红球菌及其在微生物降解4-氟肉桂酸中的应用

摘要

本发明提供了一株新型高效4-氟肉桂酸降解菌——红球菌（Rhodococcus sp.）HZF1，及其在微生物降解4-氟肉桂酸中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2012年10月15日，保藏编号为CCTCC No: M 2012404。本发明所述红球菌HZF1可通过直接投加的方式应用于水体和土壤中4-氟肉桂酸的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的4-氟肉桂酸，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一株新型高效4-氟肉桂酸降解菌——红球菌（Rhodococcus sp.）HZF1，及其在微生物降解4-氟肉桂酸中的应用。

（二）背景技术

4-氟肉桂酸(4-Fluorocinnamic acid) ，也称对氟肉桂酸，是一种含氟芳香族化合物，主要由氟肉桂醛、丙二酸和吡啶配制，目前广泛用于医药中间体、感光剂等领域。4-氟肉桂酸的分子式为 C₉H₇FO₂，结构式如式（Ⅰ）所示。

含氟有机化合物广泛应用于工业、农业, 并代表着一类非常重要的环境污染物。含氟有机化合物因为其剂量少、毒性小、性能好而用于农业，因为其生物稳定性、高生物活性、亲油性而用于生产药物。最近，含氟有机化合物被广泛应用于电子工业，例如4-氟苯酚的聚合物和4-氟肉桂酸聚合物，它们稳定性高、粘度低，在热、光、强电流、化学品中能保持高的电压。氟代有机物比氯代及溴代有机物受到较少的关注是因为它们普遍被认为是生物惰性的，人们误认为它们对人类健康和环境的影响较小。然而,惰性分子更具持久性和更易累积, 被它们污染的环境也就更不易修复。研究表明, 一些氟代有机物能够在适合的环境条件下进行有限的生物转化, 而且, 含氟有机化合物表现出某些显著的生物效果, 如抑制酶活性,阻碍细胞间物质传递, 膜运输以及影响产能过程等。因此,含氟有机化合物的生态迁移和转化正日益受到关注。

4-氟肉桂酸的大量使用和生物惰性，使得其在环境中不断累积，对人体健康和环境安全造成极大危害, 主要表现为抑制酶活性、影响能量传递、破坏细胞膜间物质传递等而诱发癌症、心肺损害、肝肿大等疾病。

对含4-氟肉桂酸的污水的处理对保护环境质量很重要。在所有的处理方法中，利用微生物代谢方法去除4-氟肉桂酸，成本低，有害副产品少，它能把污染物完全矿化，因此有着广阔的应用前景。

微生物是一类种类多、繁殖快、适应性强、代谢能力强的生物体。若能筛选分离出能高效降解4-氟肉桂酸的微生物，将4-氟肉桂酸降解成二氧化碳、水等对人体和环境无毒害的物质，这对维护人类健康有着深远的意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株新型高效红球菌属4-氟肉桂酸降解菌HZF1及其应用。

本发明采用的技术方案是：

红球菌（Rhodococcus sp.）HZF1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2012年10月15日，保藏编号为CCTCC No: M 2012404。

所述红球菌HZF1的16S rDNA的Genbank登陆号为JX878615。

红球菌HZF1（Rhodococcus sp. HZF1）菌株的筛选与鉴定：

1）培养基

无机盐培养基终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl 1g，K₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，（NH4）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0.23g，CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.15g，AlCl₃﹒6H₂O 0.05g，溶剂为水。

富集培养液：在无机盐培养基中加入4-氟肉桂酸，使得4-氟肉桂酸的终浓度为500mg/L。

LB液体培养基：每升培养液中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

LB固体培养基：每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

2）菌株分离纯化

污泥样品采自杭州农药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液100 ml中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

取最后一次培养所得的培养液5 ml进行梯度稀释（10^-4、10^-5、10^-6），取各个稀释后的培养液150μl涂布于含500mg/L4-氟肉桂酸的LB固体培养基平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含500mg/L4-氟肉桂酸的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养（30℃，150rpm）过夜，将培养好的菌液离心（8000rpm，5min）后接至富集培养液中25~ 45℃培养3d，通过高效液相色谱法（HPLC）检测各富集培养液中4-氟肉桂酸的残留量，最后筛选获得一株能高效降解4-氟肉桂酸的菌株，命名为HZF1。

3）菌株鉴定

将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阳性，需氧型，无芽孢，大小约为 (1.7~ 3.2 μm），菌落平坦，中间凸起，边缘扩散，呈浅橙色，接触酶阴性，氧化酶阴性，甲基红试验阳性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，V.P.反应阳性。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Rhodococcus属，因此命名为红球菌（Rhodococcus sp.）HZF1。

本发明还涉及所述的红球菌HZF1在微生物降解4-氟肉桂酸中的应用。

具体的，所述降解在25~ 45℃、pH5.0 ~ 9.0、黑暗条件下进行，一般需振荡（100~200 rpm）。

所述降解在30℃、pH 7.0、150rpm、黑暗条件下进行。

在4-氟肉桂酸终浓度为100~1500 mg/L（优选 200 mg/L）的无机盐培养基，加入含红球菌HZF1的细胞悬液，在25~ 45℃、pH值为5.0~9.0的条件黑暗振荡培养16~24h，可使反应液中4-氟肉桂酸的质量残留量小于4%；所述含红球菌HZF1的细胞悬液加入量使反应体系中红球菌HZF1终浓度为1~5×10⁷个/ml。

实际应用中，所述菌株通常需要经过活化和扩大培养，具体过程如下：

（1）斜面培养：将红球菌HZF1接种于斜面培养基，25~ 45℃培养5~7天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20.0g/L，溶剂为水；

（2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养基中，25~ 45℃培养5~7天，获得种子液；所述无机盐培养基终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，（NH4）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0.23g，CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.15g，AlCl₃﹒6H₂O 0.05g，溶剂为水；

（3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接种量接种至LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期，获得菌液，将菌液离心，弃上清，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含红球菌HZF1的细胞悬液，该细胞悬液可投加于水体或土壤中用于4-氟肉桂酸的降解；所述LB液体培养基终浓度组成为：每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为水，自然pH值。

本发明菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量菌体（即含菌细胞培养液）在600nm处的吸光度值来表示。

本发明采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养基中4-氟肉桂酸的残留量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：10 mM乙酸、乙酸铵缓冲溶液=50:50（体积比），分析柱为Grace Alltima C18色谱柱 (4.6×250mm，5μm)，流速为0.8ml/min，进样量为10μl，柱温为30℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明所述红球菌HZF1可通过直接投加的方式应用于水体和土壤中4-氟肉桂酸的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的4-氟肉桂酸，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

（四）附图说明

图1 为本发明红球菌HZF1的电镜图；

图2为4-氟肉桂酸的标准曲线图；

图3 为本发明的红球菌HZF1在不同温度下对4-氟肉桂酸的降解曲线图：正方形（）为30℃，圆形（）为25℃，正三角形（）为37℃，倒三角形（）为45℃；

图4为本发明的红球菌HZF1在不同pH下对4-氟肉桂酸降解影响图；

图5为本发明的红球菌HZF1在纯培养条件下对终浓度为200mg/L的4-氟肉桂酸的降解曲线图；

图6为本发明的红球菌HZF1在4-氟肉桂酸终浓度为200mg/L纯培养条件下的生长曲线图；

图7为本发明的红球菌HZF1对不同浓度4-氟肉桂酸的降解曲线图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：菌株的筛选与鉴定

1）培养基

无机盐培养基的配制：NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，（NH₄）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0.23g，CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.15g，AlCl₃﹒6H₂O 0.05g，用蒸馏水补足至1000ml。

富集培养液：在无机盐培养基中加入4-氟肉桂酸，使得4-氟肉桂酸的终浓度为500mg/L。

LB液体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

LB固体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

2）菌株分离纯化

污泥样品采自杭州农药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

取最后一次培养所得的培养液5ml进行梯度稀释（10^-4、10^-5、10^-6），取各个稀释后的培养液150μl涂布于含500mg/L4-氟肉桂酸的LB固体培养基平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含500mg/L4-氟肉桂酸的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养（30℃，150rpm）过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养3d，通过反相高效液相色谱法检测各富集培养液中4-氟肉桂酸的残留量，最后筛选获得一株能高效降解4-氟肉桂酸的菌株，命名为HZF1。

3）菌株鉴定

将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：菌体球状，无鞭毛，无芽孢，大小约为 (1.7~ 3.2 μm)，菌落平坦，中间凸起，边缘扩散，呈浅橙色，接触酶阴性，氧化酶阴性，甲基红试验阳性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，V.P.反应阳性。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Rhodococcus属，因此命名为红球菌（Rhodococcus sp.）HZF1（CCTCC No: M 2012404）。

实施例2：含菌细胞悬液的制备

（1）斜面培养：将红球菌HZF1接种于斜面培养基，30℃培养6天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂20.0g，水1000ml；

（2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养基中，30℃培养6天，获得种子液；所述无机盐培养基终浓度组成同实施例1；

（3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接种量接种至LB液体培养基（100 mL）中，30℃、150rpm振荡培养至对数生长期，获得菌液，将菌液离心（8000rpm，5min），弃上清，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含红球菌HZF1细胞悬液100 mL，其中细胞悬液中的红球菌HZF1浓度为5×10⁸个/ml；

所述LB液体培养基终浓度组成同实施例1；

pH为7.0的0.2 mol/L的磷酸缓冲液的配方为：取0.2 mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用超纯水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌（121℃、20min）后即得。

实施例3：4-氟肉桂酸降解实验

1）无机盐培养基中菌体浓度与4-氟肉桂酸含量的检测：

菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量培养液中菌体在600nm处的吸光度值来表示。

本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养基中4-氟肉桂酸的残留量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：10 mM乙酸、乙酸铵缓冲溶液=50:50（体积比），分析柱为Grace Alltima C18色谱柱 (4.6×250mm，5μm)，流速为0.8ml/min，进样量为10μl，柱温为30℃。

2）4-氟肉桂酸降解实验：

将4-氟肉桂酸标准品用无菌水溶解配制成100 mg/L的标准液，在反相液相色谱测试标准曲线，4-氟肉桂酸标准曲线如图2所示，标准曲线方程为y=4.541x+11.737，R²=0.9951，y为峰面积，x为4-氟肉桂酸浓度。

a、不同温度对降解的影响：取4个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入4-氟肉桂酸，使4-氟肉桂酸终浓度均为200 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml（5×10⁸个/ml），分别接种于此无机盐培养基中，使红球菌HZF1终浓度约为2.5×10⁷个/ml，分别于25、30、37、45 ℃培养摇床（pH 7.0，150rpm），每小时定时取样测定残留4-氟肉桂酸浓度，结果如图 3所示，显示30℃为最适降解温度。

b、不同pH对降解的影响：取5个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入4-氟肉桂酸，使4-氟肉桂酸终浓度均为200 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别接种于此无机盐培养基中，使红球菌HZF1终浓度约为2.5×10⁷个/ml，分别调节pH 至5.0、6.0、7.0 、8.0和 9.0，在30℃、150rpm下摇床培养，每小时定时取样测定残留4-氟肉桂酸浓度，结果如图4所示，显示pH7.0为最适降解pH。

c、不同时间对降解的影响：取250ml锥形瓶，加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入4-氟肉桂酸，使4-氟肉桂酸终浓度为200 mg/L，共设置3个平行样。各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别接种于此无机盐培养基中，使红球菌HZF1终浓度约为2.5×10⁷个/ml，相应的设置3个不含该菌种的平行实验作为空白对照，然后一同置于摇床（30℃，pH7.0，150rpm）中黑暗振荡培养。在培养时间为0、3、6、9、12、24、36、48、60、72h时定时取样，根据上述检测方法来检测无机盐培养基中菌体的生长量与4-氟肉桂酸的残留量，结果见图5所示。

本发明菌株对200 mg/L浓度的4-氟肉桂酸的降解曲线如图5所示，菌体的生长曲线如图6所示，图6可以看出OD₆₀₀从0.18增加到0.42，说明菌体生长良好，观察图5，可以发现，培养24h后，本发明的4-氟肉桂酸降解菌对200 mg/L的4-氟肉桂酸的降解率接近为100%，所有未加菌的空白对照在24h后的水解率均小于5%。

d、对不同浓度4-氟肉桂酸降解的影响：

取4个250ml锥形瓶，分别加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入4-氟肉桂酸，使4-氟肉桂酸终浓度分别为200、500、1000、1500 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml，分别接种于此无机盐培养基中，使红球菌HZF1终浓度约为2.5×10⁷个/ml，在pH 7.0 、30℃、150rpm下摇床培养，定时取样测定残留4-氟肉桂酸浓度，结果如图7所示。

本发明菌株对浓度为200~1500 mg/L的4-氟肉桂酸的降解率如图7所示，结果表明都具有非常好的降解能力，而且此菌种为新型4-氟肉桂酸降解菌，因此，该菌对研究4-氟肉桂酸的降解途径与降解基因具有非常大的促进作用，对环境中4-氟肉桂酸的降解尤其是对4-氟肉桂酸的集中修复具有一定的积极意义。