人巨细胞病毒UL142基因转录、转录调控以及编码蛋白相互作用蛋白的鉴定

摘要

目的:
　　人巨细胞病毒(HCMV)是疱疹病毒科β属病毒，种属特异性强，人是其感染的唯一宿主。HCMV普遍存在于60-90％人群中，它不仅是免疫抑制患者的严重致病原，也是引起新生儿先天及围生期感染最常见、危害最大的一种病原体。HCMV感染可引起患儿的肝脾肿大，新生儿病理性黄疸，颅内钙化等多器官多系统的疾病和畸形，危害巨大。也可在AIDS和器官移植等免疫功能缺陷的患者中导致致死性的感染。研究HCMV感染的致病机制及防治对减少HCMV致病危害有重大意义。HCMV的复制及感染依赖于宿主细胞对病毒基因的转录时相，转录形式等复杂影响，不同时相的病毒基因转录产物在病毒复制过程中发挥各自不同功能和作用。因此研究病毒基因的转录调控和基因调控元件，对进一步研究HCMV基因的相关生物学作用，揭示HCMV致病机理具有重大意义。UL142基因位于HCMV临床分离株UL/b'区，在不同分离株中存在多种起始位置不同的基因转录本，这种转录起始位置的差异提示UL142基因不同转录本的表达调控存在差异，本文采用Northern blot及5'rapid amplification of cDNAends（5'-Full Race）等方法，对UL142基因的结构进行精细研究;同时采用pGL3双荧光素酶报告检测系统(Dual-Luciferase(@)Reporter Assay System)，凝胶电泳迁移率实验(EMSA)对UL142基因的转录调控机制进行了深入研究;应用酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid systems)，筛选与UL142基因编码蛋白(pUL142)相互作用的文库蛋白，针对其中的Snapin(SNAP相关蛋白)，通过体外转录MagneGSTTM Pull-down技术，进一步确定pUL142与之相互作用，并应用激光共聚焦显微镜技术在细胞内进行蛋白质共定位。UL142作为重要的免疫调节基因，可抑制NK细胞激活，从而对抗NK细胞的清除作用，因此是研究病毒蛋白如何逃避宿主免疫作用一个重要切入点，为揭示HCMV的致病机理提供理论依据。
　　方法:
　　一、实验材料
　　采用中国医科大学附属盛京医院病毒研究室保留的HCMV低传代临床分离株Han，人胚肺成纤维细胞(HELF)和人肾上皮细胞293细胞(Human Embryonic Kidney293 cells)购买于中科院的上海的细胞库;Northern blot试剂盒购自Roche公司，5'-Full Race Kit购自TakaRa公司，pGL3Luciferase ReporterVectors、Dual-Luciferase(@) Reporter Assay System，TheWizard(@) MagnePlasmid DNA Purification System，MagneGSTTM Pull-down试剂盒均购买于Promega公司;LightShift(@)Chemiluminescent EMSA Kit购自thermo公司;human fetal braincDNA library由中科院武汉病毒所肖庚富教授惠赠;Yeasttwo-hybrid systems购自Clontech公司;引物合成及测序由Invitrogen完成;常用设备包含Beckman台式低温高速离心机、Bio-rad PCR循环仪、Bio-rad电穿孔和CO2培养箱等;所用数据库和分析及应用软件包含GeneBank、primer premier5.0软件设计引物;应用DNAClub、BioEdit、DNAStar; Sequin软件序列比对与提交;TRANSFAC软件预测。
　　二、实验方法
　　（一）人巨细胞病毒UL142基因转录及转录调控的研究
　　1、Northern blot
　　人工合成UL142基因Digoxin(DIG)标记特异性RNA探针，应用Northern blot方法检测UL142基因转录本在不同感染时期的转录本的种类、长度及丰度。
　　2、5'RACE
　　通过5'RACE确定UL142转录本的5'末端。
　　3、荧光素酶报告基因检测实验
　　(1)构建pGL3 Basic-UL142基因的上游非编码区重组质粒，研究UL142基因的上游非编码区1000bp是否存在转录调控活性;
　　(2)应用5'末端系列缺失突变方法，依次递减300bp缩小调控区域范围，确定含有转录调节活性片段;
　　(3)构建pGL3 Promoter-调控元件重组质粒，进行荧光素酶检测，确定正负调控元件。
　　4、凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)
　　(1)应用TRANSFAC软件预测与HELF核蛋白相互作用的转录因子;
　　(2)合成含有标记生物素和未标记生物素的调控元件，heat shocktranscription factor1(HSF1)成品蛋白购自于Abcam公司，提取HCMV感染的HELF细胞的核蛋白;
　　(3)依据EMSA Kit说明操作，确定HSF1与正调控元件的特异性结合能力。
　　（二）人巨细胞病毒UL142编码蛋白相互作用蛋白筛选及功能研究
　　1、酵母双杂交筛选
　　(1)以pACT2(含转录激活域，activition domain，AD)为酵母表达载体的人胎脑cDNA文库增殖，提取文库质粒;
　　(2)构建转录结合域(DNA binding domain，BD)重组质粒pGBKT7-UL142;
　　(3)将pGBKT7-UL142重组质粒转化到酵母细胞AH109中，并将提取的文库质粒转化到含有UL142基因的AH109酵母细胞中，通过二缺（-Leu-Trp SD）和四缺培养基（-Ade-His-Leu-Trp SD）筛选相互作用的克隆。在二缺培养基上观察转化效率，四缺培养基进行显色反应。初步确定与UL142基因编码蛋白(pUL142)与人胎脑文库相互作用蛋白的阳性克隆;
　　(4)提取阳性克隆的酵母质粒，用电穿孔转化方法将质粒转化到大肠杆菌中，在氨苄青霉素抗性的LB固体培养基中筛选出与pUL142相互作用的文库质粒。将相互作用的文库质粒回转到含有UL142基因的AH109酵母细胞中，在四缺固体培养基中确定相互作用的文库蛋白;
　　(5) PCR鉴定后挑取阳性克隆进行测序，经Genbank生物信息学软件进行BLAST分析。最终筛选出的文库质粒为pACT2-Snapin。
　　2、GST Pull-down技术
　　(1)构建重组质粒pGEX-Snapin;
　　(2)在大肠杆菌BL21中表达GST-Snapin，并将其固相化到MagneGSTTMParticles上。利用TNT体外转录翻译系统，表达pGBKT7-UL142融合蛋白;
　　(3)将pGBKT7-UL142与所筛选出的文库蛋白GST-Snapin共同孵育，通过洗脱结合得到相互作用的蛋白复合物，并应用进行Western blot技术鉴定。
　　3、激光共聚焦技术的细胞定位分析
　　(1、构建带有荧光表达重组质粒pUL142-GFP和pDsRed-Snapin;
　　(2)通过脂质体转染法将pUL142-GFP和pDsRed-Snapin共转染入293细胞中;
　　(3)应用共聚焦显微镜技术分别在488nm和543nm波长的激发光下，观察互作蛋白在细胞内的共定位。
　　结果:
　　一、人巨细胞病毒UL142基因转录及转录调控的研究
　　1、通过Northern blot检测，在Han株的感染晚期(Late，L) RNA中共检测到三种UL142基因转录本。
　　2、5，RACE实验结果表明，UL142基因转录本具有不同的5'末端。5'末端分别位于第9425，9904和9974位核苷酸(GenBank no.GQ981646)。
　　3、通过荧光素酶报告基因表达检测实验，确定了UL142基因转录本上游一个33bp的正调控元件。应用TRANSFAC软件预测与正调控元件相互作用的转录因子HSF1。
　　4、EMSA结果表明，HELF核蛋白中含有与正调控序列的结合蛋白HSF1，此种结合可以被同源序列竞争，通过super-shift及HSF1成品蛋白对照，说明结合蛋白与调控序列的结合为特异性结合。
　　二、人巨细胞病毒UL142编码蛋白相互作用蛋白筛选及功能研究
　　1、通过酵母双杂交技术，筛选出与pUL142相互作用的人胎cDNA文库蛋白共17种，其中筛选的阳性克隆与Snapin高度同源，同源性99％。
　　2、通过GST Pull-down技术，在体外验证pUL142与Snapin直接相互作用。
　　3、利用激光共聚焦显微镜观察到pUL142-GFP与pDsRed-Snapin共定位于293细胞质中。
　　结论:
　　1、HCMV UL142基因为L期基因;共有三种转录本结构，具有不同的5'末端;HCMV UL142基因上游非编码区存在一个正调控元件，可与转录因子HSF1特异性结合;
　　2、筛选17种与HCMV UL142编码蛋白相互作用的文库蛋白，其中Snapin与HCMV UL142编码蛋白具有直接相互作用，并共同定位于293细胞质中。

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声明

摘要

英文缩略语

论文一 人巨细胞病毒UL142基因转录及转录调控的研究

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文二 人巨细胞病毒UL142基因编码蛋白相互作用蛋白的鉴定

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 人巨细胞病毒UL／b'区基因编码蛋白功能的研究

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