分批补加氮源培养真菌生产纤维素酶的方法

摘要

本发明公开了一种分批补加氮源培养真菌生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：培养基在发酵罐中以60%~80%的装液量于121℃灭菌20min，降温至培养温度28~30℃；以装液量1%~5%的接种量接种真菌种子液于发酵罐中发酵；分别在发酵培养第2~3天及4~5天补加质量为初始培养基中氮源对应质量的0.25~0.5倍的无机氮源及有机氮源。本发明通过前期添加少量的N源在降低发酵液渗透压的同时降低初始培养基的营养，抑制菌丝的过量繁殖，避免大量的营养用于菌丝生长，发酵后期通过分批补氮源，在限制营养用于菌丝生长的同时保证纤维素酶合成所需要的营养供给，提高营养的利用率，获得更高的发酵纤维素酶活。

说明书

技术领域

本发明属于酶发酵领域，具体的说，是涉及一种发酵过程中分批补加氮源发酵生产纤维素酶的方法。 

技术背景

纤维素酶具备的水解木质纤维素成糖的能力使得其具有广泛的应用前景，通过对秸秆等木质纤维素水解，将其发酵成糖，在通过发酵等方法制备燃料乙醇或者其他的化工产品，这也是利用木质纤维素制备能源化工产品当中一个关键要素之一，纤维素酶的制备成本和效率也是能否实现生物质基能源化工产品逐渐取代石油能源和化工产品的决定因素之一。 

高活性的纤维素酶发酵技术能够极大的提高发酵效率节约产酶的成本，传统的纤维素酶发酵通常采用液体深层间歇式发酵技术即在发酵初始配置发酵培养基时，一次性的投加足量的碳源、氮源、生长因子及微量元素等，通过控制发酵过程中的温度、融氧、pH等保证微生物能有一个最优的发酵条件从而获得高发酵活性的纤维素酶。该方法操作简单，适合大多数微生物的培养，易于推广。同时该方法在前期一次性投加整个发酵过程中所需的营养，容易导致初始培养基浓度过高造成传质、传热的困难增加了发酵的能耗；发酵前期高浓度的营养会导致整个发酵培养基的渗透压的增高不利于延滞期菌株的生长；高浓度的营养物质同时会导致前期营养物质大量的用于合成菌株生长所需要的营养，导致菌株大量繁殖，以至于后期发酵合成纤维素酶时营养紧缺从而抑制产酶。 

发明内容

本发明的目的在于：提供一种分批补加氮源培养真菌生产纤维素酶的方法，通过前期添加少量的氮源在降低发酵液渗透压的同时降低初始培养基的营养，抑制菌丝的过量繁殖，避免大量的营养用于菌丝生长，发酵后期通过分批补氮源，在限制营养用于菌丝生长的同时保证纤维素酶合成所需要的营养供给，提高营养的利用率，获得更高的发酵纤维素酶活。 

本发明的技术解决方案是该纤维素酶的生产方法包括如下步骤： 

（1）培养基的配制：

以纤维质原料为唯一碳源及产酶诱导剂，玉米浆(CSL)、蛋白胨、酵母膏中的一种或几种作为培养基的有机氮源，铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、氨水一种或几种的组合作为培养基的无机盐氮源，配制培养基，于121℃灭菌20min，培养基在发酵罐中的装液量以发酵罐装液容量的60%~80%为宜；

（2）接种与发酵：以培养基体积的1%~5%（v/v）的接种量接种真菌种子液于发酵罐中发酵，发酵过程参数控制为：温度为28~30℃，溶解氧不低于10%~20%，通气量为0.1~0.3vvm ；

（3）过程补料：根据发酵过程中真菌的生长与产酶的特性分别在发酵培养第2~3天及4~5天补加质量为初始培养基中无机氮源质量的0.25~0.5倍的无机氮源或质量为初始培养基中有机氮源质量的0.25~0.5倍的有机氮源，也可以是同时补加质量为初始培养基中氮源对应质量的0.25~0.5倍的无机氮源及有机氮源。

其中，步骤（1）配制的初始培养基的氮源浓度0.05%~1%（w/v）。 

其中，步骤（2）中的真菌为木霉属、曲霉属的一种或两种的组合。 

其中，所述的纤维质原料为纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素制备纤维素的一种或几种的混合。 

其中，所述的纤维质原料为经过预处理的木质纤维素，包括农作物秸秆、草类、林木生物质中的一项或几项的组合。 

本发明具有以下做点： 

1、步骤（1）的初始培养基的氮源浓度为较低的水平，以0.05%~1%（w/v）为宜，以保证前期供应少量氮源用于菌丝生长，防止大量营养用于菌丝繁殖。

2、根据真菌的生长与产酶的特性补加氮源，在发酵前期补加无机氮能够维持菌丝生长的基本营养易于菌丝吸收，发酵后期补加有机氮源能够在维持菌丝基本营养的基础上同时提供纤维素酶合成过程中所需的氨基酸等氮源营养，促进纤维素酶大量合成。 

3、补加氮源可以是单纯的补加无机氮或有机氮，也可以是两种氮源的组合补加。 

4、通过改变N源的添加方式，在发酵前期添加少量的N源以供菌丝生长，在产酶过程中分批次补加所需的N源以保证蛋白的合成，与传统的间歇式发酵相比同浓度的C源及其他营养物质的情况下发酵所得的酶活提高了1~2倍，极大的提高了产酶发酵营养的利用率，降低了生产成本，使得该培养方法更容易适应产业化的推广。 

附图说明

图1为里氏木霉Rut-30传统间歇式发酵生长与产酶随发酵时间变化的曲线图。 

图2为里氏木霉Rut-30在发酵第3天及第5天补加有机氮源玉米浆后的发酵生长与产酶随发酵时间变化的曲线图。 

图3为里氏木霉Rut-30在发酵第3天及第5天补加无机氮源硫酸铵后的发酵生长与产酶随发酵时间变化的曲线图。 

图4为里氏木霉Rut-30在发酵第3天补加硫酸铵，第5天补加玉米浆的发酵生长与产酶随发酵时间变化的曲线图。 

图5为黑曲霉传统间歇式发酵生长与产酶随发酵时间变化的曲线图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术方案的限制。 

实施例中的预处理草是稻草，湿度为20%左右，平均长度为2厘米左右；预处理条件是直接将2公斤稻草置于50升的预处理压力容器中，在200摄氏度的湿热蒸汽下预处理20 min，预处理后的秸秆烘干后进行粉碎，再通过200目的筛子获得的。 

实施例1：以里氏木霉Rutc-30为发酵菌株 

在50L发酵罐中，以经过预处理的稻草为产酶的唯一碳源与产酶诱导剂配制培养基，其培养基组分为：预处理草30g/L，玉米浆（CSL）3g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.4 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L， MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4mg/L，MnSO₄·7H₂O 1.6mg/L，CoCl₂·6H₂O 2mg/L，CaCl₂ 0.01g/L；121℃灭菌20min，降温至30℃，以5%的接种量接种培养好的Rutc-30的种子2L于灭菌后的发酵罐，30℃发酵培养7天产酶发酵结束，测定酶活最高为2.12u/ml，生长与产酶曲线如图1所示。

实施例2：以里氏木霉Rutc-30为发酵菌株 

在50L发酵罐中，以经过预处理的稻草为产酶的唯一碳源与产酶诱导剂配制培养基，其培养基组分为：预处理草30g/L，玉米浆（CSL）1g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.4 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L， MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4mg/L，MnSO₄·7H₂O 1.6mg/L，CoCl₂·6H₂O 2mg/L，CaCl₂ 0.01g/L；121℃灭菌20min，降温至30℃，以2.5%的接种量接种培养好的Rutc-30的种子1L于灭菌后的发酵罐，在发酵第3天及第5天分别补加 100g/L的玉米浆溶液100ml，30℃发酵培养7天产酶发酵结束；测定酶活最高为3.21u/ml，生长与产酶曲线如图2所示。

实施例3：以里氏木霉Rutc-30为发酵菌株 

在50L发酵罐中，以经过预处理的稻草为产酶的唯一碳源与产酶诱导剂配制培养基，其培养基组分为：预处理草30g/L，玉米浆（CSL）3g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L， MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4mg/L，MnSO₄·7H₂O 1.6mg/L，CoCl₂·6H₂O 2mg/L，CaCl₂ 0.01g/ L；121℃灭菌20min，降温至28℃，以1%的接种量接种培养好的Rutc-30的种子400ml于灭菌后的发酵罐；在发酵第2天及第4天分别补加 100g/L的(NH₄)₂SO₄  100ml，28℃发酵培养7天产酶发酵结束；测定酶活最高为2.85u/ml，生长与产酶曲线如图3所示。

实施例4：以里氏木霉Rutc-30为发酵菌株 

在50L发酵罐中，以经过预处理的稻草为产酶的唯一碳源与产酶诱导剂配制培养基，其培养基组分为：预处理草30g/L，玉米浆（CSL）2g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L， MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4mg/L，MnSO₄·7H₂O 1.6mg/L，CoCl₂·6H₂O 2mg/L，CaCl₂ 0.01g/ L；121℃灭菌20min，降温至29℃，以2.5%的接种量接种培养好的Rutc-30的种子1L于灭菌后的发酵罐，在发酵第3天补加100g/L的(NH₄)₂SO₄ 溶液100ml，第5天补加灭100g/L的玉米浆溶液200ml，29℃发酵培养7天产酶发酵结束；测定酶活最高为3.56u/ml，生长与产酶曲线如图4所示。

实施例5：以黑曲霉为发酵菌株 

以微晶纤维素为产酶的唯一碳源与产酶诱导剂配制培养基，其培养基组分为：微晶纤维素30g/L，蛋白胨10g/L，(NH₄)₂SO₄ 5 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L， MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4mg/L，MnSO₄·7H₂O 1.6mg/L；培养基于50L的发酵罐121℃灭菌20min，降温至28℃，以5%的接种量接种培养好的黑曲霉的种子液2L，28℃发酵培养7天产酶发酵结束；测定酶活最高为1.65u/ml，生长与产酶曲线如图5所示。

实施例6：以黑曲霉为发酵菌株 

以经过微晶纤维素为产酶的唯一碳源与产酶诱导剂配制培养基，其培养基组分为：微晶纤维素30g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)₂SO₄ 3 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L， MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 5mg/L，ZnSO₄·7H₂O 1.4mg/L，MnSO₄·7H₂O 1.6mg/L；培养基于50L的发酵罐121℃灭菌20min，降温至28℃，以5%的接种量接种培养好的黑曲霉的种子液2L，在发酵第3天补加 100g/L的(NH₄)₂SO₄溶液300ml，第5天补加100g/L的蛋白胨，溶液500ml， 28℃发酵培养7天产酶发酵结束；测定酶活最高为2.53u/ml。

图1、图2、图3及图4显示与图1所示的传统的间歇式发酵里氏木霉Rutc-30相比，前期少量的N源发酵菌丝的生物量明显下降，生物量最高依次分别为：20.04g/L、15.01 g/L、15.11 g/L及15.36 g/L，菌丝生长在前期受到了抑制，防止了菌丝大量的生长；补加有机氮或补加无机氮都能提高发酵酶活，单纯补加有机氮效果要好于补加无机氮；在补加的效果中前期补加无机氮后期补加有机氮能获得最好的补加效果，酶活最高可达3.56 u/ml，是传统的1.7倍左右。 

图5为以黑曲霉为发酵菌株的发酵，同样验证了补加氮源能有效的提高发酵酶活。 

本发明公开了一种分批补加氮源培养真菌生产纤维素酶的方法，在发酵前期添加少量的氮源，降低了初始培养基的粘度，提高了传质传热的效率，同时低浓度的氮源降低了发酵培养基溶液的渗透压，更利于延滞期菌丝的生长；低浓度的氮源在发酵过程中抑制了菌丝的大量生长，降低了非产酶营养消耗的比率，在产酶过程中通过分批补加N源，保证了产酶N源的需求，极大地促进了产酶营养的利用率，同样营养浓度情况下发酵酶活与传统发酵提高1~2倍，提高了产酶发酵营养的利用率，降低了生产成本，该培养方法更容易适应产业化的推广。