柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法

摘要

本发明公开了一种柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法。该柑橘木虱特异性分子标记DNA序列如SEQ ID NO.1所示，其鉴别引物如SEQ ID NO.2和3所示。本发明克服了传统的研究捕食性天敌对害虫捕食效应的观察法和生化手段研究捕食者与猎物关系的程序的复杂性、费用高、缺乏对靶标的特异性等问题，提供了对柑橘木虱快速、准确、特异性鉴定的柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法，为昆虫捕食行为研究提供有效的方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法。

背景技术：

柑橘木虱(D  iaphorina citri Kuwayama)属同翅目木虱科，是柑橘黄龙病亚洲种和美洲种唯一的传播媒介。它取食黄龙病株后可终生带毒，且传毒率高。目前我国防治柑橘木虱主要采取砍树和化学防治两种措施。化学防治柑橘木虱虽然有一定的效果，但频繁的使用农药对生态环境破坏和产生严重的抗药性问题不容忽视。因此寻找新的防控方法与途径是一项迫切的任务。节肢动物捕食者被认为是控制害虫种群增长的重要因素之一。对可持续控制柑橘园害虫具有重要意义。然而，目前对捕食性天敌田间捕食柑橘木虱的定量评价还缺乏行之有效的方法，如何利用分子生物学技术定性与精确定量检测捕食性天敌对柑橘木虱捕食效能，准确分析柑橘木虱捕食性天敌谱将成为害虫防治技术突破的关键。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供从柑橘木虱基因序列中克隆的，能用于柑橘木虱的物种鉴别和柑橘木虱捕食性天敌谱的检测的柑橘木虱特异性DNA分子标记。

本发明通过设计特异性引物并进行PCR扩增，大量筛选柑橘木虱CO I分子标记，获得420bp的DNA条带，经对其克隆、测序和同源比较，明确该条带可作为特异性分子标记，用于柑橘木虱的鉴别和捕食性天敌对柑橘木虱的捕食效能评价，从而实现了本发明的目的。

本发明的柑橘木虱特异性DNA分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一对能特异性鉴别柑橘木虱的PCR引物，其特征在于，包括上游引物：TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC（SEQ ID NO.2所示）和下游引物：TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA（SEQ ID NO.3所示）。

本发明的第三个目的是提供一种能特异性鉴别柑橘木虱的试剂盒，包括PCR反应试剂和引物，其特征在于，所述的引物为：上游引物：TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC和下游引物：TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA。

用此引物扩增田间采集的害虫和天敌各物种基因组DNA样本，如有420bp扩增条带的为含有柑橘木虱物种的样本。

因此本发明的第四个目的是提供一种鉴别柑橘木虱的方法，其特征在于，以上游引物：TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC和下游引物：TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA作为引物，通过PCR的方法扩增DNA样本，如有420bp扩增条带的则为含有柑橘木虱物种的样本。

本发明克服了传统的研究捕食性天敌对害虫捕食效应的观察法和生化手段研究捕食者与猎物关系的程序的复杂性、费用高、缺乏对靶标的特异性等问题，提供了对柑橘木虱快速、准确、特异性鉴定的柑橘木虱特异性分子标记DNA序列及其鉴别引物和鉴别方法，为昆虫捕食行为研究提供有效的方法。

附图说明：

图1为用设计的鉴别引物对21个物种DNA样本进行PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图。

M：DNAMarker；1：阴性对照：水；2：柑橘木虱若虫nymph of Diaphorina citri；3：阳性对照(喂食2头柑橘木虱若虫的龟纹瓢虫)Positive control Propylea japonica；4：龟纹瓢虫Propylea japonica；5：日本刀角瓢虫Serangium japonicum；6：红肩瓢虫Leis imidiate；7：小瓢虫亚属Scymnus pullus(sp)；8：丽草蛉幼虫Chrysopa sinica；9：八斑球腹蛛Theridionoctomaculatum；10：大银腹蛛Leucauge magnifica；11：草间小黑蛛Er igonidium graminicolum；12：斜紋貓蛛Oxyopes sertatus；13：微蟹蛛属Lysiteles(sp)；14：黑细长蚁Teraponera nigar；15：举腹蚁属Crematogaster(sp)；16：蚜虫Aphidoidea sp；17：柑橘黑刺粉虱Aleurocanthusspiniferus；18：红蜘蛛Tetranychus cinnbarinus；19：卷叶蛾Homona magnanima；20：稻蝗属Oxya(sp)；21：红脊长蝽Tropidothorax elegans；22：柑橘潜叶蛾Phyllocnistis citrella；23：螳螂科Mantidae(sp)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：柑橘木虱特异性DNA分子标记序列的获得及应用

采用单头匀浆法提取各物种基因组DNA

参考安瑞生等（安瑞生,谭声江,陈晓峰.小型昆虫DNA提取时匀浆方法的改进.昆虫知识,2002,39(4):311-312）的方法，将单头虫用双蒸水清洗、吸干装入1.5mL离心管，加入50μL提取缓冲液A[1%SDS，50mmol/LTris·Cl，25mmol/LNaCl，25mmol/L EDTA]，-20℃放置5min后以研磨棒捣碎，然后用100μL提取缓冲液冲洗研磨棒；65℃水浴45min，中间取出混匀2次；加入等体积的提取液B[3mol/L KAc(pH7.2)]，冰上放置1h以上；12000r/min离心10min，移上清液于另一离心管中12000r/min离心10min，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，放置-20℃1h以上；12000r/min，离心10min，收集沉淀，用70%乙醇洗涤1~2次；晾干沉淀；每管加入50μL0.1xTE，充分溶解后-20℃保存备用，即得到基因组DNA。

采用PCR扩增技术，进行柑橘木虱特异性分子标记DNA序列的筛选

针对柑橘木虱的COI基因设计特异性引物序列：

上游引物序列：TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC（如SEQ ID NO.2所示）；

下游引物序列：TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA（如SEQ ID NO.3所示）。

引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，并用于本实验所有供试物种DNA的扩增。

PCR反应体系为25μL：Taq DNA聚合酶0.5μL；dNTP2μL；10×buffer2.5μL；上游引物1μL；下游引物1μL；DNA模板1μL；ddH₂O17μL。PCR扩增反应在Eppendorf Mastercyclerep基因扩增仪中进行，对照反应体系中的DNA模板以双蒸水代替。扩增程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，扩增35个循环；最后72℃延伸5min，得到PCR扩增产物。

PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶分离，电泳缓冲液为0.5×TBE，取PCR扩增产物10μL与1μL上样缓冲液混合点入胶孔。标准分子量为2000bp DNA Ladder(Takara提供)，100V恒压电流30min，凝胶成像系统观察拍照。

样品1：将柑橘园采回来的，与柑橘木虱同域发生的节肢动物：龟纹瓢虫Propylea japonica；日本刀角瓢虫Serangium japonicum；红肩瓢虫Leis imidiate；小瓢虫亚属Scymnus pullus(sp)；丽草蛉幼虫Chrysopa sinica；八斑球腹蛛Theridion octomaculatum；大银腹蛛Leucaugemagnifica；草间小黑蛛Erigonidium graminicolum；斜紋貓蛛Oxyopes sertatus；微蟹蛛属Lysiteles(sp)；黑细长蚁Teraponeranigar；举腹蚁属Crematogaster(sp)；蚜虫Aphidoidea sp；柑橘黑刺粉虱Aleurocanthus spiniferus；红蜘蛛Tetranychus cinnbarinus；卷叶蛾Homonamagnanima；稻蝗属Oxya(sp)；红脊长蝽Tropidothorax elegans；柑橘潜叶蛾Phyllocnistiscitrella；螳螂科Mantidae(sp)，饥饿48h后，然后再按照上述方法提取DNA，用上游引物序列：TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC，下游引物序列：TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA按照上述PCR方法进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳分析。以取食2头柑橘木虱若虫的龟纹瓢虫成虫作为阳性对照、清水作为阴性对照，检验COI引物（特异性引物）的种特异性，以避免在使用柑橘木虱特异性引物的PCR中出现假阳性，PCR反应体系与程序同上。

电泳结果如图1所示，从图1中可以看出，只有柑橘木虱若虫和阳性对照(喂食2头柑橘木虱若虫的龟纹瓢虫)能够检测到420bp的特异性条带（对其进行测序，其序列如SEQ IDNO.1所示），而其他同域发生的节肢动物不能检测到该特异性条带，由此可见，本发明的特异性引物特异性强，能专一的检测出柑橘木虱，而与同域发生的其他节肢动物不发生反应，因此可以快速专一的检测出柑橘木虱。

样品2：以柑橘园新鲜采回来的各种捕食性天敌为对象，应用特异性引物：上游引物序列：TGGAGCTCCCGATATAGCTTTC，下游引物序列：TCTCCACCTCCTGCTGGATCAA按照上述PCR方法进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行电泳分析，以检测各种捕食性天敌对对柑橘木虱的捕食作用的阳性反应率，如果能检测到420bp的特异性条带，则说明是阳性。检测的捕食性天敌的种类和结果如表1所示，从表1可以看出，在所检测的8类群20种捕食性天敌中，瓢虫、草蛉、食蚜蝇、猎蝽、蚂蚁等天敌均具有捕食柑橘木虱的能力，其中以龟纹瓢虫Propylea japonica、斜纹猫蛛Oxyopes sertatus、丽草蛉Chrysopa formosa最为明显。

因此，该420bp的特异性DNA序列可作为捕食性天敌捕食柑橘木虱的分子标记。

表1：田间捕食性天敌对柑橘木虱捕食作用的COI检测。