制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法

摘要

本发明提供制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，涉及基因工程领域。该方法包括如下步骤：采用融合PCR方法，得到由待敲除靶基因上下游片段组成的同源重组片段；将同源重组片段插入pSET4S质粒，然后电转化至猪链球菌GZ0565株的感受态细胞进行同源重组，筛选猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株。本发明提供的制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，筛选效率高，得到的猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株，敲除了靶基因，但是不含有抗性基因，因此具有成为疫苗株的潜能。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法。

背景技术

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种革兰氏阳性菌，在全世界广泛分布，可以引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡，也可导致生猪从业人员感染和死亡。国内外对猪链球菌毒力因子及致病机理进行广泛而深入研究。基因缺失是研究基因功能、阐明致病机理的重要手段。目前，现有技术中猪链球菌缺失株留有抗性基因。抗性基因的存在有可能影响缺失株的特性，并有潜在的生物安全隐患。理想的缺失应该是无痕的，最终无抗性基因。它有以下优点：首先，它没有抗性基因的残留；其次, 可在无痕缺失的基础上，构建双缺失，甚至更多缺失；第三，可用无痕缺失技术进行定点突变，这有利于蛋白功能的研究；第四，由于无痕缺失株没有抗性基因，具有成为疫苗株的潜能。传统方法在制备猪链球菌缺失株的过程中，需要构建含有抗性基因（如氯霉素基因）的质粒，通过直接挑选获得双交换的缺失株。这种方法的缺点在于最终的缺失株含有抗性基因（如氯霉素基因），而且直接挑选双交换的缺失株效率很低。

发明内容

为了解决现有技术中基因缺失猪链球菌含有抗性基因及筛选基因缺失猪链球菌工作量过大等问题，本发明提供了一种制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，包括如下步骤：采用融合PCR方法，得到由待敲除靶基因上下游片段组成的同源重组片段；将同源重组片段插入pSET4S质粒，然后电转化至猪链球菌GZ0565株的感受态细胞进行同源重组，筛选猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株。

所述同源重组包括第一次同源重组和第二次同源重组；所述第一次同源重组的具体方法为：将电转化后的猪链球菌GZ0565株感受态细胞在添加有壮观霉素的THB培养基、37℃条件下培养，进行第一次同源重组，获得第一重组子；所述第二次同源重组的具体方法为：将第一重组子在THB培养基、28℃条件下培养，进行第二次同源重组，获得第二重组子。

所述筛选猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法为：以第二重组子的基因组DNA为模板，能够扩增出同源重组片段的菌株即为猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株。

在37℃条件下，所述第一重组子能够在THB培养基和含有壮观霉素的THB培养基上生长繁殖，所述第二重组子能在THB培养基上生长繁殖、不能在含有壮观霉素的THB培养基上生长繁殖。

待敲除靶基因为LysM基因时，获得同源重组片段的方法为：以猪链球菌GZ0565基因组DNA为模板，用引物LysM-A和LysM-B扩增LysM基因的上游片段，得到扩增片段1；用引物LysM-C和LysM-D扩增LysM基因下游片段，得到扩增片段2；以扩增片段1和扩增片段2为模板，用引物LysM-A和LysM-D，融合扩增同源重组片段；其中

LysM-A的序列为 ：5’- ctgatcGTCGACAAATTAGCTCCGACAGGTGT -3’，

 LysM-B的序列为 ：5’- GCCTTCAACCGTTCTTTTAAAT -3’，

 LysM-C的序列为： 5’-ATTTAAAAGAACGGTTGAAGGCACTTACAAAAATAACCGTTTCA -3’，

 LysM-D的序列为： 5’- gagtcaGAATTCGGCCCAATCTTTACCTTCTATC -3’。

有益效果

本发明提供的制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法，通过两次单交换达到双交换目的，所以大大减少了筛选工作量，提高了筛选效率。另外，该方法得到的猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株，敲除了靶基因基因，但是不含有抗性基因，因此具有成为疫苗株的潜能。采用本发明方法，可以在无痕缺失的基础上，构建双缺失，甚至更多缺失或者进行定点突变以研究蛋白功能。

附图说明

图1是本发明的原理图。其中SPC是指壮观霉素抗性基因。

图2融合PCR扩增产物电泳图，其中泳道1为DL5000 marker; 泳道2 为 片断AB; 泳道3 片断CD; 泳道4为同源重组片断AD。

图3 重组质粒LysM-AD-T的鉴定电泳图，其中泳道1 为 DL5000 marker; 泳道2和3 为重组质粒LysM-AD-T扩增产物。

图4  重组质粒LysM-AD-T的双酶切鉴定，泳道1为 DL 5000 marker; 泳道2和3为重组质粒LysM-AD-T的双酶切产物。

图5 重组质粒LysM-AD-pSET4S PCR扩增产物的电泳图，泳道1为DL5000 marker; 泳道2-25为 重组质粒LysM-AD-pSET4S的PCR产物 。

图6  重组质粒LysM-AD-pSET4S的双酶切产物电泳图，泳道1为DL 5000 marker; 泳道2为重组质粒LysM-AD-pSET4S双酶切产物。

图7敲除了LysM基因的猪链球菌GZ0565株突变株的PCR产物电泳图，其中泳道1 为DL 5000 marker；泳道3-11：敲除了LysM基因的猪链球菌GZ0565株突变株PCR产物；泳道2：GZ0565野生株阳性对照。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，进一步详细地描述本发明。应理解，下述实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1构建猪链球菌GZ0565 LysM基因无痕缺失株

LysM基因，其序列如SEQ ID NO:7所示。LysM基因的上游片段AB大小为660bp ，序列如SEQ ID NO:8所示；下游片段CD大小为709bp ，序列如SEQ ID NO:9所示。

本发明的原理见图1所示。首先应用融合PCR方法，把待敲除靶基因的上下游片段融合获得同源重组片断，连接入pSET4S质粒。重组质粒转化至猪链球菌GZ0565株感受态细胞，进行第一次同源重组（分子间）和第二次同源重组（分子内），经过挑选，获得能扩增出同源重组片断的菌株。

1. 菌株、质粒及引物

猪链球菌9型GZ0565株分离自患脑膜炎病猪，已被鉴定为强毒株。猪链球菌在THB液体培养基和THB平板培养，其中THB平板中添加了6％的绵羊血。THB液体培养基（SPC）和THB平板（SPC）为分别添加了终浓度为100μg/mL壮观霉素的THB液体培养基和THB平板。大肠杆菌DH5α在LB液体培养基和LB固体培养基培养。

本实施例中所用菌株和质粒的来源如下：

DH5 a购自TIANGEN 公司，pMD-T购自TaKaRa公司。

猪链球菌GZ0565株 ，为发明人实验室保存（Wu Z, Zhang W, Lu C: Comparative proteome analysis of secreted proteins of Streptococcus suis serotype 9 isolates from diseased and healthy pigs. Microbial pathogenesis 2008, 45(3):159-166.）

pSET4s，公开的论文信息为Takamatsu D, Osaki M, Sekizaki T: Thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus suis. Plasmid 2001, 46(2):140-148。

表1 本发明所用引物

引物序列表中位置引物序列酶切位点LysM-ASEQ ID NO:15’-ctgatcGTCGACAAATTAGCTCCGACAGGTGT-3’划线部分是SalⅠ酶切位点LysM-BSEQ ID NO:25’-GCCTTCAACCGTTCTTTTAAAT-3’ LysM-CSEQ ID NO:35’-ATTTAAAAGAACGGTTGAAGGCACTTACAAAAATAACCGTTTCA-3’粗体部分是与 LysM-B反向互补的序列LysM-DSEQ ID NO:45’-gagtcaGAATTCGGCCCAATCTTTACCTTCTATC-3’>划线部分是EcoRⅠ酶切位点LysM-XSEQ ID NO:55’-AATAAGAACTTGGCCGGCGGTG-3’ LysM-YSEQ ID NO:65’-GATGCAATGGGACGCTTCTGAC-3’ 

引物LysM-A和LysM-B用于扩增靶基因的上游臂AB；LysM-C和LysM-D用于扩增靶基因的下游臂CD；LysM-X和LysM-Y分别位于A的上游100bp和D的下游100bp左右，用于测序。LysM-A和LysM-D的前部均设计了酶切位点。LysM-C序列的前部设计了LysM-B的反向互补序列，以便AB和CD融合。

pSET4s是温度敏感性自杀质粒，含有壮观霉素抗性基因（spc）、温度敏感复制子、ColE1复制子、多克隆位点等元件。这些元件使该质粒在大肠杆菌中37℃有壮观霉素的条件下复制；而在猪链球菌中在28℃有壮观霉素的条件下复制，37℃不能复制。

猪链球菌GZ0565株感受态细胞的制备

从过夜培养的猪链球菌GZ0565平板上挑取单菌落，接种5ml的液体THB（全称为Todd–Hewitt broth，购自美国Becton, Dickinson and Company，Catalog Number 249240），37℃过夜培养。将培养的菌液1:50转接至添加终浓度为40mM DL-苏氨酸的THY培养基（THY培养基为在THB培养基中添加2%酵母提取物），在37℃、180rpm条件下培养至OD₆₀₀≈0.3～0.4。取出菌液，冰浴30min；4℃离心（8000rpm×15min）收集菌体；用20ml预冷的超纯水洗涤两次，然后20ml预冷的0.3M蔗糖洗涤两次；最后将菌体重悬于15%甘油溶液中，使细菌密度达到10¹⁰CFU/ml左右，然后分装EP管（80μL/管），-70℃冻存备用。

3.基因缺失质粒的构建

采用常规方法提取猪链球菌GZ0565基因组DNA。

（1）LysM上、下游基因的扩增和融合

设计引物时参照的基因组序列是猪链球菌ST3，GenBank accession: CP002633。

以猪链球菌GZ0565基因组DNA为模板，用引物LysM-A和LysM-B扩增LysM基因的上游片段AB，得到扩增片段1。以猪链球菌GZ0565基因组DNA为模板，用引物LysM-C和LysM-D扩增LysM基因下游片段CD，得到扩增片段2。

回收扩增片段1、扩增片段2，并以它们作为模板，用引物LysM-A和LysM-D，采用融合PCR方法扩增同源重组片段AD（不含有LysM基因）。将扩增产物进行电泳，如图2所示，AB大小为660bp，CD大小为709bp，AD大小为1369bp。

PCR获得扩增片段1和扩增片段2以及融合PCR方法的具体反应体系和循环反应参数如下：

PCR采用25μL反应体系：2×Taq PCR pfu MasterMix(TaKaRa) 12.5μL，正向引物 1.0μL；反向引物 1.0μL；ddH₂O 8.5μL；模板 2.0μL。在PCR管中加入上述各反应物，充分混匀，在自动PCR扩增仪(TaKaRa)上进行反应。循环反应参数为: 94℃ 预变性5min；94℃ 30s, 56℃ 30s ,72℃ 2min,共30个循环；最后72℃延伸10 min,保存于16℃。

（2）重组LysM-AD-T载体

将同源重组片断AD和T载体连接后得到重组质粒LysM-AD-T。

以重组质粒LysM-AD-T为模版，用引物LysM－A和LysM－D进行PCR，扩增出1369bp目的条带，如图3。将重组质粒LysM-AD-T用限制性内且酶SalI 和EcoRI在37℃条件下进行双酶切。酶切体系：重组质粒LysM-AD-T 39μL，SalI 3μL，EcoRI 3μL，10×H buffer 5μL。电泳后看到目的条带（图4）。将重组质粒LysM-AD-T导入大肠杆菌DH5 a，进行培养，提取质粒，送基因公司测序，结果显示酶切片断大小为1369bp。说明同源重组片断AD插入了T载体中。

（3）重组质粒LysM-AD-pSET4S

以导入重组质粒LysM-AD-T的大肠杆菌DH5 a为模板，以LysM-A和LysM-D为引物，PCR扩增同源重组片断AD，胶回收PCR产物。

将同源重组片断AD和pSET4S质粒分别分别用限制性内且酶SalI 和EcoRI在37℃条件下进行双酶切。酶切体系：目的片段39μL；SalI 3μL；EcoRI 3μL；10×H buffer 5μL。酶切之后用DNA回收试剂盒回收，连接,得到重组质粒LysM-AD-pSET4S。以重组质粒LysM-AD-pSET4S为模板，用引物LysM-A和LysM-D进行PCR，扩增出1369bp目的条带，如图5。对重组质粒LysM-AD-pSET4S进行双酶切，也得到目的条带1369bp，如图6。说明同源重组片断AD插入了pSET4S质粒中。

电转化

取8 μL重组质粒LysM-AD-pSET4S加入到猪链球菌GZ0565株的感受态细胞中，于冰上轻轻吹打混匀后置冰浴10min，然后转移置冰预冷的电击杯（0.1cm），设置电转参数23.5Kv/cm、200Ω和25μF进行电转化。电击结束后，立即向电击杯中加入37℃预热的添加了0.3M蔗糖的THY培养基800μL使细菌悬浮，将细菌悬浮液于37℃、180rpm振荡培养2h后，将菌液涂布于THB平板（SPC），37℃培养24-48h，获得电转化后的猪链球菌GZ0565株感受态细胞。

同源重组

（1）第一次同源重组

将电转化后的猪链球菌GZ0565株感受态细胞，放入28℃，180rpm的摇床中培养4h后加入壮观霉素，继续培养48h后，在THB液体培养基（SPC）中传三代。 LysM-AD-pSET4S是温度自杀性质粒，重组猪链球菌，在含有SPC的培养基中，28 ℃条件下生长正常，说明重组质粒LysM-AD-pSET4S已经进入感受态细胞。

将第三代菌液用生理盐水稀释至10^-5后涂THB平板（SPC），在28℃温箱中静置培养36-48h后，挑单菌落于THB液体培养基（SPC）中，28℃，180rpm的摇床中培养过夜，革兰氏染色镜检无污染后，再传至THB液体培养基（SPC），在37℃温箱中静置培养，传三代，进行第一次同源重组，获得第一重组子。在含有SPC的培养基中，37℃条件下培养，温度自杀性质粒LysM-AD-pSET4S无法复制，所以质粒LysM-AD-pSET4S只能与猪链球菌基因组DNA发生分子间同源重组。

（2）第二次同源重组

将第一重组子用生理盐水稀释至10^-5后涂THB平板（SPC），37℃温箱中培养36-48h后，挑单菌落于THB液体培养基（SPC）中，37℃温箱中过夜培养，革兰氏染色镜检无污染后，传至THB液体培养基中，28℃，180rpm，传6-7代。在28℃培养的过程中，一部分第一重组子进行了第二次同源重组，得到第二重组子。

将传6-7代后的菌液用生理盐水稀释至10^-5后分别取100μl涂THB平板（SPC）和THB平板，37℃温箱中培养24h后，对比两平板上的菌落数，如果THB平板（SPC）上的菌落数明显少于THB平板的菌落数，则进行下一步实验；如果对比不明显，则继续传代。

将THB平板上的单菌落依次在THB和THB（SPC）的平板上对应的位置上划线，37℃温箱中培养24h后，对比THB和THB（SPC）平板，在THB平板上挑取对SPC敏感的菌株即得到第二重组子。由于第一重组子的基因组DNA中有SPC抗性基，所以在37℃条件下，THB平板（SPC）和THB平板上培养均能生长繁殖。第二重组子不含抗性基因，因此只能够在THB平板生长繁殖，不能在THB平板（SPC）上生长繁殖。第二重组子分为两种情况，一种是发生第二次单交换后与野生株GZ0565相同，另外一种是发生第二次单交换后基因组DNA中敲除了LysM基因，即不含有SPC抗性基因的猪链球菌GZ0565株突变株。

6. 筛选猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株

将第二重组子接种至THB液体培养基中，37℃，180rpm的摇床中培养8h左右，以第二重组子的基因组DNA为模板，用引物LysM-X和LysM-Y进行PCR鉴定，同时以野生猪链球菌GZ0565株为对照，敲除了LysM基因的猪链球菌GZ0565株突变株（不含抗性基因）扩增出1577 bp片段，而野生猪链球菌GZ0565株则扩增出2816 bp片段（含有长度为1176 bp LysM基因及它的启动子序列63bp），如图7。

最后，将敲除了LysM基因的猪链球菌GZ0565株突变株为模板，以引物LysM-X和LysM-Y，PCR后送公司测序。结果表明序列正确，同源重组片段AD未发生突变。

       SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京农业大学

 

<120>  制备猪链球菌GZ0565株无痕缺失突变株的方法

 

<130>  20121119

 

<160>  9    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  32

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  LysM-A

 

<400>  1

ctgatcgtcg acaaattagc tccgacaggt gt                                   32

 

 

<210>  2

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  LysM-B

 

<400>  2

gccttcaacc gttcttttaa at                                              22

 

 

<210>  3

<211>  44

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  LysM-C

 

<400>  3

atttaaaaga acggttgaag gcacttacaa aaataaccgt ttca                      44

 

 

<210>  4

<211>  34

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  LysM-D

 

<400>  4

gagtcagaat tcggcccaat ctttaccttc tatc                                 34

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  LysM-X

 

<400>  5

aataagaact tggccggcgg tg                                              22

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  LysM-Y

 

<400>  6

gatgcaatgg gacgcttctg ac                                              22

 

 

<210>  7

<211>  1176

<212>  DNA

<213>  猪链球菌GZ0565株

 

<400>  7

atgaaacgta agagaacaaa taaaccacaa catatgcgtc gcaagagaaa aacacccatc     60

 

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<210>  8

<211>  660

<212>  DNA

<213>  猪链球菌GZ0565株

 

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<211>  709

<212>  DNA

<213>  猪链球菌GZ0565株

 

<400>  9

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cgtagacttt ctggctatcc ttgtaggctg ccttgtaatc cccttctgag atgaggggga    660

 

gttcttttcg gagtcgaatt aactcttgat agaaggtaaa gattgggcc                709