抑制A型流感病毒M1蛋白发生磷酸化的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种抑制A型流感病毒M1蛋白发生磷酸化的方法及其应用。本发明提供的抑制A型流感病毒的M1蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流感病毒的M1蛋白自N末端第132位氨基酸残基由酪氨酸突变为其它氨基酸。所述其它氨基酸为丙氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸。所述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1所示。本发明对于流感病毒侵染的机理分析，流感病毒的防治等具有重大价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制A型流感病毒M1蛋白发生磷酸化的方法及其应用，还涉及A 型流感病毒的M1蛋白的磷酸化位点和相关结构域。

背景技术

流行性感冒病毒（influenza virus），是正粘病毒科（Orthomyxoviridae） 流行性感冒病毒(Influenza virus)属的代表种，简称流感病毒，包括人流感病 毒和动物流感病毒。人流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行 性感冒（流感）的病原体。甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大 流行，例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流 感。乙型流感病毒对人类致病性较低。丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微 的上呼吸道感染，很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分离成功，乙型流感 病毒于1940年获得，丙型流感病毒直到1949年才成功分离。

甲型流感病毒的RNA由8个节段组成，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚集酶， 第4个节段负责编码血凝素；第5个节段负责编码核蛋白，第6个节段编码的是神 经氨酸酶；第7个节段编码基质蛋白（M1蛋白），第8个节段编码的是一种未知功能 的能起到拼接RNA功能的非结构蛋白。

基质蛋白构成了病毒的外壳骨架。基质蛋白与病毒最外层的包膜紧密结合起 到保护病毒核心和维系病毒空间结构的作用。当流感病毒在宿主细胞内完成其繁 殖之后，基质蛋白是分布在宿主细胞细胞膜内壁上的，成型的病毒核心衣壳能够 识别宿主细胞膜上含有基质蛋白的部位，与之结合形成病毒结构，并以出芽的形 式突出释放成熟病毒。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制A型流感病毒M1蛋白发生磷酸化的方法及其应用。

本发明提供的抑制A型流感病毒的M1蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流感病毒 的M1蛋白自N末端第132位氨基酸残基由酪氨酸突变为其它氨基酸。所述其它氨基酸 为丙氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸。所述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1 所示。

本发明还提供了一种抑制A型流感病毒的M1蛋白发生磷酸化的方法，是将A型流 感病毒中编码M1蛋白自N末端第132位酪氨酸的密码子突变为编码其它氨基酸的密码 子，从而抑制A型流感病毒的M1蛋白发生磷酸化。所述其它氨基酸为丙氨酸、苯丙氨 酸或天冬氨酸。所述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1所示。所述酪氨酸 的密码子具体可为“TAC”，所述丙氨酸的密码子具体可为“GCC”，所述苯丙氨酸的密 码子具体可为“TTC”，所述天冬氨酸的密码子具体可为“GAC”。

本发明还提供了一种降低A型流感病毒的M1蛋白磷酸化水平的方法，是将A型流 感病毒的基因组中编码M1蛋白自N末端第132位酪氨酸的密码子突变为编码其它氨基 酸的密码子，从而降低A型流感病毒的M1蛋白磷酸化水平。所述其它氨基酸为丙氨酸、 苯丙氨酸或天冬氨酸。所述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1所示。所述 酪氨酸的密码子具体可为“TAC”，所述丙氨酸的密码子具体可为“GCC”，所述苯丙氨 酸的密码子具体可为“TTC”，所述天冬氨酸的密码子具体可为“GAC”。

本发明还提供了一种抑制A型流感病毒的M1蛋白自N末端第132位氨基酸残基发 生磷酸化的方法，是将第132位氨基酸残基的密码子突变为编码其它氨基酸的密码子， 从而抑制A型流感病毒的M1蛋白第132位氨基酸残基发生磷酸化。所述其它氨基酸为 丙氨酸、苯丙氨酸或天冬氨酸。所述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1 所示。所述酪氨酸的密码子具体可为“TAC”，所述丙氨酸的密码子具体可为“GCC”， 所述苯丙氨酸的密码子具体可为“TTC”，所述天冬氨酸的密码子具体可为“GAC”。

本发明还保护一种蛋白质，是将A型流感病毒的M1蛋白自N末端的第132位氨基 酸残基由酪氨酸突变为其它氨基酸得到的蛋白质。所述其它氨基酸为丙氨酸、苯丙氨 酸或天冬氨酸。所述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1所示。

本发明还保护一种DNA分子（特异DNA分子），是将A型流感病毒的M1蛋白的编 码基因自5’末端第394至396位氨基酸残基的密码子由酪氨酸的密码子突变为编码 其它氨基酸的密码子得到的DNA分子。所述其它氨基酸为丙氨酸、苯丙氨酸或天冬氨 酸。所述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1所示。所述A型流感病毒的 M1蛋白的编码基因为如下1）至4）中任一所述的DNA分子：1）序列表中序列2自5’ 端第1至第759位核苷酸所示的DNA分子；2）序列表中序列2所示的DNA分子；3） 在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4）与1） 或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述严格条件 为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。所述 酪氨酸的密码子具体可为“TAC”，所述丙氨酸的密码子具体可为“GCC”，所述苯丙氨 酸的密码子具体可为“TTC”，所述天冬氨酸的密码子具体可为“GAC”。

本发明还保护一种重组病毒，是将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒 pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、质粒pHH21-NS、质粒 pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2、质粒pcDNA3.0-NP和特异重 组质粒共转染离体哺乳动物细胞后培养哺乳动物细胞得到的重组病毒（细胞培养上清 液即为重组病毒液）；

所述质粒pHH21-PA为在载体pHH21的多克隆位点（如BsmBI酶切位点）插入序列 表的序列3所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-PB1为在载体pHH21的 多克隆位点（如BsmBI酶切位点）插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的质 粒；所述质粒pHH21-PB2为在载体pHH21的多克隆位点（如BsmBI酶切位点）插入序 列表的序列5所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-HA为在载体pHH21 的多克隆位点（如BsmBI酶切位点）插入序列表的序列6所示的双链DNA分子得到的 质粒；所述质粒pHH21-NP为在载体pHH21的多克隆位点（如BsmBI酶切位点）插入序 列表的序列7所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pHH21-NA为在载体pHH21 的多克隆位点（如BsmBI酶切位点）插入序列表的序列8所示的双链DNA分子得到的 质粒；所述质粒pHH21-NS为在载体pHH21的多克隆位点（如BsmBI酶切位点）插入序 列表的序列9所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pcDNA3.0-PA为在载体 pcDNA3.0的多克隆位点（如KpnI和XhoI酶切位点之间）插入序列表的序列3所示的 双链DNA分子得到的质粒；所述质粒pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的多克隆位点 （如KpnI和XhoI酶切位点之间）插入序列表的序列4所示的双链DNA分子得到的质 粒；所述质粒pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的多克隆位点（如KpnI和XhoI酶切 位点之间）插入序列表的序列5所示的双链DNA分子得到的质粒；所述质粒 pcDNA3.0-NP为在载体pcDNA3.0的多克隆位点（如KpnI和XhoI酶切位点之间）插入 序列表的序列7所示的双链DNA分子得到的质粒；所述特异重组质粒为在载体pHH21 的多克隆位点（如BsmBI酶切位点）插入所述特异DNA分子得到的质粒。

所述哺乳动物细胞具体可为HEK 293T/17细胞。

本发明还保护所述重组病毒在制备A型流感病毒疫苗中的应用。

本发明还保护A型流感病毒的M1蛋白的磷酸化位点，为其自N末端第132位氨基 酸残基。所述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1所示。

本发明还保护A型流感病毒的M1蛋白中与磷酸化相关的三个结构域，分别为其自 N末端第65-71位氨基酸残基，第76-78位氨基酸残基和132-135位氨基酸残基。所 述A型流感病毒的M1蛋白具体如序列表的序列1所示。

以上任一所述的A型流感病毒具体可为A/WSN/1933(H1N1)毒株。

本发明发现，从A/WSN/1933(H1N1)毒株感染的293T细胞中纯化获得的M1蛋白是 被磷酸化的。质谱鉴定该磷酸化蛋白中第132位酪氨酸为磷酸化位点。对该位点进行 突变后M1的酪氨酸磷酸化水平显著下降。

本发明对于流感病毒侵染的机理分析，流感病毒的防治等具有重大价值。

附图说明

图1为实施例1中的磷酸化蛋白电泳图谱(箭头标注磷酸化的M1蛋白)。

图2为实施例1中磷酸化的M1条带的质谱鉴定结果。

图3为实施例2中的western blot结果；1为不含有M1蛋白的细胞裂解液(对照) 2为M1蛋白；3为MY132A突变蛋白；4为MY132F突变蛋白。

图4为实施例3中的western blot结果；1为第四组；2为第一组；3为第二组； 4为第三组。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

氯化钠、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(简称HEPES)、甘油、乙二胺四乙 酸（简称EDTA）、Nonidet P-40（简称NP40）和TPCK处理的胰酶均购自Sigma。牛血 清白蛋白(BSA)购自江晨生物。青霉素、链霉素购自碧云天公司。十二烷基硫酸钠(简 称SDS)、低熔点琼脂糖购自Amersco公司。phos-tag SDS-PAGE中所用的凝胶为 Phos-tag Acrylamide，购自Wako(日本)。蛋白酶抑制剂（cocktail）购自Roche公 司。抗磷酸化酪氨酸抗体(鼠单克隆抗体，sc-508)购自Santa Cruz。具有已知分子量 的预先染色的蛋白标准品购自Thermo。MDCK细胞：购自ATCC,CCL-34。HEK 293T/17 细胞（简称293T细胞衍生系）：购自ATCC,CRL-11268。碱性磷酸酶：购自Takara,D2250。 载体pcDNA3.0：购自上海希匹吉生物技术有限公司,产品目录号:CPC030。大肠杆菌 DH5α：上海北诺生物科技有限公司。

载体pHH21：Neumann,G.et al.,Generation of influenza A viruses entirely  from cloned cDNAs.P Nat1 Acad Sci Usa 96(16),9345(1999)。

WSN病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株：Neumann,G.et al.,Generation of influenza  A viruses entirely from cloned cDNAs.PNat1 Acad Sci Usa 96(16),9345(1999)。

实施例中所使用的WSN病毒（流感病毒）为A/WSN/1933(H1N1)毒株。实施例中， 采用病毒感染液调整WSN病毒浓度从而实现不同剂量的感染。

病毒感染液：含2μg/ml TPCK处理的胰酶（胰酶是以胰酶母液的方式加入的，胰 酶母液为用PBS缓冲液配制的胰酶浓度为0.25g/100mL的溶液）、100U/ml青霉素和 100U/ml链霉素的无血清DMEM培养基。

细胞裂解液（pH7.4）：含150mM氯化钠、20mM HEPES、10%（体积比）甘油、1mM EDTA、1g/100mL NP40、蛋白酶抑制剂（cocktail），其余为水。

洗脱缓冲液：氯化钠的浓度为300mM，其它同细胞裂解液。

抗M1蛋白的单抗（即抗A型流感病毒M1蛋白的鼠源单克隆抗体）：Liu,X.L.et  al.,Cyclophilin A interacts with influenza A virus M1 protein and impairs the  early stage of the viral replication.Cell Microbio1 11(5),730(2009).。

实施例1、磷酸化M1蛋白的获得以及磷酸化位点的鉴定

一、磷酸化M1蛋白的获得

1、将A/WSN/1933(H1N1)毒株以MOI=0.1的剂量感染HEK 293T/17细胞，37℃培 养12-16小时后收获细胞。

2、将步骤1收获的细胞用细胞裂解液4℃处理30分钟，12000rpm离心15min， 收集上清液。

3、在步骤2得到的上清液中加入抗M1蛋白的单抗，4℃孵育1小时，然后加入 protein G beads 4℃孵育3小时，吸弃上清，将珠子（beads）用洗脱缓冲液在4℃ 下洗3次（每次10分钟），与珠子（beads）结合的即为M1蛋白。

4、将步骤3获得的结合有M1蛋白的珠子用碱性磷酸酶37℃处理2小时（碱性磷 酸酶的作用为：使磷酸化蛋白去磷酸化），然后进行磷酸化蛋白电泳（phos-tag  SDS-PAGE）并银染显色。结果见图1。图1中，M为预染的蛋白标准品，1为碱性磷酸 酶处理后的M1蛋白，2为碱性磷酸酶处理前的M1蛋白。与预染的蛋白标准品进行比 较，胶上出现的比普通M1蛋白迁移速率慢且对碱性磷酸酶敏感的条带,即为磷酸化的 M1条带。结果表明，步骤3获得的M1蛋白为磷酸化蛋白，碱性磷酸酶可以使其发生 去磷酸化反应。

二、质谱鉴定磷酸化位点

将磷酸化的M1条带从胶上切下，送样至中国科学院动物研究所大型仪器平台进行 样品处理及质谱鉴定(Nano-LC MS/MS,LCQ DECA XP^PLUS Thermo)。

结果见图2。b19与b18的核质比差值显示Y132被磷酸化修饰。鉴定结果显示， 该条带为A型流感病毒的M1蛋白，且在132位酪氨酸残基处具有磷酸化修饰。

实施例2、突变蛋白的制备和磷酸化鉴定

一、构建重组质粒

1、构建质粒pHH21-PA

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列3所示的双链DNA分子，得到 质粒pHH21-PA。

2、构建质粒pHH21-PB1

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到 质粒pHH21-PB1。

3、构建质粒pHH21-PB2

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到 质粒pHH21-PB2。

4、构建质粒pHH21-HA

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到 质粒pHH21-HA。

5、构建质粒pHH21-NP

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到 质粒pHH21-NP。

6、构建质粒pHH21-NA

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列8所示的双链DNA分子，得到 质粒pHH21-NA。

7、构建质粒pHH21-M

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到 质粒pHH21-M。

8、构建质粒pHH21-NS

在载体pHH21的BsmBI酶切位点插入序列表的序列9所示的双链DNA分子，得到 质粒pHH21-NS。

9、构建质粒pcDNA3.0-PA

在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列3所示的双链 DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PA。

10、构建质粒pcDNA3.0-PB1

在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列4所示的双链 DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PB1。

11、构建质粒pcDNA3.0-PB2

在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列5所示的双链 DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PB2。

12、构建质粒pcDNA3.0-NP

在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间插入序列表的序列7所示的双链 DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-NP。

13、构建重组质粒

以质粒pHH21-M为模板，使用Newpep点突变试剂盒(Cat.No.80111-01,北京诺派 生物科技有限公司)按试剂盒说明书构建各种重组质粒。

（1）合成构建M1蛋白的三种突变蛋白（Y132A、Y132FY132D）编码基因的三对引 物

M1-Y132A-F:5’-GGGCCTCATAGCCAACAGGATGGGGGCTGTGACCAC-3’；

M1-Y132A-R:5’-GCCCCCATCCTGTTGGCTATGAGGCCCATACAACTG-3’。

M1-Y132F-F:5’-GGGCCTCATATTCAACAGGATGGGGGCTGTGACCAC-3’；

M1-Y132F-R:5’-GCCCCCATCCTGTTGAATATGAGGCCCATACAACTG-3’。

M1-Y132D-F:5’-GGGCCTCATAGACAACAGGATGGGGGCTGTGACCAC-3’；

M1-Y132D-R:5’-GCCCCCATCCTGTTGTCTATGAGGCCCATACAACTG-3’。

（2）以质粒pHH21-M为模板，用M1-Y132A-F和M1-Y132A-R组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物（突变质粒）。

（3）用SDM酶在37℃酶切步骤（2）的PCR扩增产物2小时（消化模板质粒）。

（4）将步骤（3）的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌MY132A (即含有重组质粒pHH21-MY132A的大肠杆菌，根据测序结果，对重组质粒pHH21-MY132A 进行结构描述如下：将质粒pHH21-M中的M1蛋白自N末端第132位酪氨酸的密码子突 变为了丙氨酸的密码子。

（5）以质粒pHH21-M为模板，用M1-Y132F-F和M1-Y132F-R组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物（突变质粒）。

（6）用SDM酶在37℃酶切步骤（5）的PCR扩增产物2小时（消化模板质粒）。

（7）将步骤（6）的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌MY132F(即 含有重组质粒pHH21-MY132F的大肠杆菌，根据测序结果，对重组质粒pHH21-MY132F 进行结构描述如下：将质粒pHH21-M中的M1蛋白自N末端第132位酪氨酸的密码子突 变为了苯丙氨酸的密码子。

（8）以质粒pHH21-M为模板，用M1-Y132D-F和M1-Y132D-R组成的引物对进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物（突变质粒）。

（9）用SDM酶在37℃酶切步骤（8）的PCR扩增产物2小时（消化模板质粒）。

（10）将步骤（9）的产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，得到重组菌MY132D (即含有重组质粒pHH21-MY132D的大肠杆菌，根据测序结果，对重组质粒pHH21-MY132D 进行结构描述如下：将质粒pHH21-M中的M1蛋白自N末端第132位酪氨酸的密码子突 变为了天冬氨酸的密码子。

二、突变蛋白的制备

1、MY132A突变蛋白的制备

（1）将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、质粒 pHH21-NP、质粒pHH21-NA、重组质粒pHH21-MY132A、质粒pHH21-NS、质粒pcDNA3.0-PA、 质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP以等质量的配比通过脂 质体Lipofectamine2000(Invitrogen)共转染HEK 293T/17细胞，37℃培养6小时。

（2）更换步骤(1)的细胞的培养基为病毒感染液，37℃培养72小时后收获细胞。

（3）将步骤（2）收获的细胞用细胞裂解液4℃处理30分钟，12000rpm离心15min， 收集上清液。

（4）在步骤（3）得到的上清液中加入抗M1蛋白的单抗，4℃孵育1小时，然后 加入protein G beads 4℃孵育3小时，吸弃上清，将珠子（beads）用洗脱缓冲液在 4℃下洗3次（每次10分钟），与珠子（beads）结合的即为MY132A突变蛋白。

2、MY132F突变蛋白的制备

用重组质粒pHH21-MY132F代替重组质粒pHH21-MY132A，其它同步骤1，与珠子 （beads）结合的即为MY132F突变蛋白。

3、M1蛋白的制备

用质粒pHH21-M代替重组质粒pHH21-MY132A，其它同步骤1，与珠子（beads）结 合的即为M1蛋白。

4、western blot

将步骤1至3得到的各个蛋白进行western blot，采用的一抗为抗磷酸化酪氨酸 抗体，采用的二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG。

结果见图3。结果表明，将M1上的132位的酪氨酸(Y)突变成丙氨酸(A)或者苯丙 氨酸(F)后，与野生型的M1相比，酪氨酸磷酸化水平显著下降。该结果说明该132位 的酪氨酸为M1上的主要的酪氨酸磷酸化位点。

实施例3、病毒拯救

1、将HEK 293T/17细胞接种于60mm平皿，每皿1×10⁶个细胞，培养12小时。

2、分组处理如下：

第一组：将质粒pHH21-PA、质粒pHH21-PB1、质粒pHH21-PB2、质粒pHH21-HA、 质粒pHH21-NP、质粒pHH21-NA、重组质粒pHH21-MY132A、质粒pHH21-NS、质粒 pcDNA3.0-PA、质粒pcDNA3.0-PB1、质粒pcDNA3.0-PB2和质粒pcDNA3.0-NP各0.5μg 通过脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)共转染HEK 293T/17细胞，37℃培养6 小时后更换培养基为病毒感染液，继续培养72小时后收获细胞。

第二组：与第一组的差异仅在于用重组质粒pHH21-MY132F代替重组质粒 pHH21-MY132A。

第三组：与第一组的差异仅在于用重组质粒pHH21-MY132D代替重组质粒 pHH21-MY132A。

第四组：与第一组的差异仅在于用质粒pHH21-M代替重组质粒pHH21-MY132A。

3、收获培养上清，通过噬斑鉴定检测病毒滴度，同时收获细胞，将细胞破碎后进 行western blot（检测各主要病毒蛋白的表达）。

噬斑鉴定的方法：（1）将MDCK细胞接种于12孔板中，每孔约1×10⁵细胞，37℃、 5%CO₂培养箱中培养过夜；（2）用PBS缓冲液洗去细胞表面的培养基，将待测的培养上 清用病毒感染液梯度稀释后分别加入各孔中，每个稀释度设置三个重复孔，37℃孵育 1小时；（3）吸弃上清并用PBS缓冲液清洗细胞，每孔加入1毫升混合溶液（混合溶 液的制备方法：将1体积份融化后降温至37℃左右的3%低熔点琼脂糖与1体积份预热 到37℃的无酚红DMEM培养基等体积混合，且混合物中加入TPCK处理的胰酶、青霉素 和链霉素，使得胰酶浓度为2μg/ml，青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)；（4）将 12孔板4℃放置15分钟以上，待琼脂凝固后，将孔板翻转过来倒置在37℃培养箱中 培养，在显微镜下观察细胞病变情况，培养3天（实际应用中，2-4天均可）后，将 12孔板从培养箱中取出，计数空斑数。

第四组得到的培养上清的滴度为（2.553±0.19）×10⁴PFU/ml，第一组至第三组 的培养上清的滴度均为0，即不能使MDCK产生噬斑。

western blot中：用于检测HA蛋白的一抗：购自北京义翘神州生物技术有限公 司，产品目录号：VG11692-C；用于检测NP蛋白的一抗购自Thermo Scientific公司， 产品目录号：PA5-32242；用于检测M1蛋白的一抗为抗M1蛋白的单抗。

结果见图4，各组重组系统中流感病毒的三种重要蛋白(HA、NP、M1)均能够正常 表达。