检测Y染色体微缺失的实时荧光定量PCR试剂盒及方法

摘要

本发明公开了一种检测Y染色体微缺失的实时荧光定量PCR试剂盒及方法，其包括盒体、PCR反应液及至少一个引物探针组合，所述引物探针组合选自用于检测SY84位点的SY84引物探针组合、用于检测SY86位点的SY86引物探针组合、用于检测SY127位点的SY127引物探针组合、用于检测SY134位点的SY134引物探针组合、用于检测SY254位点的SY254引物探针组合及用于检测SY255位点的SY255引物探针组合。该试剂盒和方法利用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色体微缺失位点进行检测，实时荧光定量PCR通过PCR扩增对每一个循环产物荧光信号进行实时收集，从而实现对起始模板定量及定性的分析，该方法操作简单、快速、检测通量高且敏感性特异性高，能够有效减少时间和成本。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测Y染色体微缺失的试剂盒及方法。

背景技术

据统计，全世界有15％的夫妇患有不育（孕）症，其中50％以上由男方所 致。近年来研究表明30％以上的男性不育是由于遗传因素引起的生精障碍，通 常表现为男性Y染色体长臂（q臂）11区上无精因子基因家族（Azoospermia  factor，AZF）多个位点的缺失突变，其中任何一个座位的微缺失都可导致生精 障碍，而对于因Y染色体微缺失引起的男性不育是无法治疗的。在胞质内单精 子注射（ICSI）技术辅助生育治疗前检测Y染色体微缺失可以为临床治疗提供 指导，减少不必要的经济浪费。目前欧洲、美国及我国相关学会已经建议将检 测Y染色体微缺失列为男性不育的筛查项目。

目前检测基因微缺失的方法很多，最常用的PCR-RFLP法，另外还有反向 点杂交法、等位基因特异性聚合酶链反应、直接测序法等。后者是所有方法的 金标准，但由于其费用昂贵，未广泛使用。而PCR-RFLP法虽然费用较低，操 作简单，但特异性和敏感性都不太理想，其检测通量小，对于样本量较大的临 床检测不适用。

发明内容

本发明提供一种能够有效减少时间和成本的用于检测Y染色体微缺失的试 剂盒及方法。

本发明提供一种用于检测Y染色体微缺失的实时荧光PCR试剂盒，包括盒 体、PCR反应液及至少一个引物探针组合，所述引物探针组合选自用于检测 SY84位点的SY84引物探针组合、用于检测SY86位点的SY86引物探针组合、 用于检测SY127位点的SY127引物探针组合、用于检测SY134位点的SY134 引物探针组合、用于检测SY254位点的SY254引物探针组合及用于检测SY255 位点的SY255引物探针组合，其中，

SY84引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:8中之一所示， 其下游引物如SEQ ID NO:9~SEQ ID NO:14中之一所示，其荧光探针如SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:22中之一所示；

SY86引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO:23~SEQ ID NO:28中之一所 示，其下游引物如SEQ ID NO:29~SEQ ID NO:30中之一所示，其荧光探针如 SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:39中之一所示；

SY127引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO:40~SEQ ID NO:51中之一所 示，其下游引物如SEQ ID NO:52~SEQ ID NO:54中之一所示，其荧光探针如 SEQ ID NO:55~SEQ ID NO:58中之一所示；

SY134引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO:59~SEQ ID NO:61中之一所 示，其下游引物如SEQ ID NO:62~SEQ ID NO:69中之一所示，其荧光探针如 SEQ ID NO:70~SEQ ID NO:74中之一所示；

SY254引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO:75~SEQ ID NO:76中之一所 示，其下游引物如SEQ ID NO:77~SEQ ID NO:85中之一所示，其荧光探针如 SEQ ID NO:86~SEQ ID NO:87中之一所示；

SY255引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO:88~SEQ ID NO:90中之一所 示，其下游引物如SEQ ID NO:91~SEQ ID NO:94中之一所示，其荧光探针如 SEQ ID NO:95~SEQ ID NO:101中之一所示。

不同的引物探针组合用于检测Y染色体AZF区域的不同位点，可以根据需 要选择检测其中的一个或多个位点，对应的，选择与该位点对应的引物探针组 合。

Y染色体的AZF区域由AZFa区域、AZFb区域和AZFc区域组成。

所述试剂盒还包括用于检测男性性别决定基因SRY的SRY引物探针组合， 所述SRY引物探针组合的上游引物如SEQ ID NO:102~SEQ ID NO:107中之一 所示，其下游引物如SEQ ID NO:108~SEQ ID NO:109中之一所示，其荧光探针 如SEQ ID NO:110~SEQ ID NO:112中之一所示。

SRY引物探针组合用于质控，其可以根据检测要求选择采用或不采用。

所述引物探针组合由SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、和SY255引 物探针组合组成，所述引物之间Tm值相差波动于2-4℃，所述探针之间Tm值 相差波动于2-4℃，引物探针之间Tm值相差为10℃左右。

引物包括针对各位点的引物和针对基因SRY的引物。探针包括针对各位点 的探针和针对基因SRY的探针。

所述PCR反应液还包括含MgCl、KCl、Tris的10倍缓冲液(10*Buffer)、含 dATP、dCTP、dGTP、dUTP的dNTP及rTaq酶。

其中，MgCl浓度为1.5mM，KCl浓度为60mM、Tris浓度为12mM。

其中，dNTP浓度为0.2mM。

其中，合成引物浓度为300uM、探针浓度为100uM。

一种用于检测Y染色体微缺失的方法，包括如下步骤：

a)从人抗凝血中提取基因组DNA；

b)以所述基因组DNA试样为模板，利用权利要求7所述的SY84、SY86、 SY127、SY134、SY254和SY255引物探针组合进行PCR扩增及检测；

c)根据探针荧光标记选择对应探针检测通道的颜色；

d)根据扩增曲线颜色及曲线有无判断对应Y染色体的AZF区域是否存在缺 失。

其中，该方法采用四重荧光定量PCR分两管对Y染色体3个区域6个位点 进行检测。

本发明的有益效果是：该试剂盒和方法利用实时荧光定量PCR结合Taqman 探针对Y染色体微缺失位点进行检测，实时荧光定量PCR通过PCR扩增对每 一个循环产物荧光信号进行实时收集，从而实现对起始模板定量及定性的分析， 该方法操作简单、快速、检测通量高且敏感性特异性高，能够有效减少时间和 成本。

附图说明

图1-10是表明本实施方式检测结果的荧光扩增曲线图，其中，

图1的4条曲线分别表示SRY、SY84、SY127和SY254位点的扩增曲线；

图2的4条曲线分别表示SRY、SY134、SY255和SY86位点的扩增曲线；

图3的3条曲线分别表示SRY、SY127和SY254位点的扩增曲线；

图4的3条曲线分别表示SRY、SY134和SY255位点的扩增曲线；

图5的3条曲线分别表示SRY、SY84和SY254位点的扩增曲线；

图6的4条曲线分别表示SRY、SY86、SY134和SY255位点的扩增曲线；

图7的3条曲线分别表示SRY、SY86和SY255位点的扩增曲线；

图8的4条曲线分别表示SRY、SY84、SY127和SY254位点的扩增曲线；

图9的3条曲线分别表示SRY、SY84和SY127位点的扩增曲线；

图10的3条曲线分别表示SRY、SY86和SY134位点的扩增曲线。

具体实施方式

本发明运用四重荧光定量PCR分两管对Y染色体AZFa区域的SY84位点 和SY86位点、对AZFb区域的SY127位点和SY134位点、对AZFc区域SY254 位点和SY255位点进行检测，同时检测男性性别决定基因SRY作为质控，以正 常已育男性DNA样本作为阳性对照，女性DNA样本作为阴性对照，灭菌水作 为空白对照防止检验体系被污染。

用于检测Y染色体AZFa区域SY84位点的引物探针组合定义为SY84引物 探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，其上游引物如SEQ  ID NO:1~SEQ ID NO:8中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:9~SEQ ID NO:14 中之一所示，其荧光探针如SEQ ID NO:15~SEQ ID NO:22中之一所示，荧光探 针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY86位点相同， 但与AZFb、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY84位点的探针、 上、下游引物可随机组合。

用于检测Y染色体AZFa区域SY86位点的引物探针组合定义为SY86引物 探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，其上游引物如SEQ  ID NO:23~SEQ ID NO:28中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:29~SEQ ID NO:30中之一所示，其荧光探针如SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:39中之一所示， 荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY84位点 相同，但与AZFb、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY86位点 的探针、上、下游引物可随机组合。

用于检测Y染色体AZFb区域SY127位点的引物探针组合定义为SY127引 物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，其上游引物如 SEQ ID NO:40~SEQ ID NO:51中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:52~SEQ  ID NO:54中之一所示，其荧光探针如SEQ ID NO:55~SEQ ID NO:58中之一所 示，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY134 位点相同，但与AZFa、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY127 位点的探针、上、下游引物可随机组合。

用于检测Y染色体AZFb区域SY134位点的引物探针组合定义为SY134引 物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman探针，其上游引物如SEQ ID  NO:59~SEQ ID NO:61中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:62~SEQ ID  NO:69中之一所示，其荧光荧光探针如SEQ ID NO:70~SEQ ID NO:74中之一所 示，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY127 位点相同，但与AZFa、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY134 位点的探针、上、下游引物可随机组合。

用于检测Y染色体AZFc区域SY254位点的引物探针组合定义为SY254引 物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，其上游引物如 SEQ ID NO:75~SEQ ID NO:76中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:77~SEQ ID NO:85中之一所示，其荧光探针如SEQ ID NO:86~SEQ ID NO:87中之一所 示，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY255 位点相同，但与AZFa、AZFb区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY254 位点的探针、上、下游引物可随机组合。

用于检测Y染色体AZFc区域SY255位点的引物探针组合定义为SY255引 物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，其上游引物如 SEQ ID NO:88~SEQ ID NO:90中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:91~SEQ ID NO:94中之一所示，其荧光探针如SEQ ID NO:95~SEQ ID NO:101中之一所 示，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY254 位点相同，但与AZFa、AZFb区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY255 位点的探针、上、下游引物可随机组合。

用于检测男性性别决定基因SRY的引物探针组合定义为SRY引物探针组 合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针，其上游引物如SEQ ID  NO:102~SEQ ID NO:107中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:108~SEQ ID NO:109中之一所示，其荧光探针如SEQ ID NO:110~SEQ ID NO:112中之一所 示，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与AZFa、 AZFb、AZFc区域6对探针各不相同。上述基因SRY的探针、上、下游引物可 随机组合。

上述SY84、SY86引物探针组合用于特异性检测Y染色体的AZFa区域是 否存在缺失。

上述SY127、SY134引物探针组合用于特异性检测Y染色体的AZFb区域 是否存在缺失。

上述SY254、SY255引物探针组合用于特异性检测Y染色体的AZFc区域 是否存在缺失。

上述SRY引物探这组合用于质控，检测PCR过程是否正常。

上述所有序列可由其碱基互补序列替换。

本实施方式用于检测男性Y染色体微缺失的试剂盒还包括PCR扩增所需试 剂：10*Buffer（含镁离子的缓冲溶液）、dNTP（含dATP、dCTP、dGTP、dUTP）、 rTaq酶。

用于检测Y染色体微缺失的试剂盒，10*Buffer中MgCl浓度为1.5mM，KCl 浓度为60mM、Tris浓度为12mM。

用于检测Y染色体微缺失的试剂盒，dNTP浓度为0.2mM。

所有合成引物浓度为300uM，探针浓度为100uM。

所述引物之间Tm（melting temperature，寡核苷酸的解链温度）值相差波动 于2-4℃，探针之间Tm值相差波动于2-4℃，引物探针之间Tm值相差为10℃ 左右。

一种用于检测Y染色体微缺失的基因检测方法，包括以下步骤：

a)从人抗凝血中提取基因组DNA；

b)以步骤a所得人基因组DNA试样为模板，利用上述的各引物探针组合对 Y染色体的AZF区域及SRY进行特异性PCR检测；

c)设定PCR反应条件，根据探针荧光标记选择对应探针检测通道的颜色；

d)根据扩增曲线颜色及曲线有无判断对应AZF区域6个位点否存在缺失。

PCR反应条件为：94℃2min；94℃5S，52℃45S，60℃45S，此过程进 行40个循环。

本实施方式设计了6组探针对特异性的检测Y染色体AZFa、AZFb、AZFc 区域微缺失，1组男性性别决定基因探针对进行质控，另6组探针对分属到两个 PCR反应中，同一条件下进行PCR，女性DNA样本为阴性对照，灭菌水为空 白对照以防止检验体系受污染。

实施例1

一、材料

1.仪器：实时荧光定量仪

探针、引物设计：以上述设计了6对探针、引物对特异性的检测AZF序列， 并同时设计1对探针、引物作为质控，检测男性性别决定基因，以检测PCR检 测过程是否正常进行，以正常已育男性DNA样本作为阳性对照，女性DNA样 本作为阴性对照，灭菌水作为空白对照防止检验体系被污染。

2.使用下述探针引物对检测AZFa、AZFb、AZFc区域位点缺失。

SY84上游引物5'-CCTATTTGTTTTAAGGTGCCATTCC-3'（SEQ ID  NO:1）

SY84下游引物5'-GCTTGCCTGAGCATCCTACAG-3'（SEQ ID NO:9）

SY84探针5'-VIC-CTCTACCTCCTTCCCCCAGTGCCCA-BHQ-3' （SEQ ID NO:15）

SY86上游引物5'-GGCTTCCCAGAGTTGTTACAAAG-3'（SEQ ID  NO:23）

SY86下游引物5'-CTCAAGGACTGTGAGAATCAAGGTT-3'（SEQ ID  NO:29）

SY86探针

5'-VIC-AATCCCAAAGACTGGGCCCCTTAAACA-BHQ-3' （SEQ ID NO:34）

SY127上游引物5'-GGCTCACAAACGAAAAGAAAAAG-3'（SEQ ID  NO:42）

SY127下游引物5'-CTTTTTGTGGGCATGAACACA-3'（SEQ ID NO:51）

SY 127探针5'-FAM-TAGCACCCACTGGAATCTACCAAAGCCC-BHQ-3' （SEQ ID NO:56）

SY134上游引物5'-GACTCACTATAGGGCGAATTGG-3'（SEQ ID  NO:59）

SY 134下游引物5'-GGTGAGGCAGACAGTTTTGTAG-3'（SEQ ID  NO:64）

SY134探针5'-FAM-TACGGGCCCCCCCTCGAG-BHQ-3'（SEQ ID  NO:69）

SY254上游引物5'-AAGGCAAAATCGTGCCAAAC-3'（SEQ ID NO:75）

SY254下游引物5'-CCATTGTTCATGATGTATGTTAAGGTAA-3'（SEQ ID  NO:77）

SY254探针

5'-CTGTTTTTGTTGGTGGAATTGATGCTAGGG-BHQ-3' （SEQ ID NO:87）

SY255上游引物5'-GTTACAGGATTCGGCGTGAT-3'（SEQ ID NO:89）

SY255下游引物5'-CTCGTCATGTGCAGCCAC-3'（SEQ ID NO:92）

SY255探针5'-ROX-TAGGTTTCAGTGTTTGGATTCCGCCA-BHQ-3' （SEQ ID NO:95）

SRY上游引物5'-TTTTCGGCTTCAGTAAGCATTTT-3'（SEQ ID  NO:102）

SRY下游引物

5'-AATCCCAGAATGCGAAACTCA-3'（SEQ ID NO:108）

SRY探针5'CY5-CACTGGTATCCCAGCTGCTTGCTGATC-BHQ-3' （SEQ ID NO:110）

3.PCR反应试剂：10*Buffer（含镁离子）、dNTP（含dATP、dCTP、dGTP、 dUTP）、rTaq酶。

二、方法

1.基因组DNA提取

购买试剂盒或按常规分子生物学方法提取基因组DNA。分别提取1例正常 男性基因组DNA、4例非正常男性基因组DNA及1例女性基因组DNA。

2.荧光定量PCR检测

PCR反应前将试剂放于冰上自然溶解，取PCR管并做好标记，分别加入灭 菌水、10*Buffer、dNTP、rTaq酶、待检测DNA样本，每个样本同时进行2 个PCR检测，即PCR反应液A 22.5μl+待检测样本DNA2.5μl，PCR反应液B 22.5μl+同一待检测样本DNA2.5μl，PCR反应体系见表2。每次检测均设立阳性 对照（正常男性基因组DNA）及阴性对照（女性基因组DNA），灭菌水空白对 照。

表1PCR反应体系

按以下PCR反应条件进行检测：94℃2min；94℃5S，52℃45S，60℃ 45S，此过程进行40个循环。

三、结果分析：

1.检测成功条件：荧光定量PCR结束后，加入反应液A及B的阳性对照a、 b均出现四色平滑扩增曲线，曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好（如图1-10 所示），且阴性对照c未出现平滑扩增曲线。曲线CT值波动于18-30之间为检 测正常。

2.根据所不同探针荧光标记选择检测通道和颜色，根据不同通道扩增情况 判断相应位点有无缺失。

3.所有待检测样本SRY探针均应出现扩增，否则为DNA提取失败。

图1-2为正常男性检测结果，该样本SRY探针出现扩增，表明该样本检测 成功，阴性对照、空白对照未出现扩增，阳性对照7条探针均出现扩增，表明 检测过程无误差、无污染，该样本所有检测位点均出现扩增，无Y染色体微缺 失。

图3-4为同一不育男性样本，该样本SRY探针出现扩增，表明该样本检测 成功，阴性对照、空白对照未出现扩增，阳性对照7条探针均出现扩增，表明 检测过程无误差、无污染，SY127、SY134、SY254、SY255位点出现扩增表明 该样本AZFb、AZFc区域无缺失，SY84、SY86位点未出现扩增，表明AZFa 区域的SY84、SY86位点有缺失，其中图3显示SY84位点缺失，图4显示SY86 位点缺失。

图5-6为同一不育男性样本，该样本SRY探针出现扩增，表明该样本检测 成功，阴性对照、空白对照未出现扩增，阳性对照7条探针均出现扩增，表明 检测过程无误差、无污染。SY84、SY86、SY134、SY254、SY255位点均出现 扩增，而SY127位点未出现扩增，表明AZFb区域的SY127位点缺失。其中， 图5显示SY127位点缺失。

图7-8为同一不育男性样本，该样本SRY出现扩增，表明该样本检测成功， SY84、SY86、SY127、SY254、SY255出现扩增，而SY134位点未出现扩增， 表明AZFb区域的SY134位点缺失。

图9-10为同一不育男性样本，该样本SRY出现扩增，表明该样本检测成功， SY84、SY86、SY127、SY134出现扩增，而SY254、SY255未出现扩增，表明 AZFc区域的SY254、SY255位点缺失。其中，图9显示SY254位点缺失，图 10显示SY255位点缺失。

本发明的目的在于提供利用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色 体微缺失位点进行检测。实时荧光定量PCR通过PCR扩增对每一个循环产物荧 光信号的实时收集从而实现对起始模板定量及定性的分析。该技术减少了普通 PCR繁琐操作过程中的误差，降低了PCR产物污染的可能，具有操作简单、快 速、检测通量高、敏感性、特异性高的特点，是一种值得广泛推广的分子生物 学技术。本发明运用四重荧光定量PCR分两管对Y染色体AZFa区域SY84位 点、SY86位点，AZFb区域SY127位点、SY134位点，AZFc区域SY254位点、 SY255位点进行检测，同时检测男性性别决定基因SRY作为质控，以正常已育 男性DNA样本作为阳性对照，女性DNA样本作为阴性对照,灭菌水作为空白对 照防止检验体系被污染。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认 定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。