搅拌条件下，将氯化高铁和氯化亚铁加入除氧的蒸馏水中得到混合溶液1，其中氯化高铁与氯化亚铁的质量比为2.90-2.95：1，逐滴滴入氨水直至待混合溶液1变为黑色后，采用氢氧化纳溶液调节混合溶液1的pH为10，在氮气保护下80 ℃回流2 h，反应结束后，过滤后用蒸馏水洗涤2-3次，得到纳米四氧化三铁。

所述混合溶液1中氯化高铁浓度为0.01-0.02 mol/L。

所述氨水的浓度为2 mol/L。

所述蒸馏水采用加热煮沸的方法除氧。

所述的纳米四氧化三铁的粒径范围为10-30 nm。

所述的氢氧化纳溶液浓度为1mol/L。

（2）mPEG化盐酸表阿霉素纳米磁性脂质体的制备：

称取卵磷脂、胆固醇、mPEG和纳米四氧化三铁，超声溶于无水乙醇中得到混合溶液2，卵磷脂、胆固醇、mPEG与纳米四氧化三铁的质量比分别为50:1、6.25:1-12.5:1、5:1-15:1；将混合溶液2缓慢注入0.1 mol/L硫酸铵水溶液中得到混合溶液3，无水乙醇和硫酸铵溶液的体积比为3:5；将混合溶液3于30℃水浴超声30 min，60 ℃减压旋转蒸发直至不能闻到乙醇味，制得空白脂质体；将空白脂质体装入透析袋中，用PBS溶液透析24 h，透析后的空白脂质体中加入盐酸表阿霉素，盐酸表阿霉素与卵磷脂质量比为1:165-1:200，置于55 ℃水浴孵化30 min，使用两层0.2μm微孔滤膜过滤脂质体，控制脂质体大小，并滤去未包封住的颗粒，即得磁性盐酸表阿霉素脂质体，4℃冷藏保存。

所述的微孔滤膜的孔径为0.2μm。

所述混合溶液2中纳米四氧化三铁浓度控制在0.0005-0.001 mol/L。

采用透射电镜观察所制得磁性盐酸表阿霉素脂质体的形貌和粒径；通过外加磁场的作用，考察所制得磁性盐酸表阿霉素脂质体的体外磁响应性。

附图说明

图1 按照实施例1制备的纳米四氧化三铁的TEM照片，所制备的纳米四氧化三铁粒径范围为10-30 nm，分散性较好；

图 2 按照实施例1制备的纳米磁性阿霉素脂质体的透射电镜照片，盐酸表阿霉素长循环磁性脂质体颗粒圆整、平均粒径约为50 nm；

图 3 按照实施例1制备的mPEG化盐酸表阿霉素纳米磁性脂质体被外磁场吸引照片；磁性脂质体(a)在3min 内迅速聚集在磁铁一侧(b)，表明所制备的mPEG化盐酸表阿霉素纳米磁性脂质体具有良好的磁响应性。

具体实施方式

实施例1 

在搅拌条件下，在搅拌条件下，将0.5 g 氯化高铁和0.17 g 氯化亚铁加入150 mL 除氧的蒸馏水中，缓慢滴入2 mol/L的氨水，待反应物变为黑色后，利用1mol/LNaOH溶液调节pH为10，在氮气保护下80 ℃回流2 h，反应结束后，蒸馏水洗涤2-3次，过滤后用蒸馏水洗涤2-3次，得到纳米四氧化三铁。

称取0.1 g 卵磷脂，0.025 g 胆固醇，0.02 g mPEG、2mg Fe₃O₄纳米颗粒，超声溶于15mL无水乙醇得到混合溶液2，将混合溶液2缓慢注入25mL 0.1 mol/L硫酸铵水溶液中得到混合溶液3，将混合溶液3于30℃水浴超声30 min，60 ℃减压旋转蒸发直至不能闻到乙醇味，制得空白脂质体；将空白脂质体装入透析袋中，用PBS溶液透析24 h，透析后的空白脂质体中加入0.55 mg盐酸表阿霉素，置于55 ℃水浴孵化30 min，使用两层0.2μm微孔滤膜过滤脂质体，控制脂质体大小，并滤去未包封住的颗粒，即得磁性盐酸表阿霉素脂质体，4℃冷藏保存。

采用透射电镜观察所制得磁性盐酸表阿霉素脂质体的形貌和粒径；通过外加磁场的作用，考察所制得磁性盐酸表阿霉素脂质体的体外磁响应性。

实施例2 

在搅拌条件下，在搅拌条件下，将1.08g 氯化高铁和0.37 g 氯化亚铁加入200 mL 除氧的蒸馏水中，缓慢滴入2 mol/L的氨水，待反应物变为黑色后，利用1mol/LNaOH溶液调节pH为10，在氮气保护下80 ℃回流2 h，反应结束后，蒸馏水洗涤2-3次，过滤后用蒸馏水洗涤2-3次，得到纳米四氧化三铁。

称取0.1 g 卵磷脂，0.0125 g 胆固醇，0.01 g mPEG、2mg Fe₃O₄纳米颗粒，超声溶于15mL无水乙醇得到混合溶液2，将混合溶液2缓慢注入25mL 0.1 mol/L硫酸铵水溶液中得到混合溶液3，将混合溶液3 于30℃水浴超声30 min，60 ℃减压旋转蒸发直至不能闻到乙醇味，制得空白脂质体；将空白脂质体装入透析袋中，用PBS溶液透析24 h，透析后的空白脂质体中加入0.60 mg盐酸表阿霉素，置于55 ℃水浴孵化30 min，使用两层0.2μm微孔滤膜过滤脂质体，控制脂质体大小，并滤去未包封住的颗粒，即得磁性盐酸表阿霉素脂质体，4℃冷藏保存。

实施例3 

在搅拌条件下，在搅拌条件下，将0.5 g 氯化高铁和0.17 g 氯化亚铁加入150 mL 除氧的蒸馏水中，缓慢滴入2 mol/L的氨水，待反应物变为黑色后，利用1mol/LNaOH溶液调节pH为10，在氮气保护下80 ℃回流2 h，反应结束后，蒸馏水洗涤2-3次，过滤后用蒸馏水洗涤2-3次，得到纳米四氧化三铁。

称取0.15 g 卵磷脂，0.03 g 胆固醇，0.045 g mPEG、3 mg Fe₃O₄纳米颗粒，超声溶于15mL无水乙醇得到混合溶液2，将混合溶液2缓慢注入25mL 0.1 mol/L硫酸铵水溶液中得到混合溶液3，将混合溶液3 于30℃水浴超声30 min，60 ℃减压旋转蒸发直至不能闻到乙醇味，制得空白脂质体；将空白脂质体装入透析袋中，用PBS溶液透析24 h，透析后的空白脂质体中加入0.75 mg盐酸表阿霉素，置于55 ℃水浴孵化30 min，使用两层0.2μm微孔滤膜过滤脂质体，控制脂质体大小，并滤去未包封住的颗粒，即得磁性盐酸表阿霉素脂质体，4℃冷藏保存。