短日照敏感型细胞死亡SSD1基因及其编码蛋白与应用

摘要

本发明公开了一种短日照敏感型细胞死亡SSD1基因及其编码蛋白与应用，所述SSD1基因具有如SEQ ID NO：1所示的序列。本发明是以模式植物拟南芥为试验材料，通过EMS诱变，筛选获得一个短日照敏感型细胞死亡突变体ssd1。采用图位克隆法分离该基因，并发现了基因突变位点，该基因的缺失在短日照条件下导致了细胞死亡。SSD1基因是拟南芥在短日照条件下生长所必需的，且在植物中具有广泛的同源性。该基因生物学功能的发现以及同源基因的相关研究有助于深化光周期调控植物细胞死亡的研究，对探讨植物细胞死亡的分子机理具有重要的科学意义，同时对短日照地区作物品种改良具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体为一种短日照敏感型细胞死亡SSD1基 因及其编码蛋白与应用。

背景技术

细胞死亡是生物体的一种常见的生命现象。细胞因受到严重损伤而累及胞 核时，呈现代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化，此即细胞死亡。 一般来讲，细胞死亡可分为两种类型：生理性死亡(physiological cell death)和非 生理性死亡(nonphysiological cell death)。生理性死亡是由细胞内的死亡程序所控 制的细胞死亡，生物在其生长发育及形态建成过程中，利用生理性死亡控制细 胞的数目，或作为一种防御机制清除被感染、被诱变或被损伤的细胞。非生理 性死亡是生物在生长发育过程中由于意外的外界因素如激光照射、有毒物质伤 害或营养缺乏等，或者由于生物体内的缺陷如产生ATP的酶突变，或者突变后 的基因产物对细胞具有毒害作用等原因引起的细胞死亡(Vaux and Korsmeyer, 1999)。因此，导致生物体细胞死亡的机制非常复杂。

目前关于植物细胞死亡的遗传调控机制有了一定的进展，近年来的研究发 现光周期也会调控植物的细胞死亡。在拟南芥中，Dietrich等筛选了一系列受光 照调控的细胞死亡突变体，其中lsd1和lsd3的细胞死亡在短日照条件下受到抑 制，而lsd2和lsd5的细胞死亡在长日照条件下受到抑制(Dietrich et al.,1994)； Ishikawa等分离出的三个细胞死亡突变体，其中len1和len3只在短日照条件下 导致细胞死亡(Ishikawa et al.,2003;Ishikawa et al.,2006)，而lin2在所有的生长 条件下都会发生细胞死亡，但在长日照条件下较严重(Ishikawa et al.,2001)；突 变体atips1是肌醇合成的关键酶基因发生突变，同时其细胞死亡依赖于光照长度 (Meng et al.,2009)；flu1突变体在由黑暗转为光照培养时，也会迅速表现出白化 和坏死(Meskauskiene et al.,2001)。

发明内容

针对以上的背景技术，本发明提供一种短日照敏感型细胞死亡SSD1基因及 其编码蛋白与应用，所述SSD1基因具有如SEQ ID NO：1所示的序列。

其中，所述SSD1基因编码序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的氨基酸序 列如SEQ ID NO：5所示。

其中，所述SSD1基因的应用，是SSD1基因在光周期调控植物细胞死亡中 的应用。

其中，所述SSD1基因的应用，是SSD1基因在转基因植物中的应用。

其中，所述SSD1基因的应用，是该基因的功能丧失在光周期调控植物细 胞死亡中的应用。

其中，所述SSD1基因的应用，是植物中其同源基因的研究在光周期调控 植物细胞死亡中的应用。

本发明是以模式植物拟南芥为试验材料，通过筛选EMS诱变的突变体库， 在短日照条件下筛选得到一个细胞死亡突变体，命名为短日照敏感型细胞死亡 突变体(short-day sensitive cell death mutant 1,ssd1）。

采用图位克隆法分离SSD1基因，并发现了该基因突变位点。实验结果表明， SSD1基因的突变在短日照条件下导致了细胞的死亡，SSD1基因是拟南芥在短日 照条件下生长所必需的，且在植物中具有广泛的同源性。进一步，本发明通过 试验表明，SSD1基因具有在短日照条件下调控植物细胞死亡的功能，该基因生 物学功能的发现以及同源基因的相关研究有助于深化光周期调控植物细胞死亡 的研究，对探讨植物细胞死亡的分子机理具有重要的科学意义，同时对短日照 地区作物品种改良具有重要的应用价值。

附图说明

图1是短日照条件下ssd1突变体和野生型（Col-0）的表型图（Bar=5cm）。

图2是短日照条件下ssd1突变体的白化死亡的茎杆、叶片及果荚图 （Bar=1cm）。

其中：左图为茎杆；右上图为叶片；右下图为果荚。

图3是ssd1突变体在MS培养基（含1%蔗糖）上的种子萌发及幼苗的白 化死亡表型图。

其中：LD表示长日照；SD表示短日照；d为天数；

四副小图皆为野生型（Col-0）与ssd1突变体的对照图，左侧为野生型， 右侧为ssd1突变体。

图4是转基因植株的互补验证图。

图5是莲座叶的台盼蓝染色图（Bar=250μm）。

具体实施方式

实施例1：拟南芥EMS诱变与筛选

一、化学诱变处理

将拟南芥野生型（Col-0）种子置于重蒸水中搅拌30分钟，在4℃下放置 12小时后，把种子转移到100mM的磷酸缓冲液（pH6.5）中，加入0.2%（v/v） 的甲基磺酸乙酯（EMS），封口后放在水浴（25℃）振荡器上振荡12hr，然后用 蒸馏水漂洗种子。

二、诱变植株培养

将漂洗好的种子置于4℃下春化3天，播种于人工土壤（东北黑土：蛭石 =1：1，v/v）中。在光照培养室生长，培养温度22±2℃；光照强度80-120μmol m^-2s^-1；相对湿度65%；光周期为16小时光照、8小时黑暗。采收成熟种子即 M₁代，M₁代自交收种得M₂代，干燥备用。

三、突变体的筛选

将M₂代种子表面消毒、用无菌水冲洗后，点播于MS培养基上。在4℃黑 暗下春化3天，转入长日照条件（16小时光照、8小时黑暗）下生长。培养一 周转入人工土壤，生长2-3周，然后转入短日照条件（8小时光照、16小时黑 暗）下，生长4-7天，从中筛选出现细胞死亡的植株，然后转入正常光照条件 下（即长日照条件）生长，单株收获种子(M₃)。在相同条件下再分别对M₃代株 系进行筛选，鉴定出一个稳定遗传的株系，命名为短日照敏感型细胞死亡突变 体(short-day sensitive cell death mutant 1,ssd1）。

在长日照条件下，该突变体的表型与拟南芥野生型（Col-0）没有明显差异； 但将其转入短日照条件下，该突变体的表型出现异常，见图1，生长受到抑制， 植株叶片、幼嫩的茎、花序和果荚会发生部分萎蔫进而白化死亡，见图2，但 不导致植株整体死亡，可结少量种子。发明人继续观察比较该突变体与野生型 （Col-0），发现：铺种在含1%蔗糖的MS培养基上的ssd1突变体的种子萌发不 受光周期的影响，但是1周以后大部分突变体幼苗出现白化死亡，见图3。

实施例2：图位克隆法分离SSD1基因

一、图位克隆群体的构建

将ssd1突变体（Col-0背景）与另一生态型Landsberg erecta（Ler）进行杂 交，得到F₁代杂合体；F₁代杂合体自交，得到F₂代；播种F₂代种子，在短日照 条件下筛选出现细胞坏死的个体，在同一个育苗盘中同时铺种一行ssd1突变体 作为对照。共收集了2500株F₂遗传群体用于基因的图位克隆。

二、分子标记的选择与设计

根据TAIR网上（www.arabidopsis.org）公布的拟南芥全基因组DNA多态 性数据库，选择了分子标记：NT7123，EAT，F21M12，NGA63，F16J7-TRB， JV18/19，F21J9-83201。根据文献报道，设计了分子标记SGCSNP9772，见表1。 此外，基于TAIR网上CACP(Cereon Arabidopsis polymorphism Collection)释放的 Ler已测序的表达序列标签（EST）与Col-0序列进行比对，找出InDels位点， 设计了3对SSLP和5对CAPS分子标记用于基因精细定位，见表2及表3。引 物的合成皆由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

表1已公布用于定位的分子标记

表2新设计的SSLP分子标记

表3新设计的CAPS分子标记

三、重组子的PCR扩增及酶切检测

采用EasyTaq DNA Polymerase（TransGen），反应体系为20μl，其中10x  easytaq buffer:2μl；10mM dNTP:0.5μl；正反引物（10mM，序列见表1-表3中的 分子标记）各1μl；DNA模板:1μl；EasyTaq0.3μl，补加ddH₂O至20μl。反应程 序为：94℃2min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，30cycles；72℃10min；16℃ hold。采用4～5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

酶切反应体系如下：以10μl反应体系进行酶切反应，DNA的PCR扩增产 物通常加5μl，酶0.1μl，按比例加入相应的限制内切酶的buffer及0.1%BSA， 最后用ddH₂O补足10μl。本发明中采用的限制内切酶的最适反应温度都是37℃， 一般酶切4个小时即可。采用4～5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

四、SSD1基因的定位

已筛选的2500株F₂代遗传群体，利用已公布的及自行设计的分子标记进 行基因定位，通过上述的PCR条件及电泳分析检测，将SSD1基因定位在拟南 芥第1条染色体上的两个分子标记C4067和C4102之间约35Kb的范围内，该 区域位于BAC F12F1上。

五、SSD1基因的BAC亚克隆

采用亚克隆方法进一步分离克隆SSD1基因，用限制性内切酶将BAC质粒 F12F1酶解成小片段，连入双元表达载体pCAMBIA1301，共获得7个片段的阳 性克隆。将这7个克隆转化拟南芥ssd1突变体，通过抗性筛选均获得一定数量 的转基因植株。转基因植株经过短日照处理，只有片段克隆ESl-6.4的全部转基 因植株与野生型植株相同，不产生细胞坏死（见图4），而其它的转基因植株和 ssd1植株均有细胞坏死表型。

将片段克隆ESl-6.4进行测序，测序由北京六合华大基因科技股份有限公 司完成。结果显示：在ssd1突变体中，ESl-6.4片段内仅一个基因发生了一个位 点的点突变，推测可能是该基因突变导致形成细胞坏死，初步将该基因确定为 SSD1基因。

该SSD1基因（gDNA）全长3,456bp（如SEQ ID NO：1所示），编码序 列（CDS）全长1,266bp（如SEQ ID NO：3所示），推导编码含有421个氨基 酸的蛋白质（如SEQ ID NO：5所示）。而对ssd1突变体的SSD1基因进行测序， 结果与该SSD1基因比较可知，其基因组DNA序列（如SEQ ID NO：2所示） 的第1,182个碱基、CDS序列（如SEQ ID NO：4所示）第470个碱基由G突 变成A，导致编码的氨基酸序列第157个氨基酸由色氨酸（Trp）变为终止密码 子TAG（如SEQ ID NO：6所示）。

实施例3：SSD1基因的遗传互补实验

一、互补载体的构建

采用高保真酶TransStart FastPfu DNA Polymerase（TransGen）从拟南芥野 生型Col-0扩增出含SSD1基因的片段，全长3175bp，所用引物FP(5’- gtaCCCGGGATGGCGTTGCTGAAGTCTTT-3’)和RP(5’- cgaGAGCTCACTTATTGTTAATGGGTTGG-3’)。扩增反应体系为50μl，其中 5×TransStart FastPfu Buffer:10μl；2.5mM dNTP:5μl；10mM正向引物FP:2μl； 10mM反向引物RP:2μl；模板Col-0 DNA:0.5-2ng；TransStart FastPfu DNA  Polymerase:1μl；加ddH₂O补足至50μl。扩增程序为：95℃预变性2min；95℃ 20s、55℃20s、72℃2min，30个循环；72℃继续延伸5min。

将载体质粒pROK2及纯化的PCR产物采用SmaI和SacI进行双酶切消化， 采用T4 DNA Ligase（TransGen）将酶切纯化的AtSSD1基因及质粒pROK2连接， 基因片段与质粒按照3:1的分子比例混和，反应体系为10μl，其中10x T₄ DNA  Ligase Buffer：1μl；T₄连接酶：1μl；50%PEG4000：1μl。16℃水浴中连接过夜。 采用热激法转化大肠杆菌DH5α，在含50mg/L Kan的LB培养基筛选抗性转化 子，通过菌落PCR反应及测序进一步验证转化子。

二、转基因植物获得

将上述步骤得到的重组表达载体pROK2-AtSSD1用电激转化方法转入农杆 菌Agl-1菌株中，在含50μg/ml Kan和100μg/ml Carb的LB固体培养基上筛选 抗性转化子。挑取单菌落接种于5ml含50μg/ml Kan和100μg/ml Carb的LB液 体培养基中，28℃220rpm振荡培养2天；按照1:100的比例将活化的菌液转接 到50ml含相同抗生素的LB液体培养基中，28℃220rpm振荡培养过夜。菌体 用5%的蔗糖溶液重悬，至OD₆₀₀在0.8-1.0之间，转化前加入0.02%（体积比） 的渗透剂Silwet-77（LEHLE SEEDS）。采用Floral dip法转化拟南芥(Clough and  Bent,1998)。将成熟种子铺在含50μg/m1Kan的MS培养基上，筛选抗性苗，即 为转基因拟南芥T₁代。T₁代种子继续播种，进行自交，得到T₂代。将T₂代种 子继续铺种在含有相应抗生素的MS培养基上，统计比例，挑选符合3:1分离 比的株系，保留株系并移栽部分抗性苗在短日照条件下观察表型，同时以野生 型与ssd1突变体为对照，发现互补株系恢复了野生型表型，参见图4。

实施例4：ssd1突变体的台盼蓝染色

台盼蓝是一种检测细胞死亡和细胞膜损坏的染色剂，正常活细胞的细胞膜 结构完整，能阻止染料进入细胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，细胞 膜的通透性增加，解体的DNA结合台盼蓝被染成蓝色。具体操作过程(Keogh et  al.,1980;Bowling et al.,1997)如下：

在长日照条件下生长2周的拟南芥Col-0野生型及ssd1突变体植株，移至 短日照条件生长4天以上，将下端产生明显细胞死亡的莲座叶浸泡在台盼蓝染 液中，置于沸水浴中煮沸2min，室温放置12h(自然冷却，染色过夜)后，移至 2.5g/ml的水合氯醛中脱色3～4d(中间换3次脱色液)，置于脱色摇床慢慢振荡， 直到对照叶片全部脱色透明，在体式显微镜下观察细胞死亡情况并拍照记录（见 图5）。发现坏死细胞有的集中分布在叶片的某一特定区域，有的随机散布在叶 片上，而在野生型Col-0叶片中没有发现坏死细胞。

参考文献：

1.Vaux DL and Korsmeyer SJ.(1999)Cell death in development.Cell 96:245-254.

2.Dietrich R A,Delaney T P，Uknes S J,et al.(1994)Arabidopsis mutants simulating  disease resistance response.Cell 77:565-577.

3.Ishikawa A,Tanaka H,Nakai M,et a1.(2003)Deletion of a chaperonin 60βgene  leads to cell death in the Arabidopsis lesion initiation 1 mutant.Plant Cell Physiol  44:255-261.

4.Ishikawa A,Kimura Y，Yasuda M,Nakashita H and Yoshida S.(2006)Salicylic  acid-mediated cell death in the Arabidopsis len3 mutant.Biosci.Biotechnol.Biochem. 70:1447-1453.

5.Ishikawa A,Okamoto H,Iwasaki Y，et al.(2001)A deficiency of  coproporphyrinogen III oxidase causes lesion formation in Arabidopsis.Plant J.27: 89-99.

6.Meng P H,Raynaud C,Tcherkez G，et al.(2009)Crosstalks between myo-inositol  metabolism,programmed cell death and basal immunity in Arabidopsis.PLoS One4: e7364.

7.Meskauskiene R,Nater M,Goslings D,Kessler F,op den Camp R,Apel K(2001) FLU:a negative regulator of chlorophyll biosynthesis in Arabidopsis thaliana.Proc  Natl Acad Sci USA 98:12826-12831.

8.Clough SJ and Bent AF.(1998)Floral dip:a simplified method for  Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant J. 16:735-43.

9.Keogh RC,Deverall BJ and McLeod S.(1980)Comparison of histological and  physiological responses to Phakopsora pachyrhizi in resistant and susceptible  soybean.Trans.Br.Mycol.Soc.74:329-333.

10.Bowling SA,Clarke JD,Liu Y，Klessig DF and Dong X.(1997)The cpr5 mutant  of Arabidopsis expresses both NPR1-dependent and NPR1-independent resistance. Plant Cell 9:1573-1584.