一种利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法

摘要

本发明属于维生素C生物发酵技术领域，具体的说是Vc第二步生物发酵中一种利用混合菌生物发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸的方法。Vc二步发酵生产工艺的种子液逐级扩大，发酵培养时将A菌系和B菌系的种子液，以体积百分比15-20％的总接种量接入发酵罐中发酵培养至发酵终点（即至发酵液中残余山梨糖浓度≤1mg/ml），实现利用混合菌发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸;其中A菌系由伴生菌蜡样芽孢杆菌/伴生菌巨大芽孢杆菌与产酸菌生酮基古龙酸菌组成；B菌系由伴生菌苏云金芽孢杆菌和产酸菌生酮基古龙酸菌组成；采用本发明的三菌混合发酵新方法，发挥了两种伴生菌的各自优势，可缩短发酵周期6-8小时，降低能耗10-15％，提高发酵转化率2-4％。

说明书

技术领域

本发明属于维生素C生物发酵技术领域，具体的说是Vc第二步生物发 酵中一种利用混合菌生物发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法。

背景技术

Vc二步发酵的工业化生产，其第二步发酵为两种菌的混合发酵，实现 从L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸的生物转化。两种菌包括具有产酸能力的 细菌-普通生酮基古龙酸菌（俗称产酸菌或小菌）和不具有转化产酸能力但 却能促进小菌生长和产酸的伴生菌（俗称大菌）。已有研究结果表明，普通 生酮基古龙酸菌单独培养传代存活率及产2-酮基-L-古龙酸能力均较弱，只 有与伴生菌混合培养时才能快速生长和产酸。但是，伴生菌的种类、数量 和生长特性对小菌的生长和产酸具有重要影响，进而改变着维生素C第二 步发酵的效率。

目前，生产上应用的伴生菌主要有蜡状芽孢杆菌(Bacills cereus)、 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和苏云金芽孢杆菌(Bacills thuringiensis)等，且仅用其中一种伴生菌与产酸菌搭配进行两种菌的混 合发酵产酸。因为一株伴生菌的高效伴生能力持续时间较短，难以在发酵 的整个阶段持续提供充足的效应物，所以，产酸菌的产酸能力在发酵过程 中无法长期保持在最佳状态，使得第二步混菌发酵的效率难以得到有效提 高。另外，由于检测结果的滞后和种子液多级扩大过程的复杂，二步混菌 发酵的大罐常出现染菌和染噬菌体的现象，噬菌体杀死伴生菌，使得伴生 因子不能满足产酸菌生长和发酵产酸，导致发酵速度明显降低甚至发生放 罐情况，严重影响了古龙酸的产量，并造成大量能耗和材料损失。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L- 古龙酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种利用三种菌混合发酵转化山梨糖2-酮基-L-古龙酸的方法Vc二步发 酵生产工艺的种子液逐级扩大，发酵培养时将A菌系和B菌系的种子液， 以体积百分比15-20％的总接种量接入发酵罐中发酵培养至发酵终点（即至 发酵液中残余山梨糖浓度≤1mg/ml），实现利用混合菌发酵转化山梨糖为2- 酮基-L-古龙酸;

其中A菌系由伴生菌蜡样芽孢杆菌/伴生菌巨大芽孢杆菌与产酸菌生酮 基古龙酸菌组成；B菌系由伴生菌苏云金芽孢杆菌和产酸菌生酮基古龙酸菌 组成。

所述A菌系和B菌系的种子液按体积比2:1～10:1的比例混合接入发 酵罐。

将所述两种菌系分别加入到发酵罐中，两种先后加入的菌系在20小时 内接种到发酵罐中使总接种量达到15-20％。

所述在Vc二步发酵过程中A菌系和B菌系经过连续三级种子扩大培养， 继而得到的三级种子液再接种于发酵罐；其中A菌系和B菌系连续三级种 子扩大培养分别为以体积比1-5％、5-10％和5-10％的接种量分别作为三级种 子扩大培养的各级接种量，同时各级培养温度为27-31℃，发酵时间在6-14 小时，通风量为1:0.8-1.0（溶氧比为25-30％）；每级种子达到种液中古龙 酸含量达3.0-10.0mg/ml，转种到下一级。

将连续扩大培养的A菌系和B菌系的三级种子液接种于发酵罐中，在 27-31℃、罐压0.005-0.02Mpa，pH 6.0-8.0下进行发酵培养,发酵过程中 流加L-山梨糖，直至发酵液中残余山梨糖浓度≤1mg/ml，从而实现利用混 合菌发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸。

所述发酵过程中间断或连续的流加底物L-山梨糖，流加速率为2-10m³/ 小时，至发酵液中山梨糖终浓度达7-10mg/ml。

本发明具有如下优点

1.本发明实现三菌混合发酵转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸，可缩短发 酵周期6-8小时，降低能耗10-15％，提高发酵转化率2-4％。

2.本发明的工艺简便，不需要添置大型设备，也不需要对现有设备进 行过多改造。

3.本发明实现Vc二步发酵的三菌混合培养，两种伴生菌可提供持续有 效的伴生效应物，从而使小菌生长和产酸处于最佳状态，杜绝了二步发酵 过程中因效应物不足出现小菌产酸效率不高的现象，使其发酵转化得以持 续高效进行。

4.本发明的三菌混合培养，其中两种伴生菌的生长和繁殖特性不同，A 菌系前期生长快，B菌系后期生长快，两种伴生菌共同培养，可以有效弥补 在发酵过程中因一种伴生菌数量不足而导致的发酵效率低下。

5.本发明的三菌混合发酵，两种伴生菌同时存在于发酵液中，增强了 发酵过程中对染噬菌体的抗性，减少了因染噬菌体而放罐的现象，提高了 发酵效率。

6.本发明基于Vc二步发酵伴生菌与产酸菌的相互作用机理及各自生长 和代谢特性的差异，采用不同发酵菌系种液按比例共同接入大罐发酵的模 式，完成2-酮基-L-古龙酸的高效发酵。

具体实施方式

实施例1

从斜面种液中分别取由蜡样芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的A菌系 和由苏云金芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的B菌系，分别以5％（体积比） 作为三级连续扩增的种液的接种量，分别接种于不同等级的种子培养基中 （种子培养基，按重量百分比计蛋白胨0.3％，牛肉膏0.3％，酵母膏0.3％， 玉米浆0.3％，MgSO₄ 0.01％，FeSO₄ 0.01％,L-山梨糖2％，pH 7.0,琼脂2.5％， 余量为水；121℃高温灭菌20min；待用。），分别摇瓶培养20小时至不同等 级发酵液中古龙酸产量在8-10mg/ml，转种到下一级；

在上述种子液经三级扩大培养后，分别取A种子液2.4ml和B种子液 0.8ml，共3.2ml接入装有20ml发酵培养基（培养基配方：按重量百分 比计玉米浆，1.5％，尿素1.2％，山梨糖8％，MgSO₄ 0.01％,蒸馏水定容至1000ml, 调节pH至7.0，121℃高温灭菌20min）的三角瓶中，以29℃，罐压 0.005-0.02Mpa，150转/分下振荡培养38小时，发酵过程中流加L-山梨糖， 直至发酵液中残余山梨糖浓度≤1mg/ml，从而实现利用混合菌发酵转化山 梨糖为2-酮基-L-古龙酸。最终发酵液中古龙酸值达68.0mg/ml，转化率达 94.4％。

实施例2-4

应用例1

选0.5吨发酵罐，加入含8％L-山梨糖的常规Vc二步发酵培养基300升， 分别接种经连续三级扩大培养的由蜡样芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的 A菌系种子液45升和由苏云金芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组成的B菌系种 子液15升，于29℃，通风1:0.8-1.0（液V：气V/分，溶氧比为25-30％） 发酵36小时，最终发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量为67.89mg/ml,转化率 达94.3％。

应用例2

4吨发酵罐中投加含L-山梨糖8％的常规Vc二步发酵培养基2.2吨，分 别接种0.3吨经连续三级扩大培养的由蜡样芽孢杆菌和生酮基古龙酸菌组 成的A菌系种子液和0.1吨经连续三级扩大培养的由苏云金芽孢杆菌和生 酮基古龙酸菌组成B菌系种子液，在29℃，通风1:0.8-1.0，发酵34小时， 最终发酵液中发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量为68.27mg/ml,转化率达 94.8％。