磷硫酰化DNA的酶促合成方法

摘要

本发明涉及一种生物医药技术领域的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，该方法包括以下步骤：以DNA和L-半胱氨酸为底物，加入DNA磷硫酰化修饰酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的全细胞裂解液，在合适条件下发生磷硫酰化修饰酶促反应，获得磷硫酰化修饰的DNA。本发明提供的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，能够实现对不同长度和不同来源的DNA进行可控的修饰，并且具有序列特异性和空间构象特异性，可用于分子生物学研究、基因治疗、基因疫苗等诸多领域。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA分子的磷硫酰化修饰，具体涉及一种用于DNA分子磷硫酰化修饰的 酶促合成方法。

背景技术

磷硫酰化修饰的DNA可以抵抗多种DNA水解酶的作用，因此在基因治疗和分子生物学 研究，如基因阻断、定点突变等方面具有广泛的应用。目前对DNA进行磷硫酰化修饰需 要化学合成的方法实现，但是化学法具有多种局限性，如催化效率不高，只能合成短链 并且磷硫酰化DNA是两种旋光异构体的混合物，纯化分离步骤复杂等。而利用酶学方法 进行DNA磷硫酰化修饰除了可以解决化学合成中遇到的问题，还具有多方面的优势，如 可以对不同长度和不同来源的DNA进行可控的修饰，并且具有序列特异性和空间构象特 异性。

目前，发现在诸多微生物中存在能够对DNA进行磷硫酰化修饰的基因簇。利用基因 克隆、异源表达和蛋白质纯化等技术，完成了利用沙门氏菌(Salmonella enterica) serovar Cerro 87中的磷硫酰化修饰系统进行体外催化合成磷硫酰化的DNA。该催化体 系包括两种方式进行：分别利用全细胞裂解液和纯化的负责修饰的蛋白作为催化剂，进 行了30bp和4Mb不同长度的DNA的磷硫酰化修饰。利用LC-MS技术检测发现，两种长度 的DNA都成功的被磷硫酰化修饰，并且该修饰具有序列特异性和单一的R构型。

因此，对不同生物来源的DNA磷硫酰化催化体系的开发，可以合成不同序列特异性 和任意长度的磷硫酰化DNA。在此基础上通过微生物发酵或者酶工程的方法进行工业化 生产磷硫酰化修饰的DNA分子，用于基因治疗药物、基因疫苗、或者分子生物学研究等 领域。现有技术未发现利用酶学方法对DNA进行磷硫酰化修饰的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种利用生物催化方法对DNA进 行磷硫酰化修饰。本发明提供的磷硫酰化DNA的酶促合成方法，能够实现对不同长度和 不同来源的DNA进行可控的修饰，并且具有序列特异性和空间构象特异性，可用于分子 生物学研究、基因治疗、基因疫苗等诸多领域。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，本发明涉及一种磷硫酰化DNA的酶促合 成方法，该方法包括以下步骤：

以DNA和L-半胱氨酸为底物，加入DNA磷硫酰化修饰酶蛋白或者含有DNA磷硫酰化 修饰酶蛋白的全细胞裂解液，在合适条件下发生磷硫酰化修饰酶促反应，获得磷硫酰化 修饰的DNA。

优选地，所述全细胞裂解液的制备包括如下步骤：接种沙门氏菌(Salmonella  enterica)serovar Cerro 87至LB培养基中，培养，收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤所述 菌体，用反应缓冲液重悬，冻融，超声破碎所述菌体，离心，取上清液，即获所述全细 胞裂解液。

优选地，所述反应缓冲液包括20mM Tris-HCl、60mM KCl、10mM MgCl₂、1mM EDTA、 2mM DTT、1mM PMSF和体积比为25％的甘油，所述反应缓冲液的pH为8.0。

优选地，所述酶促反应包括如下步骤：制备短链DNA-链霉亲和素复合体，向所述 DNA-链霉亲和素复合体中加入所述全细胞裂解液，再加入终浓度为1mM的ATP、0.1mM 的PLP和0.1mM的Cys，常规条件下反应，离心终止反应，用磷酸缓冲液洗涤反应物。

优选地，所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的制备包括如下步骤：从沙门氏菌克隆DNA 磷硫酰化修饰的酶蛋白基因，构建质粒表达载体，转化宿主细胞，诱导表达，裂解，镍 柱亲和纯化，FPLC纯化，蛋白浓缩，即得所述DNA磷硫酰化修饰酶蛋白。

进一步优选地，所述沙门氏菌为沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro 87。

优选地，所述酶促反应包括如下步骤：取基因组DNA和所述DNA磷硫酰化修饰酶 蛋白置于反应缓冲液，并加入终浓度为1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys， 30℃下进行反应，加入苯酚氯仿抽提，抽提后的上清加入异丙醇沉淀，洗涤，干燥，即 获磷硫酰化修饰的DNA。

优选地，所述反应缓冲液包括20mM的Tris-HCl和10mM的MgCl₂，所述反应缓 冲液的pH为8.0。

优选地，所述各酶蛋白的重量份相同。

优选地，所述DNA的链长为30bp或4Mbp。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供的用于DNA磷硫酰化修 饰的酶促合成方法，能够实现对不同长度和不同来源的DNA进行可控的修饰，并且能够 序列特异性和空间构象特异性地生物催化合成磷硫酰化修饰的DNA，可用于分子生物学 研究、基因治疗、基因疫苗等诸多领域。

本发明所提供的酶催化体系，可利用生物信息学方法或者分子生物学方法，从其他 微生物中得到同源的DNA磷硫酰化修饰系统。

本发明所提供的酶催化体系可以通过改变一个或几个蛋白步骤或者引入其他同源 蛋白而得到新的序列特异性的磷硫酰化修饰的DNA。

本发明所提供的酶催化体系可以用来提高磷硫酰化修饰的DNA的产量，例如，利用 基因工程等方法提高其中一种或几种酶的活性。

本发明所提供的酶催化体系可以通过改变4种DNA磷硫酰化修饰酶蛋白的比例来降 低或提高磷硫酰化修饰的DNA的修饰频率。

本发明所提供的酶催化体系可以通过改变体外催化条件来改变磷硫酰化修饰的DNA 的产量、序列特异性或者修饰频率。这些体外催化条件包括pH，缓冲液成分，金属离子 等。

本发明所提供的DNA磷硫酰化修饰的方法可以用于各种其他同源的酶催化体系中， 从而产生不同类型的磷硫酰化修饰DNA。

附图说明

图1是体外酶催化合成DNA磷硫酰化修饰反应的示意图；

图2是全细胞裂解液催化30bp DM磷硫酰化的LC-MS检测结果图；

图3是纯化的DNA磷硫酰化修饰酶蛋白催化基因组DNA磷硫酰化时，磷硫酰化DNA作为 正对照的LC-MS检测结果图；

图4是纯化的DNA磷硫酰化修饰酶蛋白催化基因组DNA磷硫酰化时，酶催化不含磷硫 酰化修饰的DNA的LC-MS检测结果图；

图5是纯化的DNA磷硫酰化修饰酶蛋白催化基因组DNA磷硫酰化时，酶催化体系中灭 活DptC作为负对照的LC-MS检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前 提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中所涉及的菌种来源信息如下：

沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro 87来自于文献《TiegangXU et  al.A novel host-specific restriction system associated with DNA backbone S-modification in Salmonella.Nucleic Acid Research，2010，38(20)：7133-7141》；

大肠杆菌BL21(DE3)plusS：购买自美国马里兰州盖色斯堡生物制剂公司 Gibco-BRL。

实施例1、全细胞裂解液法合成磷硫酰化DNA

(1)、全细胞裂解液的制备

接种沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro 87至200mL LB培养基 (Luria-Bertani培养基)中，37℃培养至A₆₀₀为1.5；

4℃，5000g离心10分钟收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤3次后，用20mL反应缓冲 液(20mM Tris-HCl，pH8.0，60mM KCl，10mM MgCl2，1mM EDTA，2mM DTT，1mM PMSF 和25％(V/V)甘油重悬备用；

将细胞重悬液反复冻融3次后超声破胞后，4℃，15000g离心20分钟，取上清液。 该上清液即用于催化DNA磷硫酰化修饰的全细胞裂解液。

(2)、短链DNA底物的制备

利用化学方法合成的短链DNA作为底物，其序列如表1所示；

取100pmol/μL的5′端生物素化的Dpt 103和Dpt 104各100μL于1.5mL的离心管中， 95℃加热5分钟后，室温下冷却，以使两种单链DNA充分退火形成双链DNA；

取100μL链霉亲和素琼脂糖颗粒(sigma)，800g离心1min，并用1mL磷酸缓冲液 洗涤3次；

向洗涤后的链霉亲和素琼脂糖颗粒中加入10μL退火的10pmol/μL的Dpt103和 Dpt104，25℃作用2h，使短链DNA充分结合在链霉亲和素上；

另外，取100pmol/μL的5′端生物素化的Dpt 101和Dpt 102各100μL于1.5mL的离 心管中，95℃加热5分钟后，室温下冷却，以使两种单链DNA充分退火形成双链DNA，用 于阳性对照。

表1

 名称   序列  Dpt 101   5′-/5Biosg/tcgtggttggcgacg_psaacaccagaccgtta-3′  Dpt 102   5′-taacggtctggtg_psttcgtcgccaaccacga-3′  Dpt 103   5′-/5Biosg/tcgtggttggcgacgaacaccagaccgtta-3′  Dpt 104   5′-taacggtctggtgttcgtcgccaaccacga-3′

(3)体外催化短链DNA磷硫酰化修饰

向上述制备的短链DNA-链霉亲和素复合体中加入1mL上述全细胞裂解液，再加入 终浓度为1mM的ATP、0.1mM的PLP(磷酸吡哆醛)和0.1mM的Cys(半胱氨酸)；

该催化反应在25℃条件下进行2-3小时后，800g离心1分钟以终止反应；

用磷酸缓冲液洗涤反应物3次，以除去未结合在链霉亲和素琼脂糖颗粒上的DNA， 链霉亲和素上的DNA即反应产物用于LC-MS检测。体外催化合成DM磷硫酰化修饰的反 应如图1所示。

(4)磷硫酰化DNA的LC-MS检测

用核酸酶P1消化步骤(3)中的反应产物，体系如下：200μL反应体积中含30mM 醋酸钠(pH 5.2)，0.5mM ZnCl₂，1U的核酸酶P1，50℃作用2小时，之后加入10U 的碱性去磷酸化酶，37℃作用2小时后用超滤管(YM-10柱，Microcon)超滤除去蛋白成 分，过滤液用于LC-MS检测；

LC-MS检测条件如下：HPLC层析柱采用Thermo Hypersil GOLD Q柱(150×2.1mm， 3μm)，流速为0.3mL/min，洗脱采用97％buffer A(0.1％乙酸水)，3％buffer B(0.1％ 乙酸乙腈)5分钟，3％到15％buffer B梯度洗脱20分钟，15％到100％buffer B洗脱 1分钟；

质谱部分采用Agilent 6410Triple Quad LC/MS在正离子模式下进行，离子源为 电喷雾(Electrospray Ionization)；

所用一系列参数为：干燥气流(drying gas flow)：13L/min；雾化器压力 (nebulizer pressure)：30psi；干燥气温(drying gas temperature)：325℃；毛细 管电压(capillary voltage)：3100V。采用MRM模式用于检测修饰碱基中的dGpsA和 dGpsT，优化后的参数(保留时间，一级质谱m/z，二级质谱，电压，碰撞能量)分别如下： d(G_PSA)，20.5，597，136，120V，40V；d(G_PST)，26.5，588，152，110V，17V。

LC-MS检测结果如图2所示，A：化学合成的磷硫酰化的Dpt 101和Dpt 102的阳 性对照；B：酶促合成磷硫酰化的Dpt 103和Dpt 104产物；C：反应体系不加短链DNA Dpt 103和Dpt 104的阴性对照；D：反应体系不加全细胞裂解液的阴性对照。含有DNA 磷硫酰化修饰酶蛋白的沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro 87全细胞裂 解液催化的磷硫酰化修饰反应，具有GA或GT序列特异性和R-旋光异构体的空间构象 特异性。

实施例2、异源表达纯化蛋白体系催化合成磷硫酰化修饰的DNA

(1)蛋白体系的异源表达及纯化

从沙门氏菌(Salmonella enterica)serovar Cerro 87中扩增负责DNA磷硫酰化 修饰的4种基因，即iscS、dptC、dptD、dptE。克隆引物中使用的均为NdeI/EcoRI两 个酶切位点，引物如表2所示；

利用PCR技术克隆得到4种酶蛋白的基因之后利用NdeI/EcoRI酶切，连接到同样 酶切位点的pET28-a(NOVAGEN)表达载体上，之后用氯化钙转化方法将连接有目的基因的 表达载体转化进入表达宿主E.coli BL21(DE3)plusS中；

诱导：挑取转化子单菌落接种到5mL LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。第二天， 按照1∶100的比例转接到500mL LB培养基中进行扩大培养至A₆₀₀到0.8～1.0；随后加 入0.5mM IPTG，并在18℃下诱导24小时。

裂解：4℃，8000g离心10min收集大肠杆菌菌体，并把细胞打散并悬浮在15mL buffer C(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl)中，-80℃保存。经过-80℃冰冻，0℃解冻 这样的3个循环使细胞裂解；随之，用超声对细胞进行进一步破碎并打断粘滞的DNA。 最后，在4℃条件下，15000g离心30min收集蛋白上清液，备用。

镍柱亲和：用注射器吸取上述蛋白上清液，并用0.45μm滤膜除去上清液中不溶杂 质，以免堵塞镍柱。随后把滤液注入填充了镍离子的HiTrap亲和柱中，使具有His-Tag 的蛋白与镍离子结合，而杂蛋白则会随平衡液buffer C过滤掉。

FPLC纯化：先用一个柱体积的细胞裂解液平衡HiTrap亲和柱并洗去未挂柱的杂蛋 白，然后在20min内蛋白洗脱液buffer D(20mM Tris-HCl，pH8.0，500mM NaCl，1M咪 唑)的比例从0上升到60％对目的蛋白进行梯度洗脱。

蛋白浓缩：FPLC纯化分步收集得到的目的蛋白用超滤管Centricon Plus-20(PL-10) Centrifugal Filter Devices进行离心浓缩至小体积0.5mL，浓缩过程中用buffer C不 断的置换蛋白洗脱液中的高浓度咪唑，起到部分脱盐的目的。纯化得到的蛋白通过 SDS-PAGE检测纯度，用紫外波长280nm定量。

表2

  引物名称   引物序列   iscS-S   5’CCACCATATGAAATTACCGATTTATCTCG 3’   iscS-R   5’CCCGGATCCTTAATGATGAGCCCATTCGAT 3’   dptC-S   5’TTCCATATGGCTAGTGTTGATGCAGA 3’   dptC-R   5’TACCGGATCCTTAATGAGCACGTTCAT 3’

  dptD-S   5’TTACATATGAGGAAAATGAACGTGC 3’   dptD-R   5’CTAGGATCCATTCGATTCGGGAGCA 3’   dptE-S   5’ATTCCATATGCTCCCGAATCGAATGGT 3’   dptE-R   5’CGCGGATCCTATGGCACCGTTCATGGTGC 3’

(2)沙门氏菌基因组DNA的提取

本实施例所用的基因组DNA都是用QIAGEN Genomic-tip 500/G试剂盒进行分离 的。首先，经过离心并用PBS缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄) 洗涤过的菌体重新用溶液B1(50mM Tris-HCl，pH8.0，含5mM Na2EDTA，0.5％(V/V) Tween-20，0.5％(V/V)Triton X-100)彻底打散，随后加入50μL 50mg/mL的RNase A 溶液、350μL 100mg/mL的溶菌酶、20μL 25mg/mL的蛋白酶K溶液和200μL 50mM的甲磺 酸去铁胺，37℃温育1小时后对细胞壁进行破坏；然后，加入4.5mL的溶液B2(3M盐酸 胍，20％(V/V)Tween-20)。混匀后50℃温育1小时，对细胞进行破碎；把破碎的细胞倒 入已用10mL溶液QBT(0.7mM NaCl，0.5mM MOPS，15％(V/V)异丙醇，1.5％(V/V)Triton X-100，pH7.0)平衡过的QIAGEN Genmic-tip 500/G柱，并依靠重力作用使溶液慢慢 通过柱子。随后用15mL溶液QC(1M NaCl，0.5mM MOPS，15％(V/V)异丙醇，pH7.0) 对柱子进行洗涤2次，最后用15mL溶液QF(1.5M NaCl，0.5mM MOPS，15％(V/V)异丙 醇，pH8.5)对基因组DNA进行洗脱并用15mL异丙醇沉淀出DNA。沉淀用70％乙醇洗涤两 次后，用真空蒸发仪除去残余的乙醇，最后将基因组DNA溶于1mL去离子水中，并通过检 测260nm波长下的吸光度进行DNA的浓度测定。

(3)体外催化基因组DNA磷硫酰化修饰

取步骤(1)中纯化得到的4种酶蛋白各1μg，步骤(2)中得到的基因组DNA 20μg， 置于以下反应体系中：200μL反应缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，10mM MgCl₂) 含1mM的ATP、0.1mM的PLP和0.1mM的Cys。30℃作用2小时后，加入200μL苯酚氯 仿抽提反应体系以除去体系中的蛋白，抽提后的上清液加入等体积的异丙醇沉淀出DNA， 该沉淀用70％乙醇洗涤两次后，用真空蒸发仪除去残余的乙醇，最后将干燥的DNA溶于 100μL去离子水中。

(4)磷硫酰化修饰基因组DNA的LC-MS检测

本实施例得到的磷硫酰化修饰基因组DNA产物的分析和检测方法，同实施例1。结 果显示，纯化的IscS、DptC、D、E四种蛋白可以成功催化DNA磷硫酰化修饰(如图4 所示)，而灭活DptC蛋白时则失去催化活性(如图5所示)，并且催化的磷硫酰化修饰 反应，同样具有GA或GT序列特异性和R-旋光异构体的空间构象特异性。