鹌鹑蛋鱼腥味敏感基因及其作为分子标记的应用

摘要

本发明涉及鹌鹑蛋鱼腥味敏感基因及其作为分子标记的应用。鹌鹑蛋鱼腥味敏感基因FMO3核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。其Q319X突变位点为用于检测鹌鹑蛋鱼腥味的SNP分子标记。本发明为鹌鹑蛋鱼腥味性状辅助分子标记，加快鹌鹑蛋风味改良提供了一种高效的分子遗传标记选择方法。该方法大大降低分子育种支出，并有效剔除生产中的鹌鹑蛋鱼腥味问题，扩大鹌鹑可选饲料原料范围，降低饲养成本，提高鹌鹑养殖经济效益。该方法操作简单，费用低廉，检测时间短，准确度高，可实现自动化检测，可在鹌鹑育种中发挥巨大作用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地涉及鹌鹑蛋鱼腥味敏感基因及 其作为分子标记的应用。

背景技术

改革开放三十多年来，畜牧业依赖国家的支持鼓励政策，取得 了飞速的发展，为人民群众提供了各种丰富的畜禽产品。伴随着物 质生活的逐步改善，人民群众不再只满足于吃饱，从产品品质方面 对各种畜禽产品提出了更高的要求。我国鹌鹑总饲养量为2亿只， 其中蛋用型鹌鹑占四分之三。鹌鹑蛋作为一种常见禽蛋产品已经走 上了人们的餐桌。

鹌鹑蛋营养价值高，富含各种人体必需营养元素，品质和风味优 异，各种营养成份种类比较全面。鹌鹑蛋含有较多的苯丙氨酸、亮氨 酸等人体必需氨基酸，多种矿质元素和维生素。鹌鹑蛋含有丰富的卵 磷脂，是调理和滋补理想食品。鹌鹑蛋还具有明显的药用价值，“味 甘，性温平，无毒”，一直被作为滋补食品和药膳的原料。作为禽蛋 产品的一种，鹌鹑蛋以其丰富的营养和口味深受人们喜爱。随着鹌鹑 生产产业的发展和蛋产品产量的增加，人们对鹌鹑蛋的需求不再仅仅 追求数量，而对蛋的品质风味也提出了越来越多的要求。

但是，饲料中三甲胺及三甲胺前体物的存在使部分鹌鹑个体所 产蛋中沉积大量三甲胺，诱发鱼腥味蛋的产生，导致生产和加工很 大经济损失。

传统方法是直接通过测量蛋黄三甲胺含量的高低来判断和剔除 鹌鹑的有鱼腥味，不仅耗费时间长而且效率相对低下，传统选育方 法很难剔除干净。

黄素单加氧酶3(Flavin Containing Monooxygenase3，FMO3)主要 存在于肝脏中，可以将摄入体内的三甲胺氧化成没有鱼腥味的氧化三 甲胺。当FMO3基因发生突变影响到酶的催化功能，而同时饲料中又 含有较多三甲胺的前体物如胆碱等，就会导致FMO3不能氧化机体摄 入的三甲胺，从而导致三甲胺沉积到蛋黄中，产生鱼腥味蛋。有研究 发现，褐壳蛋鸡和奶牛的FMO3基因突变均可导致鱼味综合症发生 (Honkatukia,et al.,2005;Lundén et al.,2002)。

SNP的检测方法目前已有很多成熟的技术，如单链构象多态 (PCR-SSCP)、限制性酶切片段长度多态(PCR-RFLP)、DNA测序、等 位基因特异寡聚核苷酸杂交、DNA芯片等等。近年来测序技术的发展， 使得测序的代价越来越低，并且可以高通量快速进行。相对而言，直 接测序检测鹌鹑蛋黄鱼腥味敏感基因的方法，耗时短、准确性高、花 费较低，具有很高的育种实践应用价值。

目前，对于禽蛋产品鱼腥味性状的研究中，张龙超等发明了一 种PCR-RFLP的方法，用于检测鸡蛋鱼腥味基因突变，可以准确快 捷而简便的剔除鸡群体中的鱼腥味敏感基因，大大加快了鸡蛋品质 风味的选育进展。但对于影响鹌鹑蛋三甲胺与鱼腥味性状的关键基 因研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种鹌鹑黄素单加氧酶3基因。

本发明另一目的是提供检测鹌鹑蛋鱼腥味的SNP分子标记、引物 及试剂盒。

本发明再一目的是提供一种检测鹌鹑蛋鱼腥味的方法。

本发明又一目的是提供上述基因编码的蛋白。

鹌鹑的FMO3基因，其cDNA全长1888bp，含有1596bp的开 放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，共编码532个氨基 酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。鹌鹑FMO3基因的cDNA 第992位碱基处的C/T碱基突变，导致编码第319位谷氨酰胺(Q) 的密码子CAG转变为终止子TAG，命名为Q319X无义突变。该突 变纯合子TT基因型个体FMO3蛋白翻译的提前终止，编码的蛋白 序列从532个氨基酸缩短为319个，严重影响了FMO3酶的功能， 从而使肝脏中的FMO3不能氧化从饲料中摄取得到的三甲胺，而致 使三甲胺大量沉积到蛋黄中。Q319X位点突变是导致鹌鹑蛋黄三甲 胺大量沉积的遗传决定因素。

鹌鹑FMO3基因的Q319X突变位点为T时表现出鹌鹑蛋鱼腥味性 状，以此作为分子标记用于检测鹌鹑蛋鱼腥味。

本发明提供用于检测鹌鹑FMO3基因Q319X突变位点的引物，其 核苷酸序列如Seq ID NO:2和3所示。

本发明进一步提供包含上述引物的试剂盒，所述试剂盒还包括 Taq聚合酶、dNTPs、扩增缓冲液中的一种或几种。

所述引物和试剂盒可用于鹌鹑蛋鱼腥味检测及鹌鹑分子育种。

本发明还提供一种检测鹌鹑蛋鱼腥味的方法，是检测鹌鹑FMO3 基因Q319X突变位点，确定FMO3基因为CC、CT或TT型；所述 CC型为FMO3基因Q319X突变位点为纯合C；所述CT型为FMO3 基因Q319X突变位点为杂合T/C；所述TT型为FMO3基因Q319X 突变位点为纯合T。

本发明方法包括提取鹌鹑基因组DNA，克隆FMO3基因或包含 鹌鹑FMO3基因Q319X突变位点的部分片段，然后对该基因或所述 部分片段进行测序。

上述部分片段是以鹌鹑基因组DNA为模板，以Seq ID NO:2和 3所示的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增获得。

本发明的有益效果：

（1）本发明为鹌鹑蛋鱼腥味性状分子标记，加快鹌鹑蛋风味改 良提供了一种高效的分子遗传标记选择方法。

（2）本发明方法可准确、高效地筛查出鹌鹑蛋鱼腥味突变易感 基因T，大大降低分子育种支出，并有效剔除生产中的鹌鹑蛋鱼腥味 问题，扩大鹌鹑可选饲料原料范围，降低饲养成本，提高鹌鹑养殖经 济效益。

（3）本发明方法操作简单，费用低廉，检测时间短，准确度高， 可实现自动化检测，可在鹌鹑育种中发挥巨大作用。

（4）本发明的试剂盒，用于快速检测剔除携带鹌鹑蛋鱼腥味性 状突变基因T的个体，为蛋鹌鹑的育种工作提供便利，在鹌鹑的育种 中发挥巨大作用。

附图说明

图1为测序法检测鹌鹑FMO3基因Q319X突变位点基因型结果

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1鹌鹑FMO3基因的分子克隆

1.鹌鹑肝脏组织总RNA的制备

采用Trizol一步法提取总RNA

（1）准备：准备Trizol、氯仿，异丙醇，75%乙醇和RNA溶 解液DEPC水。

将1.6ml Trizol提前加到2ml进口离心管中，4℃存放1-2小时。

（2）组织匀浆：用研钵研磨组织样至粉状，然后转移至装有 Trizol的离心管中。振荡使组织样尽可能溶于Trizol，至溶液澄清。 室温15-30℃放置10分钟以上，以提高RNA得率。

（3）分相：在装有裂解物的离心管中加入0.32ml的氯仿，用 力振荡离心管上充分振荡混匀15秒。4℃离心12000rmp，15分钟。

（4）沉淀：将上清液转移到已加入等体积的异丙醇(约0.8ml) 离心管中，轻轻颠倒离心管充分混匀，室温放置10分钟。4℃离心 12000，12分钟使得RNA沉淀在离心底。

（5）清洗：弃去上清，在含RNA沉淀的离心管中加入1毫升 75%乙醇，振荡清洗。4℃离心8000rmp，5分钟。弃上清液，用 移液枪小心吸弃残留液。沉淀，干燥5分钟。

（6）溶解：加入适量DEPC水使RNA沉淀溶解，65℃促溶 10-15min，溶解后存放于-70℃。1ml Trizol提取的RNA可溶于 50-100μl DEPC水中。

（7）总RNA质量检验：琼脂糖电泳检测RNA完整性，紫外 分光光度计测OD260、OD280含量及比值。

2.总RNA的纯化（除去RNA中的DNA）

（1）先在一个1.5ml的离心管中加入一下成分：

（2）37°C水浴1小时，每隔15分钟混匀一次。

（3）加入1/2体积的酚和1/2体积氯仿，混匀15分钟。

（4）4°C，13000rpm离心15分钟。

（5）转移水相到一新离心管中，加入等体积的氯仿，室温混匀 10分钟。

（6）4°C，13000rpm离心15分钟。

（7）转移水相到一新离心管中，加入二倍体积的乙醇和1/10体 积的3MNaAc（pH5.2）混匀，-20°C沉淀2小时以上

（8）4°C，13000rpm离心16分钟，用75％的乙醇洗涤沉淀

（9）将沉淀稍干燥后，溶于20-50μlDEPC水中，取出1μl测 定浓度和纯度，剩余RNA保存于-80°C。

3.5′RACE过程

5′RACE利用Clontech公司SMARTer RACE cDNA Amplification Kit扩增基因5′端序列。

5′RACE方法的基本原理是反转录PCR，反转录第一链用 olig(dT)引发启动反转录，反转录后的cDNA第一链产物经加尾反 应，再利用加上去的接头与基因特异性引物进行巢式一次和二次扩 增。具体步骤如下：

（1）cDNA第一链的合成先在一0.2ml灭菌的DEPC处理离 心管中加入以下组分：

olig(dT)(0.5μg/μl)    1μl

总RNA(1μg/μl)         2.0μl

灭菌ddH₂O               10.0μl

将以上组分混匀，70℃水浴5分钟变性RNA，冰浴速冷5分 钟，离心将溶液收集至管底。

按顺序加入一下组分：

将以上20μl混合物42°C反应60分钟，95°C反应5分钟以灭 活反转录酶。

（2）cDNA第一链TdT加尾反应：

取一0.2ml灭菌的DEPC处理离心管中加入以下组分：

37℃反应30分钟

（3）巢式PCR反应第一轮PCR扩增

用表中的基因特异性正向引物FMO5r1 （5-GAAGCGGGTGATGAGCAGCATGTC-3）与通用引物5RACEP1 （5-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGGGGG-3）扩增加 尾产物，0.2ml灭菌的DEPC处理的进口PCR管中依次加入以下组 分：

将以上混合物放入已提前预热的PCR仪中，按照以下程序进行 扩增：95°C变性5分钟；95°C变性40秒，60℃30秒，72°C复性 1分钟，35个循环；72°C延伸10分钟，4°C保存。

（4）巢式PCR反应第二轮PCR扩增

0.2ml灭菌的DEPC处理的进口PCR管中依次加入以下组分：

FMO5r2正向引物为（5-GGCCACGCGTCGACTAGT-3）， 5RACEP2反向引物为（5-CCACCAGCACCTTCTTCCCTCTG-3）， 将以上混合物放入已提前预热的PCR仪中，按照以下程序进行扩 增：95°C变性5分钟；95°C变性40秒，60℃30秒，72°C复性1 分钟，20个循环；72°C延伸10分钟，4°C保存。

4.3′RACE过程

采用利用Clontech公司SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 进行基因3’端序列扩增。其主要原理是：先用试剂盒提供的含Poly （T）18的接头引物进行反转录，利用基因特异性正向引物与接头 通用引物组合进行PCR扩增。具体操作如下：

（1）cDNA第一链的合成先在一0.2ml灭菌的DEPC处理进 口离心管中加入一下组分：

将以上组分混合，70°C水浴10分钟变性RNA，冰浴冷却5 分钟，瞬间离心将溶液收集至管底。按顺序加入以下组分：

将以上20μl混合物42°C反应60分钟，95°C反应5分钟以灭 活反转录酶。

（2）巢式PCR反应第一轮PCR扩增

用表2-1中的基因特异性正向引物FMO3r1 （5-CCCTCTACAAATGCATTGTTCCTCCT-3）与通用引物 3RACEP2（5-GCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3）扩增3RACEP1 引物反转录的cDNA模板

0.2ml灭菌的DEPC处理的进口PCR管中依次加入以下组分：

将以上混合物放入已提前预热的PCR仪中，按照以下程序进行 扩增：95°C变性5分钟；

95°C变性40秒，60℃30秒，72°C复性1分钟，35个循环； 72°C延伸10分钟，4°C保存。

（3）巢式PCR反应第二轮PCR扩增

0.2ml灭菌的DEPC处理的进口PCR管中依次加入以下组分：

FMO3r2正向引物为 （5-CCGCTGGGCAGTCAAGGTGTTTC-3），3RACEP2反向引物为 （5-GCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3），将以上混合物放入已 提前预热的PCR仪中，按照以下程序进行扩增：95°C变性5分钟； 95°C变性40秒，60°C 30秒，72°C复性1分钟，20个循环；72°C 延伸10分钟，4°C保存。

2.1.3.5克隆鹌鹑FMO3cDNA全长序列

根据RACE得到的5′序列区和3′序列区，从序列两端设计引物 按如下PCR反应体系PCR扩增。

FMO3F为（5-CCCACTCTAAGCTCTGAAGCAAC-3），FMO3R 为（5-GTACACAGAAGCTACTCGGTACG-3）将以上混合物放入已 提前预热的PCR仪中，按照以下程序进行扩增：95°C变性5分钟； 95°C变性40秒，57℃30秒，72°C复性2分钟，35个循环；72°C 延伸10分钟，4°C保存。

5.PCR产物的切胶纯化

（1）待回收的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需 的片段，放于1.5ml离心管中；

（2）加入三倍体积的溶胶液，室温下放置5分钟或50℃保温3 分钟，其间轻摇离心管数次使胶完全熔化；

（3）加入10μl玻璃奶，颠倒混匀，冰浴10分钟，其间每2-3 分钟混匀一次，12000rpm离心30秒，吸弃上清；

（4）加250μl漂洗液，用加样器吹打漂洗液，轻柔地将玻璃奶 悬浮混匀，12000rpm离心30秒，吸弃上清；

（5）重复步骤4，吸取完漂洗液后再离心10分钟，用Tip头将 最后一点漂洗液吸干净，然后放置于37℃烘箱中干燥，直至沉淀呈 白色；

（6）加20μl洗脱缓冲液，混匀，60℃水浴5分钟，12000rpm 离心1分钟，回收上清备用。

6.连接反应

（1）连接反应体系：混匀下列组分，构成总体积为10μl的 连接反应体系。一般应使外源片段与载体的摩尔比为2～10∶1。 pGEM-T Easy载体购自Promega。

（2）移液器吹打连接反应使之混匀后，14~16℃连接过夜。

（3）取5μl连接液转化，其余于置-20℃冻存。

7.转化

（1）取出冻存于-70℃的感受态细胞，冰上解冻。

（2）200μl感受态细胞DH5α中加入5μl连接产物，冰浴30 min。

（3）42℃水浴热激90s，立即冰浴2min。

（4）加500~800μl液体LB，37℃复活30~50min。

（5）铺100μl于含X-gal（60μl/平板）的Amp LB平板。

（6）37℃恒温培养箱中培养9~16h。

8.菌体PCR鉴定

（1）挑取白色单菌落（一般2~10个），在另一块含Amp的 LB板划线培养12~16h，同时挑一蓝斑作对照。

（2）菌体PCR反应：混匀下列组分，构成总体积为10μl的 反应体系。用与第一次PCR扩增相同的引物组合和PCR反应条 件进行扩增。

（3）结果鉴定：菌体PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳后， 即可在凝胶成像系统中，依据扩增片段的有无和大致长度，检测外 源DNA片段是否插入质粒中。

9.PCR及克隆产物序列测定

PCR产物或克隆菌液采用双脱氧测序法，ABI3730测序仪测 序。

10.测序结果分析

测序结果用Chromas2.23、DNAMAN5.2.2进行分析。根据测序 结果，进行序列拼接。 实施例2DNA测序检测方法的建立及多态位点确定

1、PCR扩增

选择神丹自别雌雄蛋用鹌鹑配套系父系和母系两个纯系鹌鹑为 实验材料，取20μL鹌鹑抗凝全血，采用传统酚仿抽提法提取血液总 DNA，并用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

根据鹌鹑FMO3基因的cDNA序列设计引物，序列如下：

F primer（上游引物）：5’-GTGAAGGAATTCAGAGAAACA-3’

R primer（下游引物）：5’-CTGAAACACCTTGACTGCC-3’

以鹌鹑基因组DNA为模板，使用引物F primer和R primer进行 PCR扩增，使用15μL反应体系：

基因组DNA（50ng）        1μL；

10×PCR扩增缓冲液        1.5μL；

dNTPs(4mmol/L)混合液     0.8μL；

上游引物(10pmol/L)       0.3μL；

下游引物(10pmol/L)       0.3μL；

Taq DNA聚合酶            0.3μL；

用ddH₂O补充反应体系至    15μL。

PCR反应条件为：95℃变性5min；循环程序为95℃变性1s， 62℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

2、DNA测序及序列分析

将步骤1中的PCR产物经切胶回收后，送DNA测序公司双向测序， 得到279bp的DNA序列信息，测序结果为Seq ID No:5和6所示。Seq ID No:5为CC基因型，Seq ID No:6为TT基因型。经序列比对，在Q319X 的C/T突变位点，正常型个体为CC基因型，易感型个体为TT基因型， 杂合携带个体为CT基因型。

实施例3检测Q319X位点C/T突变在父系和母系群体的分布

根据实施例1的方法，对神丹自别雌雄蛋用鹌鹑配套系的父系 和母系两个纯系群体检测FMO3基因Q319X位点C/T突变的分布情 况，检测结果如表1所示。

表1 FMO3基因Q319X位点C/T突变在父系和母系群体的分布

根据表1的结果可知，神丹自别雌雄蛋用鹌鹑配套系父系和母 系群体中均检测到了鱼腥味敏感基因T及敏感基因型TT型个体， 说明两个群体鹌鹑饲喂添加4000mg/Kg的试验组饲料会都会有少数 敏感基因型个体会产下高三甲胺含量的鱼腥味蛋，需要利用分子育 种手段剔除突变等位基因T。

综上所述，在Q319X无义突变位点，C为正常基因，其纯合体 基因型为CC；T为鱼腥味敏感基因，则其纯合体基因型为TT；杂 合体基因型为CT。其中CC基因型和CT基因型鹌鹑在饲喂含有大 量含量胆碱的饲料（4000mg/Kg）时，所产蛋黄三甲胺仍会维持在 较低水平，但CT基因型仍携带有T易感基因；而TT基因型个体在 饲喂含有大量胆碱的饲料（4000mg/Kg），所产鹌鹑蛋都含有大量三 甲胺的沉积，具有明显鱼腥味。通过本发明的检测方法可发现携带 有T隐性易感基因CT和TT型个体，并从群体中直接淘汰，将T 易感基因从群体中剔除，使蛋的鱼腥味性状在群体中不再发生。 实施例4鹌鹑蛋鱼腥味敏感基因检测试剂盒的制备

本发明的试剂盒包括以下试剂：

（1）2U/μl Taq DNA聚合酶；

（2）10×PCR扩增缓冲液；

（3）4mmol/L dNTPs；

（4）实施例1所用的引物对；

（5）ddH₂O

试剂盒的规格为25次/盒，每盒中各组分的量为：2U/μl Taq DNA聚合酶1瓶（50μl/瓶），10×PCR扩增缓冲液1瓶（200μl/ 瓶），4mmol/L dNTPs 1瓶（200μl/瓶），上下游引物各1瓶（50μl/ 瓶）和ddH₂O 1瓶（1000μl/瓶）。按上述剂量对试剂盒中的各组分 进行分装，包装后得到用于鸡蛋溯源的试剂盒。