以海水为介质生产燃料用碳氢化合物的方法及专用菌株

摘要

本发明公开了一种以海水为介质生产燃料用碳氢化合物的方法及专用菌株。该菌株为盐单胞菌（Halomonas sp.）LS21，其保藏编号为CGMCC No.6593。本发明的实验表明，Halomonas sp.LS21及其基因重组菌株可以在以天然海水为发酵介质，利用多种廉价碳、氮源-包括经预处理的纤维素、半纤维素、废弃油脂及餐厨垃圾等为底物，生产以主要组成为烷烃、烯烃及长链脂肪酸的碳氢化合物。此类碳氢化合物经分离后可作为生物燃料使用；且发酵过程可以实现不灭菌连续发酵。本发明中的盐单胞菌及其重组菌株营养要求简单、发酵过程无需灭菌且可连续进行，简单易控、低成本、具有良好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种以海水为介质生产燃料用碳氢化合物的方法及专用菌株。 

背景技术

几个世纪以来,常规的化石能源一直支撑着工业文明的发展。但是由于化石能源的不可再生性，地球亿万年积存下的宝贵资源在人类高强度开采与消费下最终会消耗殆尽。同时过度使用化石资源所带来的气候变化、环境污染等问题也将使人类付出巨大的代价。能源供应问题将成为制约我国未来社会经济可持续发展的重要因素。 

为保证能源供应的独立性和可持续性，目前各国掀起了一场能源和化工领域新技术浪潮，即用“细胞工厂与生物合成”逐步替代传统的化工工艺。利用生物技术以可再生生物资源为原料生产生物燃料和各种化工原料和产品更是其中的热点。与传统的化石燃料相比,生物燃料具有可再生、无毒、可降解的特点，并能有效减少有害气体和颗粒物的排放,是优质的化石燃料替代品,故又称其为“绿色燃料”。 

但目前上市的生物燃料主要来源于玉米淀粉的发酵反应以及大豆、油菜籽、棕榈油中三酰甘油的体外转酯化反应，其成分为乙醇、脂肪酸甲酯或乙酯等。这种利用粮食作物为原料生产生物燃料的方法已经产生了与人争粮、占用大量的耕地的情况；传统的发酵工艺需要消耗大量的淡水作为介质，反应后产生大量不易处理的废水，既消耗了资源又污染了环境。为了提高生物燃料的实用性和应用范围，着力于开发新的催化方法和工艺流程,寻找更高效的转化酶以及优化酶的使用方法,扩展可利用的原料以及发酵介质范围成为必须。在此基础上，通过改造微生物的代谢途径,使其能利用廉价的非粮油类原料如纤维素等，直接在生物体内生产生物燃料，从而摆脱一系列的高能耗生产过程,降低成本。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一株盐单胞菌（Halomonas sp.）。 

本发明提供的盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21，其保藏编号为CGMCC No.6593。 

上述的盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21在制备聚羟基脂肪酸酯/3-羟基丁酸和/或脂肪酸中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述脂肪酸具体为C16脂肪酸，也称为棕榈酸。 

可以利用合成生物学的方法对上述的盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21进行基因重组，修饰其代谢通路，使该基因工程菌株在能够利用多种碳、氮源的基础上，表达编码催化生产碳氢化合物的酶的相关基因。 

因此，本发明另一个目的是提供一种重组菌。 

本发明提供的重组菌，为将酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因均导入宿主菌中，得到重组菌。 

上述重组菌中，宿主菌为盐单胞菌（Halomonas sp.）；本发明的实施例中具体采用盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21； 

上述酰基酰基载体蛋白还原酶和上述乙醛脱羧酶具体均来自蓝细菌；本发明的实施例中蓝细菌具体为集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)或念珠蓝细菌(Nostoc sp.)。 

上述重组菌中，将酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因均导入宿主菌为将含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段导入宿主菌；所述含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段的核苷酸序列为序列表中的序列1或序列表中的序列4。 

上述重组菌为如下重组菌A或重组菌B： 

重组菌A为将来自集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)的含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段（序列1）导入盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21中；具体本发明中导入来自集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)的含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段通过重组载体A导入盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21中，该重组载体A为将序列表中的序列1插入载体pBBR1MCS1的XbaI和BamHⅠ位点间得到表达酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶。 

集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)中的酰基酰基载体蛋白还原酶的氨基酸序列为序列表中的序列2；所述酰基酰基载体蛋白还原酶的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1位-1023位核苷酸；乙醛脱羧酶的氨基酸序列为序列表中的序列3；所述酰基酰基载体蛋白还原酶的基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1242位-1937位核苷酸。 

重组菌B为将来自念珠蓝细菌(Nostoc sp.)的含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段（序列4）导入盐单胞菌（Halomonas sp.）LS21中；具体本发明中导入来自念珠蓝细菌(Nostoc sp.)的含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段通过重组载体B导入盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21中，该重组载体B为将序列表中的序列4插入载体pBBR1MCS1的XbaI和BamHⅠ位点间得到表达酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶。 

念珠蓝细菌(Nostoc sp.)中的酰基酰基载体蛋白还原酶的氨基酸序列为序列表中的序列5；所述酰基酰基载体蛋白还原酶的基因的核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第938位-1958位核苷酸；乙醛脱羧酶的氨基酸序列为序列表中的序列6；所述酰基酰基载体蛋白还原酶的基因的核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第1位-696位核苷 酸。 

上述重组载体还包含可操作地连接到所述核苷酸序列的启动子。所述启动子是具有调节细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性表达的启动子。在具体实施方案中，所述重组载体包含具有以下特征的序列：（1）可操作地连接到所述核苷酸序列的调节序列；(2)可操作地连接到所述核苷酸序列的选择标记；(3)可操作地连接到所述核苷酸序列的标记序列；(4)可操作地连接到所述核苷酸序列的纯化部分；(5)可操作地连接到所述核苷酸序列的目的基因表达序列。在某些实施方案中，所述核苷酸序列被稳定整合到所述宿主细胞的基因组中,并且该核苷酸序列的表达受可调节启动子的控制。 

上述的重组菌在制备烷烃中的应用也是本发明保护的范围。 

上述应用中，所述烷烃具体为十三烷、十五烷和/或十七烷； 

本发明的第三个目的是提供一种发酵培养基，该发酵培养基可用来培养盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21或上述重组菌。 

本发明提供的发酵培养基，由C源、N源和海水组成； 

所述C源为秸秆纤维素浸提液、油酸、动物脂肪和可溶性淀粉中的至少一种； 

所述N源为大豆蛋白和乳清蛋白中的至少一种； 

所述海水为天然海水或人工海水； 

所述秸秆纤维素浸泡液按照如下方法制备：将秸秆在NaOH水溶液浸泡，收集液体即为秸秆纤维素浸泡液。具体按照如下方法制备：将秸秆在浓度为1g/L、pH值为14的NaOH水溶液4℃浸泡48h，收集液体即为秸秆纤维素浸泡液；其中秸秆为气爆处理后的秸秆；在本发明的实施例中采用气爆处理后的玉米秸秆，具体方法为将含水量10-35％的玉米秸秆在蒸汽压力1.0-1.5MPa的条件下进行蒸汽爆破处理0.5h，烘干得到气爆处理后的秸秆。 

上述发酵培养基由所述秸秆纤维素浸提液、所述油酸、所述动物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白、所述乳清蛋白和所述海水组成； 

所述秸秆纤维素浸提液、所述油酸、所述动物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白和所述乳清蛋白的配比为150-400mL：5-20mL：3-10g：5-20g：1-4g：2g； 

其中，所述动物脂肪具体为家禽脂肪；所述家禽脂肪进一步具体为猪肉脂肪； 

所述发酵培养基的pH值为5.0-11.0，具体为5.0或9.0或11.0； 

所述天然海水中NaCl的终浓度为20g/L至50g/L。 

上述培养基中，大豆蛋白为大豆蛋白粉，乳清蛋白为乳清蛋白粉。 

上述发酵培养基中，人工海水的配方为Mocledon配方，与天然海水的成分基本一致,广泛用于海产品养殖，其用来配置发酵培养基后NaCl的终浓度具体为26.726g/L； 

上述发酵培养基中，天然海水（NaCl含量约为26g/L），用来配置发酵培养基后发酵培养基中所含主要离子含量如下：Na⁺3537.73mg/L、Mg²⁺543.97mg/L、Ca²⁺210.33mg/L；K⁺105.84mg/L；Cl^-7559.70mg/L、SO^2-591.75mg/L、Li⁺193.0μg/L、Al²⁺3.788μg/L、Br^-37.93μg/L；天然海水于2012年8月2日采集于天津港码头近岸海边，海水置于聚四氟乙烯塑料瓶内密封保存。 

本发明发酵培养基中的C源和N源，包括但不仅限于经预处理的纤维素、半纤维素、饱和及不饱和长链脂肪酸（油脂）、淀粉等农业、林业、城市餐厨垃圾等废弃物。这些废弃物经不同方法的预处理后，构成了除必要微量元素外的主要发酵用碳、氮源。 

本发明的第四个目的是提供一种制备聚羟基脂肪酸酯/3-羟基丁酸和/或脂肪酸的方法。 

本发明提供的方法，为发酵上述的盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21，即得到聚羟基脂肪酸酯/3-羟基丁酸和/或脂肪酸。上述方法中，所述脂肪酸为C16脂肪酸。 

上述方法中，在发酵后还包括将发酵产物收集菌体、酯化，获得聚羟基脂肪酸酯/3-羟基丁酸和/或脂肪酸。 

本发明的第五个目的是提供一种制备烷烃的方法。 

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌，即得到烷烃；所述烷烃具体为十三烷、十五烷和/或十七烷。 

在上述制备烷烃的方法中，在发酵后包括如下步骤：收集发酵产物用甲醇或环己烷萃取，收集有机相得到烷烃。 

在上述制备聚羟基脂肪酸酯/3-羟基丁酸和/或脂肪酸的方法或制备烷烃的方法中，发酵采用的培养基为上述发酵培养基。 

上述方法中，所述发酵的温度为20℃-45℃，具体为20℃或42℃或45℃；所述发酵的转速为100rpm（旋转半径：15mm）；所述发酵时间为24至96小时。 

在上述发酵过程中，对于盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21而言，包括野生菌株及基因重组菌株，高盐浓度及碱性pH环境是其生长所必须的，本发明中应用的人工海水提供了平均35g/L的盐分浓度，对废弃物的前处理所用的碱处理方法使培养基的pH值维持在11左右，这样的高盐高碱的生产生长条件能抑制其他非嗜盐菌的生长，使无灭菌生产工艺成为可能，极大的降低了灭菌过程所需的能耗，从而降低了成本。 

本发明的实验证明，本发明自主筛选的一株野生盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21，并以其为基础，通过基因工程改造构建重组菌，该野生菌和重组菌均可以在以天然海水或人工海水配置的发酵培养基中，生产以主要组成为烷烃、烯烃及长链脂肪酸的碳氢化合物，此类碳氢化合物经分离后可作为生物燃料使用；且发酵过程可以实现不灭菌连续发酵。本发明中的盐单胞菌及其重组菌株营养要求简单、发酵过程无需灭菌且 可连续进行，简单易控、低成本、具有良好的工业应用前景。 

定义

在本说明书中，使用了缩写基因名称或多肽名称引用，该缩写基因或多肽名称表示基因或多肽的种类。这些基因包括编码相同多肽和具有相同生理功能同源多肽的部分基因。多肽包括具有相同活性(同工酶)的所有多肽。 

本文引用的登录号来自美国国立卫生研究院(National Institute of Health,U.S.A)所维护的NCBI数据库(国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation))。除非另作说明，登录号按照截止到2012年五月的数据库中提供的。 

本文所述的碳氢化合物,包括但不仅限于烷烃、烯烃、脂肪酸、酯、醛及脂肪醇等。其中烷烃表示仅含有单一碳-碳键的碳氢化合物，其碳原子数至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳。 

上述菌株LS21已于2012年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6593，分类命名为盐单胞菌（Halomonas sp.）。 

附图说明

图1为野生型LS21在海水配制的多碳源培养基中的生长情况（框内） 

图2为LS21在秸秆纤维素为唯一碳源的培养基中积累PHA的GC分析图（框内） 

图3为LS21在人工海水配制的培养基中积累PHA（实线框内）和C16的脂肪酸的GC分析图（虚线框内） 

图4为含有表达来源于集胞蓝细菌的酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶的重组LS21产生烷烃的GC图谱 

图5为含有表达来源于念珠蓝细菌的酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶的重组LS21产生烷烃的GC图谱 

图6为C11、C13、C15、C17烷烃标准品GC图谱 

图7为重组LS21B产生烷烃和烷烃标准品的复合比较的GC图谱 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

实施例1、盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21的分离鉴定及生长特性 

一、菌株LS 21分离 

从新疆达坂城盐湖中取得土样和水样，以纤维素为唯一碳源从中分离菌株。得到5株可产利用纤维素为唯一碳源生长的菌种，选择其中一株生长良好并可积累的PHA 菌株命名为LS 21。 

纤维素培养基的制作：将秸秆纤维素浸泡液用纱布过滤，滤去残留秸秆，按比例加入NaCl（40g/L）及组分I及微量元素混合溶液，用NaOH溶液调pH值至10，待沉淀析出后，在5000rpm下离心5min，保留上清液作为秸秆纤维素培养基。 

秸秆纤维素浸泡液：称取气爆处理后的秸秆(将含水量10～35％玉米秸秆在蒸汽压力1.0～1.5MPa的条件下进行蒸汽爆破处理0.5h烘干获得)6g，加入500mL用去离子水配置的NaOH水溶液（1g/L，pH=14），置于4℃下浸泡48h，收集液体得到秸秆纤维素浸泡液。 

组分I：1.5g/L磷酸二氢钾、9.65g/L十二水合磷酸氢二钠，配制成50倍母液，121℃灭菌20分钟； 

微量元素混合溶液：微量元素I 10mL/L、微量元素Ⅱ 1mL/L，配制成50倍母液，母液pH值调节至4.0-5.0，121℃灭菌20分钟； 

微量元素I和微量元素Ⅱ配制同下； 

1升所述微量元素Ⅰ按照如下方法制备：将柠檬酸铁铵5g、二水合氯化钙2g和0.5mol/L盐酸水溶液混合，用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升，得到所述微量元素Ⅰ； 

1升微量元素Ⅱ按照如下方法制备：将七水合硫酸锌100mg、四水合氯化锰30mg、硼酸300mg、六水合氯化钴200mg、五水合硫酸铜10mg、六水合氯化镍20mg、二水合钼酸钠30mg和0.5mol/L盐酸水溶液混合，用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升，得到所述微量元素Ⅱ。 

基底、组分Ⅰ、组分Ⅱ、微量元素分别单独灭菌，冷却后，分别取20mL组分Ⅰ母液、20mL组分Ⅱ母液和20mL微量元素母液加入基底。 

在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL氨苄青霉素，50μg/mL硫酸卡那霉素和34μg/mL的氯霉素等。 

分离培养基：氯化钠60g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉1g/L，其余组分为水，pH值约为8.0。 

二、菌株鉴定 

1、形态鉴定 

取15%甘油管冷冻保藏的的LS21菌液，将菌液浓度稀释至10⁴cfu/mL，取100μL涂布于LB平板（组分同分离培养基），37℃培养箱培养48小时，观察菌落形态：菌落呈圆形，直径约1－2mm，边缘光滑，湿润，灰白色半透明，显微镜下观察菌体呈短杆状。 

2、生理生化鉴定 

对LS21菌株进行革兰氏染色鉴定，结果为革兰氏阴性菌。 

3、分子鉴定 

检测LS21菌株的16S rDNA序列，扩增16S rDNA序列的引物为通用引物：16F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16R 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’。测得的序列如序列表中的序列7所示。将该序列在NCBI中比对，结果该菌株与Halomonas sp.相似度达99%。 

综合以上鉴定结果，将LS21菌株鉴定为盐单胞菌（Halomonas sp.）。 

上述菌株LS21已于2012年9月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.6593，分类命名为盐单胞菌（Halomonas sp.）。 

实施例2、盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21CGMCC No.6593利用海水为介质发酵中的应用 

1、海水配制发酵培养基 

利用海水和餐厨垃圾即节约成本又节能环保，因此可以采用其作为培养基原料，基于上述目的，开发研究利用海水为介质的发酵培养基：可以采用天然海水，也可以采用与其组分相同或非常近似的人工海水配方（Mocledon配方）配置模拟；餐厨业有机垃圾中水分约占79%、干物料中粗脂肪约为29%、粗蛋白约占20%、淀粉占31%，可以采用混合C源、N源及相应的配比模拟。 

天然海水（NaCl含量约为26g/L），用来配置发酵培养基后发酵培养基中所含主要离子含量如下：Na⁺3537.73mg/L、Mg²⁺543.97mg/L、Ca²⁺210.33mg/L；K⁺105.84mg/L；Cl^-7559.70mg/L、SO^2-591.75mg/L、Li⁺193.0μg/L、Al²⁺3.788μg/L、Br^-37.93μg/L；天然海水于2012年8月2日采集于天津港码头近岸海边，海水置于聚四氟乙烯塑料瓶内密封保存。与下面人工海水相比，主要元素含量无显著差异。 

人工海水的配方为Mocledon配方，每升去离子水中加入以下组分（为在发酵培养基A中的终浓度）：氯化钠(NaCl)26.726g/L，氯化镁(MgCl₂)2.26g/L,硫酸镁(MgSO₄)3.248g/L，氯化钙（CaCl₂）1.153g/L,碳酸氢钠(NaHCO₃)0.198g/L,氯化钾(KCl)0.721g/L，溴化钠（NaBr）0.058g/L，硼酸（H₃BO₃）0.058g/L，硅酸钠(Na₂SiO₃)0.0024g/L，硅酸钠(Na₂Si₄O₉)0.0015g/L，磷酸(H₃PO₄)0.002g/L，六氯化二铝(Al₂Cl₆)0.013g/L,氨(NH₃)0.002g/L，硝酸锂(LiNO₃)0.0013g/L。 

每1L发酵培养基A（利用人工海水为介质）按照如下方法制备：将200mL实施例1得到的秸秆纤维素浸提液、10mL油酸、5g猪肉脂肪（市售的猪肉，取脂肪组织，将该脂肪匀浆成糊状）、10g可溶性淀粉、2g大豆蛋白粉和2g乳清蛋白粉混合，用人工海水补齐体积，用5M的NaOH溶液调节体系的pH值至11。 

每1L发酵培养基B（利用天然海水为介质）按照如下方法制备：仅将发酵培养基A中的人工海水替换为天然海水。 

每1L含有微量元素发酵培养基按照如下方法制备：将200mL实施例1得到的秸秆纤维素浸提液、10mL油酸、5g猪肉脂肪、10g可溶性淀粉、2g大豆蛋白粉、2g乳清蛋白粉和20mL由实施例1制备的微量元素混合溶液混合，用人工海水补齐体积，pH值为11。 

2、发酵 

1）细胞干重检测 

3组发酵： 

A组（LS 21seawater）：每个500mL的三角瓶装入60mL发酵培养基A，接入盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21CGMCC No.6593，42℃，100rpm（旋转半径15mm）下发酵培养3天，得到发酵液。 

D组：每个500mL的三角瓶装入60mL发酵培养基B，接入盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21CGMCC No.6593，42℃，100rpm（旋转半径15mm）下发酵培养3天，得到发酵液。 

B组（加微量元素，LS 21seawater+MM）：每个500mL的三角瓶装入60mL含有微量元素发酵培养基，接入盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21CGMCC No.6593，42℃，100rpm（旋转半径为15mm）下发酵培养3天，得到发酵液。 

取各组25mL发酵液10000转/分离心10分钟收集菌体，用去离子水洗涤两次，冷冻冰干。冰干后菌体称重计算细胞干重（CDW）。每个处理设3个平行。 

部分结果如图1所示，A组（LS 21seawater）在不添加微量元素的发酵培养基A中生长，CDW可达到4.06g/L；B组（加微量元素，LS 21seawater+MM）在添加微量元素的发酵培养基中生长，CDW可达到4.65g/L。 

而D组在发酵培养基B中生长，CDW结果与A组无显著差异。 

从上述结果可以看出，微量元素不会显著影响LS21生长，在不添加微量元素的发酵培养基A和发酵培养基B仍可以很好生长，另外，天然海水和人工海水不会显著影响LS21生长。 

因此，处于成本考虑，采用发酵培养基A或发酵培养基B进行下述研究。 

2）LS 21在唯一碳源的培养基中可产生PHA（聚羟基脂肪酸酯） 

3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid,3HB）为PHA中的单体，可以用来检测是否产生PHA。 

每1L对照培养基（秸秆纤维素为唯一碳源的培养基）：将由实施例1得到的秸秆纤维素浸泡液按比例加入NaCl（40g/L）及由实施例1中的组分I及由实施例1中的 微量元素混合溶液，用5M的NaOH溶液将pH值调至10，待沉淀析出后，在5000rpm下离心5min，保留上清液作为秸秆纤维素培养基。 

C组（秸秆纤维素为唯一碳源）：每个500mL的三角瓶装入60mL对照培养基，接入盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21CGMCC No.6593，42℃，100rpm下发酵培养3天。取25mL发酵液10000转/分离心10分钟收集菌体，用去离子水洗涤两次，冷冻冰干，C组CDW为3.17g。 

取C组获得的30mg冰干后菌体进行酯化，气相色谱（GC）检测PHA含量，每个处理设3个平行。酯化方法为：取30mg冰干菌体于酯化管中，加入2mL氯仿、2mL酯化液混匀，加盖密闭，100℃烘箱中酯化4小时。冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。1L酯化液配置方法：1g苯甲酸、30mL浓硫酸溶于970mL甲醇，得到酯化液。同时取10mg的标样物质进行酯化。标准品为3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid,3HB），内标为苯甲酸Benzoic Acid（购自国药集团化学试剂北京有限公司；产品目录号:30018760）。 

气相色谱（GC）分析：依照岛津公司GC-2014（SHIMADZU，Japan）气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。设定柱头温度为80℃，进样器温度为240℃，检测器温度为250℃，柱头压力为0.25MPa，程序升温条件为：80℃1.5分钟，以35℃/分的速度升温至140℃，再由40℃/分的速度升温至280℃并在此温度保持2分钟。使用自动进样器进样，样品进样量为1μl。 

结果图2所示，在如上气相色谱条件下，标准品3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid,3HB）的保留时间2.5±0.1min，内标苯甲酸的保留时间为3.7±0.1min。样品中3HB的保留时间2.4min，内标苯甲酸的保留时间为3.7min；可以看出，发酵培养LS21产生了3HB，C组产生3HB的含量为菌体干重的27.19±6.07%，从而证明其可积累PHA。 

可以看出，LS 21在秸秆纤维素为唯一碳源的培养基中可产生3HB和PHA。 

3）在混合碳源的发酵培养基中发酵产生PHA和C16脂肪酸 

分别取上述A组（发酵培养基A）、B组（含有微量元素发酵培养基）和D组（发酵培养基B）的30mg冰干后菌体进行酯化，气相色谱（GC）检测3HB含量，每个处理设3个平行。气相色谱（GC）分析：依照岛津公司GC-2014（SHIMADZU，Japan）气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。设定柱头温度为80℃，进样器温度为240℃，检测器温度为280℃，柱头压力为0.25MPa，程序升温条件为：80℃2.5分钟，以35℃/分的速度升温至140℃，再由30℃/分的速度升温至280℃并在此温度保持2分钟。使用自动进样器进样，样品进样量为1μl。 

标准品为标准品为3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid,3HB），内标为苯甲酸Benzoic Acid（购自国药集团化学试剂北京有限公司；产品目录号:30018760）；棕榈酸（又称为C16的脂肪酸）购自东京化学试剂公司（TCI TOKYO CHEMICAL INDUSTRY Co.LTD）。 

部分结果如图3所示，A为LS21在发酵培养基A（不加微量元素的人工海水培养基）中可以积累3HB和C16的脂肪酸（A组），B为LS21在含有微量元素发酵培养基中可以积累3HB和C16的脂肪酸（B组）；在如上气相色谱条件下，标准品中3-羟基丁酸（3-hydroxybutyric acid,3HB）的保留时间2.299min，内标苯甲酸的保留时间为3.915min；样品中3HB的保留时间2.300min，内标苯甲酸的保留时间为3.908min；可以看出，在发酵培养基A中发酵LS21可积累少量3HB，并能积累占菌体干重27.37%的C16的脂肪酸（虚线框中色谱峰）。 

A组产生3HB的含量为菌体干重的9.17±1.01%；B组产生3HB的含量为菌体干重的4.34±0.42%。 

检测D组的结果为LS21在发酵培养基B（天然海水配制培养基）中也可以积累3HB、PHA和C16的脂肪酸，产生3HB的含量与A组无显著差异。 

实施例2、利用LS21制备产生烷烃的重组菌 

一、利用LS21和集胞蓝细菌相关基因制备产生烷烃的重组菌A 

通过导入集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)PCC6803（记载在Accumulation of poly-β-hydroxybutyrate in cyanobacterium Synechocystissp.PCC6803，吴庆余等，Bioresource Technology,76卷，第2期，2001，P85-90，公众可从清华大学获得）。菌株编码的酰基酰基载体蛋白还原酶（acyl-acyl carrier protein reductase）和乙醛脱羧酶（aldehyde decarbonylase）的基因在LS21中异源产生烷烃。集胞蓝细菌PCC6803的酰基酰基载体蛋白还原酶(sll0208；NP442147)，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1位-1023位核苷酸，其氨基酸序列为序列表中的序列2；集胞蓝细菌PCC6803的乙醛脱羧酶(sllO209；NC_000911.1)，其编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1自5’末端第1242位-1937位核苷酸，其氨基酸序列为序列表中的序列3。 

1、构建重组菌LS21A 

以提取的集胞蓝细菌PCC6803总DNA为模板，分别使用引物6803-F：gtggTCTAGAcctcccccccagcaacttagactag（酶切位点为XbaI酶切位点（大写部分)）与引物6803-R：ccggGGATCCccagcagcattgagctttgataatt（酶切位点为BamHⅠ酶切位点（大写部分））扩增，得到约2kb的PCR产物，经过测序，该PCR产物为含有酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶的片段，具有序列表中序列1所示的核苷酸，其中序 列表中序列1自5’末端第1位-1023位核苷酸为酰基酰基载体蛋白还原酶编码基因，序列1自5’末端第1242位-1937位核苷酸为乙醛脱羧酶编码基因。 

PCR扩增结束后，使用溶液回收纯化的方法，纯化PCR产物。 

将纯化PCR产物经XbaI和BamⅠ酶切后，与经过同样酶切的载体pBBR1MCS1（记载在Kovach,M.E.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carring different antibiotic-resistant cecassettes.Gene166(1995)175–176，公众可从清华大学获得）连接，得到重组质粒命名为pBBR1MCS1-A，经过测序，该重组质粒为将序列表中序列1插入pBBR1MCS1的XbaI和BamHⅠ酶切位点间得到的载体。 

将重组质粒pBBR1MCS1-A转化到大肠杆菌S17-1（记载在Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.M.Bierman et al.,GENE，116卷，第1期，1992，P43-49，公众可从清华大学获得）感受态细胞中，在含有25μg/mL氯霉素的LB平板上筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，为pBBR1MCS1-A，将含有该质粒的阳性克隆命名为S17-1/pBBR1MCS1-A。 

挑取S17-1/pBBR1MCS1-A菌落，在液体Lb培养基中培养至对数期，将S17-1/pBBR1MCS1-A和野生型盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21（实施例1得到）共培养，进行接合转化，得到重组菌LS21A。 

具体如下：分别取供体菌S17-1/pBBR1MCS1-A和受体菌野生型盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21菌液各1mL，6000rpm，1.5min离心，去上清；再分别用普通LB和加盐LB（NaCl 35g/L，pH10）分别清洗供体菌和受体菌一次，重悬浮；取400ul供体菌和受体菌混合，6000rpm，1.5min离心，去上清；用100ulLB液体将混合物重悬浮，将所得菌液滴在LB（NaCl 20g/L不调pH不加抗生素）平板上，待菌液吹干后在37℃恒温培养箱中正向静置培养6h；用1mL液体LB（NaCl 35g/L，pH10）将平板上的菌液冲洗下来，混匀，6000rpm，1.5min离心，取上清；用500ul LB（NaCl 35g/L，pH10）将菌体重悬浮，稀释10倍、100倍后，分别取原液、10^-1倍液和10^-2倍液各200ul均匀涂布于LB（NaCl 35g/L，pH10，加氨苄抗生素）平板上，37℃培养24h。接合转化完成后，选取获得氯霉抗性且经PCR鉴定正确（引物为6803-F和6803-R，得到2Kb的产物为正确转化子）的转化子，命名为重组菌LS21A。 

2、发酵重组菌LS21A产生烷烃 

将重组LS21A接种到实施例2制备的发酵培养基A（利用人工海水为介质）中，42℃、100rpm（旋转半径15mm）培养3天。取15mL培养物，离心10分钟、10000rpm，分别将上清液和菌体用甲醇进行萃取，其中菌体细胞团在甲醇中重悬，涡漩后超声处理，破碎菌体后在进行萃取，以10000rpm离心1分钟后，收集上清液。 

将上清液转移到新的GC样品瓶并通过GC进行分析。色谱柱为HP-5毛细柱(柱长30m，内径0.25mm)。1μl无分流进样(入口温度保持在300℃到GC/MS柱后，柱温保持在100℃，持续3分钟。以20℃/分钟的速率将温度升至320℃。柱温保持在320℃柱温5分钟。运载气体氦的流速是1.5mL/分钟。 

标准品为十一烷（CAS：1120-21-4）、十三烷（CAS：629-50-5）、十五烷（CAS：629-62-9）、十七烷（CAS：629-78-7）购自东京化学试剂公司（TCI TOKYO CHEMICAL INDUSTRY Co.LTD），内标为苯甲酸Benzoic Acid（购自国药集团化学试剂北京有限公司；产品目录号:30018760）； 

结果如图4和图6所示，图4为含有表达来源于集胞蓝细菌的酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶的重组LS21产生烷烃的GC图谱；图6为C11、C13、C15、C17烷烃标准品GC图谱； 

在如上气相色谱条件下， 

标准品中十一烷、十三烷、十五烷、十七烷的保留时间分别为4.660min、6.895min、9.065min、11.456min和13.188min，样品中十三烷、十五烷和十七烷的保留时间分别为6.891min、9.053min和11.442min，可以看出，产物峰的保留时间和与标准品一致，说明重组LS21A产生了十三烷、十五烷和十七烷，且产生量为1.48μl/mL的十三烷、0.87μl/mL的十五烷和0.66μl/mL的十七烷。 

采用同样的方法将重组LS21A接种到实施例2制备的发酵培养基B（利用天然海水为介质）中，结果也产生了十三烷、十五烷和十七烷，且产生的量与在发酵培养基A中发酵结果无显著差异。 

二、利用LS21和念珠蓝细菌相关基因制备产生烷烃的重组菌B 

通过导入念珠蓝细菌(Nostoc sp.)PCC 7120（记载在Characterization of phytochelatin synthase-like protein encoded by alr0975from a prokaryote,Nostocsp.PCC7120，Naoki Tsuji et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications，315卷，第3期，2004，P751-755，公众可从清华大学获得）。菌株编码酰基酰基载体蛋白还原酶（acyl–acyl carrier protein reductase）和乙醛脱羧酶（aldehyde decarbonylase）的基因在LS21中异源产生烷烃。念珠蓝细菌PCC7210的酰基酰基载体蛋白还原酶(alr5283;NP 489323.1，其编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4自5’末端第938-1958位核苷酸，其氨基酸序列为序列表中的序列5；念珠蓝细菌PCC7210乙醛脱羧酶(alr5284;NP-489324)，其编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列4自5’末端第1-696位核苷酸，其氨基酸序列为序列表中的序列6。 

1、构建重组菌LS21B 

以提取的念珠蓝细菌PCC7210总DNA为模板，分别使用引物7120-F (cgTCTAgagttagatcgccaagcacttgttt，酶切位点为XbaI)与引物7120-R(ccccGGATCCagttagggattaggtattgggtatt，酶切位点为BamHⅠ)扩增，得到约2kb的PCR产物，经过测序，该PCR产物为含有酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶的片段，具有序列表中序列4所示的核苷酸，其中序列表中序列4自5’末端第938位-1958位核苷酸为酰基酰基载体蛋白还原酶编码基因，序列4自5’末端第1位-696位核苷酸为乙醛脱羧酶编码基因。 

PCR扩增结束后，使用溶液回收纯化的方法，纯化PCR产物。 

将纯化PCR产物经XbaI和BamHⅠ酶切后，与经过同样酶切的载体pBBR1MCS1连接，得到重组质粒命名为pBBR1MCS1-B，经过测序，该重组质粒为将序列表中序列4插入pBBR1MCS1的XbaI和BamHⅠ酶切位点间得到的载体。 

将重组质粒pBBR1MCS1-B转化到大肠杆菌S17-1感受态细胞中，在含有25μg/mL氯霉素的LB平板上筛选得到阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，为pBBR1MCS1-B，将含有该质粒的阳性克隆命名为S17-1/pBBR1MCS1-B。 

挑取S17-1/pBBR1MCS1-B菌落，在液体Lb培养基中培养至对数期，将S17-1/pBBR1MCS1-B和野生型盐单胞菌（Halomonas sp.）LS 21（实施例1得到）共培养，进行接合转化，得到重组菌LS21B，方法同上。接合转化完成后，选取获得氯霉抗性且经PCR鉴定正确（引物为7120-F和7120-R，得到2Kb的产物为正确转化子）的转化子，为重组LS21B。 

2、发酵重组菌LS21B产生烷烃 

将重组LS21B接种到实施例2制备的发酵培养基A（利用人工海水为介质）中，42℃、100rpm（旋转半径15mm）培养3天。取15mL培养物，离心10分钟、10000rpm，分别将上清和菌体用甲醇进行萃取，其中菌体细胞团在甲醇中重悬，涡漩后超声处理，破碎菌体后在进行萃取，以10000rpm离心1分钟后。 

将上清液转移到新的GC样品瓶并通过GC进行分析。色谱柱为HP-5毛细柱(柱长30m，内径0.25mm)。1μl无分流进样(入口温度保持在300℃到GC/MS柱后，柱温保持在100℃，持续3分钟。以20℃/分钟的速率将温度升至300℃。柱温保持在300℃柱温5分钟。运载气体氦的流速是1.5mL/分钟。产物峰的保留时间和与标准品进行比较以确认一致性。 

标准品为十一烷（CAS：1120-21-4）、十三烷（CAS：629-50-5）、十五烷（CAS：629-62-9）、十七烷（CAS：629-78-7）购自东京化学试剂公司（TCI TOKYO CHEMICAL INDUSTRY Co.LTD），内标为苯甲酸Benzoic Acid（购自国药集团化学试剂北京有限公司；产品目录号:30018760）； 

结果如图5-图7所示，图5为含有表达来源于念珠蓝细菌的酰基酰基载体蛋白还 原酶和乙醛脱羧酶的重组LS21B产生烷烃的GC图谱；图6为C11、C13、C15、C17烷烃标准品GC图谱；图7为重组LS21B产生烷烃和烷烃标准品的复合比较的GC图谱； 

在如上气相色谱条件下，标准品中十一烷、十三烷、十五烷、十七烷的保留时间分别为4.660min、6.895min、9.065min、11.456min和13.188min；样品中十三烷、十五烷和十七烷的保留时间分别为6.884min、9.042min和11.436min；可以看出，产物峰的保留时间和与标准品一致，说明重组LS21B产生了十三烷、十五烷和十七烷，且产生量为1.72μl/mL的十三烷、0.92μl/mL的十五烷和0.73μl/mL的十七烷。 

采用同样的方法将重组LS21A接种到实施例2制备的发酵培养基B（利用天然海水为介质）中，结果也产生了十三烷、十五烷和十七烷，且产生的量与在发酵培养基A中发酵结果无显著差异。