一种牛大力种子直接诱导丛生芽并快速繁育种苗的方法

摘要

本发明公开了一种牛大力种子直接诱导丛生芽并快速繁育种苗的方法。本方法牛大力种子为外植体直接诱导丛生芽，繁育种苗的方法包括外植体灭菌、初代诱导、继代增殖、生根、移栽过程得到牛大力种苗。本发明的优点：本发明提供的整套方法操作简便，生产成本低，增殖速度快，生根移栽成活率高，便于大规模工业化生产应用，可大量、快速、持续获得高质量的牛大力试管苗，实用性强。

说明书

技术领域

本发明属农业生物技术领域，具体是一种牛大力种子直接诱导丛生芽并快 速繁育种苗的方法。

背景技术

牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤（Millettia speciosa Champ.）， 又名大力薯、山莲藕，始载于《生草药性备要》，是《广西中药材标准》(1990 年版)收载的地方药材。牛大力以根入药，味甘，平。归肺、肾经。具有补虚 润肺、强筋活络的功效，临床证明其对腰肌劳损、风湿性关节炎、肺虚咳嗽、 肺结核、慢性支气管炎、慢性肝炎等慢性疾病有较好的疗效。壮族民间常用于 腰腿痛，发旺(风湿骨痛)，肺结核，慢性肝炎，慢性胃炎的治疗。

现代研究发现，牛大力含有多糖、生物碱、香豆素和多种微量元素等成分， 其中牛大力多糖是其主要活性成分，具有调节免疫系统、抗氧化、抗炎、抗肿 瘤活性，尤其是抗肿瘤方面疗效明确，目前临床研究显示其对鼻咽癌、卵巢癌、 肺癌、以及结肠癌具有良好的治疗效果。同时牛大力多糖也是理想的免疫增强 剂；生物碱和香豆素具有保肝、祛痰、镇咳、镇痛、镇静、解痉的作用，且对 正常细胞均没有毒副作用，在开发抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等药物方面有着特 殊的优势，已成为提取企业竞相开发的新目标，市场需求量巨大。自20世纪70 年代起，作为主要原料被制药企业加工成壮腰健肾丸、强力健身胶囊、桂龙药 膏、活络止痛丸、强力追风透骨丸、舒筋健腰丸、益智康脑丸、抗风湿液等中 成药，在全国广泛应用。近年来，牛大力又成为提取企业竞相开发的新目标， 提取多糖、高丽槐素等成分。

随着牛大力需求量的不断增加，野生资源已经枯竭，原材料严重供不应求。 为了解决供需矛盾，人们尝试采用人工栽培的方法扩大药源，目前已发现有一 些成功的研究报道。在种子萌发方面，经统计发现国内外有2篇报道（截止 2012年11月22日），黄秋银等分别进行不同种子处理在同一光照培养箱中的 发芽试验和不同基质种子发芽试验，研究结果表明以清水浸种处理后种子发芽 效果最佳，平均发芽率达61.25％；以河沙处理的种子发芽率最高，且发芽所 需要的时问也较短。姚绍嫦等通过测定牛大力种子形态、千粒重和含水量，研 究在不同浸种时间、不同光照、不同温度条件下的发芽率，并进一步比较它们 之间的相关性，同时比较在不同发芽床培养下的发芽率、发芽指数、始发芽粒 数和发芽天数的差异，结果表明在双层纸床上，浸种24h，25℃，光照条件， 最适宜牛大力种子的萌发。在组织培养方面，经统计发现国内外有5篇报道（截 止2012年11月22日），其中4篇以茎段为外植体，1篇以果荚（种子）为外 植体。经比较，以茎段为外植体的污染率比以种子为外植体的高，且成苗经过 愈伤组织，组培周期长，容易引起变异。王祝年等以成熟果荚（种子）为外植 体进行组织培养快速繁殖牛大力，种子萌发培养基为1/2MS，芽的增殖与继代 培养基为MS+6.BA2.0mg/L(单位下同)+NAA0.5，生根培养基为1/2MS+IBA 1.0，将种子萌发的无菌苗切段接种到增殖培养基上，经过愈伤组织形成不定 芽（容易引起变异），40d平均增殖系数达5.0。生根培养20d，生根率达80％。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足提供一种牛大力种子直接诱导丛生 芽并快速繁育种苗的方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种牛大力种子直接诱导丛生芽并快速繁育种苗的方法，牛大力种子为外 植体直接诱导丛生芽，繁育种苗的方法包括外植体灭菌、初代诱导、继代增殖、 生根、移栽过程：

1.外植体灭菌过程

取牛大力成熟黑色种子，用体积百分浓度为0.05％洗洁精溶液浸泡10min， 再经流水冲洗15min。在超净工作台上用0.1％HgCl₂溶液灭菌16min，然后用 无菌水摇荡洗涤4次，再用无菌吸水纸将水分吸干后接种至初代诱导培养基。

2.初代诱导过程

将步骤（1）灭菌好的种子接种至初代诱导培养基MS+3.0mg·L^-16-BA+1.5mg ·L^-1KT+0.2mg·L^-1NAA+500mg·L^-1PVP上进行种子萌发及丛生芽诱导培养；此过 程的培养时间<25d，诱导率可达100％。

所述培养基附加30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH6.0，配制分装后，于121 ℃灭菌20分钟。培养条件为(26±2)℃、光照强度2000Lx、光照时间10h/d；

3.继代增殖过程

将步骤（2）初代诱导培养获得的丛生芽切下含2-3个芽的芽丛转接到继 代培养基MS+2.0mg·L^-16-BA+0.5mg·L^-1KT+0.2mg·L^-1TDZ+0.2mg·L^-1NAA中进 行增殖培养，周期为20-25d，增殖倍数为9.68/20d。

所述培养基附加30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH6.0，配制分装后，于121 ℃灭菌20分钟。培养条件为(26±2)℃、光照强度2000Lx、光照时间10h/d。

4.生根过程

当继代增殖芽苗长至2cm以上，从基部切成单个芽，转接到生根培养基 1/2MS+2.5mg·L^-1IBA+1.5mg·L^-1IAA中诱导生根，培养7d开始长根原基，25d 后得到瓶苗，可以开盖炼苗。

所述培养基附加30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH6.0，配制分装后，于121 ℃灭菌20分钟。培养条件为(26±2)℃、光照强度2000Lx、光照时间10h/d；

5.移栽过程

把步骤（4）生根的瓶苗搬到炼苗棚，打开瓶盖炼苗4d，然后用镊子将瓶 苗取出，用清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到细河沙上，移栽后10d内保 持相对湿度95％左右，温度白天控制在23-25℃，夜间15-18℃，没有直射光 的条件，移栽成活率84.07％。移栽15d后即可上杯种植，30d后可进行大田栽 培。

本发明的优点：本发明提供的整套方法操作简便，生产成本低，增殖速度 快，生根移栽成活率高，便于大规模工业化生产应用，可大量、快速、持续获 得高质量的牛大力试管苗，实用性强。该项技术由牛大力种子直接诱导出丛生 芽，在初代诱导培养基的作用下，种子萌发和丛生芽诱导同时进行，与已有文 献报道的先诱导种子无菌萌发再切取茎段诱导丛生芽的方法不同，大大缩短了 组培的周期，与已有研究报道相比丛生芽获得更高的增殖倍数，且丛生芽诱导 不经过愈伤组织阶段，大大减少了变异的可能性，有利于保持种苗的优良性状。

具体实施方式

下面结合具体实施方法对本发明作进一步描述。

一种牛大力种子直接诱导丛生芽并快速繁育种苗的实施方法：

1.外植体选择与灭菌过程

取牛大力成熟黑色种子，用体积百分浓度为0.05％洗洁精溶液浸泡10min， 再经流水冲洗15min。在超净工作台上用0.1％HgCl₂溶液灭菌16min，然后用无 菌水摇荡洗涤4次，再用无菌吸水纸将水分吸干后接种至初代诱导培养基。此 灭菌方法的污染率为13.33％，成活率为100.00％。

若果荚未开裂，取成熟的黑色果荚，用0.05％洗洁精溶液浸泡10min，浸泡 过程中用刷子刷洗表面以去除表面柔毛与污垢，再经流水冲洗15min。在超净 工作台上用0.1％HgCl₂溶液灭菌20min，然后用无菌水摇荡洗涤3次，再用无 菌吸水纸将水分吸干后纵切剖开果荚，取出种子接种至初代诱导培养基。此灭 菌方法无污染，成活率为100.00％。

2.初代诱导过程

将灭菌好的种子接种至初代诱导培养基MS+3.0mg·L^-16-BA+1.5mg· L^-1KT+0.2mg·L^-1NAA+500mg·L^-1PVP上进行种子萌发及丛生芽诱导培养，在培 养基中附加30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH6.0，配制分装后，于121℃灭菌20 分钟。培养条件为(26±2)℃、光照强度2000Lx、光照时间10h/d，诱导率 100％。培养25d，种子萌发并且同时在下胚轴处诱导出具有4-5个小芽的丛生 芽，丛生芽诱导率100％。在该配方的培养基作用下，种子萌发和丛生芽诱导 同时进行，与已有文献报道的先诱导种子无菌萌发再切取茎段诱导丛生芽的方 法不同。本方法大大缩短了丛生芽诱导所需的时间，芽生长速度快，无玻璃化 现象，且芽不经过愈伤组织过程，大大减少了变异的可能性。此外，培养基中 添加了PVP还解决了种皮褐化的问题，缩短了种子萌发所需的时间和提高了萌 发率，添加PVP后种子露白仅需7d左右。

3.继代增殖过程

将初代诱导培养获得的丛生芽切下含2-3个芽的芽丛转接到继代培养基 MS+2.0mg·L^-16-BA+0.5mg·L^-1KT+0.2mg·L^-1TDZ+0.2mg·L^-1NAA中进行增殖培 养，在培养基中附加30g/L蔗糖和5g/L琼脂，pH6.0，配制分装后，于121 ℃灭菌20分钟。培养条件为(26±2)℃、光照强度2000Lx、光照时间10h/d， 增殖倍数为9.68/20d，丛生芽生长快，无玻璃化现象。

4.生根过程

当继代增殖芽苗长至2cm以上，从基部切成单个芽，转接到生根培养基 1/2MS+2.5mg·L^-1IBA+1.5mg·L^-1IAA中诱导生根，培养7d开始长根原基，25d 后可以开盖炼苗。生根率90％以上。

5.炼苗移栽过程

把生根的瓶苗搬到炼苗棚，打开瓶盖炼苗4d，然后用镊子将瓶苗取出，用 清水洗去粘附在根部的培养基，移栽到细河沙上，移栽后10d内保持相对湿度 95％左右，温度白天控制在23-25℃，夜间15-18℃，没有直射光的条件，移栽 成活率84.07％。移栽15d后即可上杯种植，30d后可进行大田栽培。