从血液中分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用

摘要

本发明涉及一种简单有效的血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法，其包括如下步骤：全血样本预处理、Ficoll法分离、MNC收集和洗涤、MNC计数、MNC冻存、细胞复苏、MNC计数和细胞扩增。本发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞，该免疫细胞可用于治疗肿瘤。

说明书

技术领域

本发明涉及从血液中分离免疫细胞的方法及其在治疗疾病中的应用， 具体涉及从健康人体的血液中分离免疫细胞并冻存，以及在出现免疫低下 或发生疾病症状时，将免疫细胞进行体外扩增并施用于患者进行免疫细胞 治疗的方法。

背景技术

免疫细胞(immune cell)是白细胞的俗称，包括淋巴细胞和各种吞噬细 胞，也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞。淋巴细胞是免 疫系统的基本成分，在体内分布很广泛。研究发现血液中蕴含丰富的淋巴 细胞，由于这类细胞具有免疫调控和自我复制等特点，所以一直受到人们 的关注。淋巴细胞具有自然杀伤和自我保护的特性，针对病毒、细菌、真 菌感染的治疗均起到关键的作用，在癌症的治疗中具有很大的临床应用价 值。

免疫细胞在健康人体的血液中蕴含丰富，但由于年龄老化、亚健康、 罹患疾病等原因，血液中的免疫细胞数目会显著降低，增殖分化能力亦大 幅度衰退；而其他健康人的免疫细胞移植给患者则可能引起免疫排斥反 应；提取免疫细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直 接影响了免疫细胞的临床应用，使得寻找一种稳定可靠的免疫细胞获取来 源成为一个重要的问题。

研究显示，健康人的新鲜血液中含有大量有效的免疫细胞并且能有效 分离，这种组织来源的免疫细胞不仅保持了免疫细胞的特异性免疫应答的 生物学特性，而且分离出来的免疫细胞具有原始的、强劲的增殖能力，同 时还易于冷冻保存和复苏。由于免疫细胞起源于自身，大大减低了触发免 疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播 几率比较低。采集过程简单，对健康的被采集者无任何危害及损伤。以上 原因足以令从血液中分离免疫细胞成为获得免疫细胞的有效途径。

但是，目前关于血液免疫细胞的分离和扩增方法不一，且大多步骤复 杂，获得较多数量血液免疫细胞也存在一定困难，同时患者在罹患疾病时 采集血液存在一定风险。因此，本领域需要有从血液中分离、保存和扩增 免疫细胞的简单、有效的方法，以满足医药、科研、临床应用等领域的需 求。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术提取、冻存、复苏血液免疫细胞方法的 缺陷，提供一种简单有效的血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的 冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法。本发明发现使用特 定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞。本 发明基于此发现而得以完成。

因此，本发明第一方面提供了从健康哺乳动物的新鲜血液中获取免疫 细胞的方法，该方法包括以下分离步骤：

(a)全血样本预处理：将血样本充分混匀，转移至离心容器中，稀释 血液；

(b)Ficoll法分离：取离心容器，加入Ficoll细胞分离液，然后将稀释 后的血液样本加入Ficoll细胞分离液的上层，将离心容器置于离心装置 中，离心处理；

(c)单个核细胞(在本文中可用缩写MNC表示)收集和洗涤：离心处理 结束后，将上层血浆转移至离心容器，吸取白膜层于离心容器内，补充生 理盐水，混匀后再次离心处理，待细胞沉淀后洗涤两次，得到免疫细胞；

以及任选的下列步骤：

(d)针对步骤(c)所得免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细 胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。

根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对提取的免疫细胞进 行冻存的步骤：

(e)单个核细胞冻存：向步骤(c)提取的免疫细胞中加入冻存液，重悬 免疫细胞，将免疫细胞加入冻存容器，程序降温，然后再将冻存容器置于 液氮罐中长期储存；

以及任选的下列步骤：

(f)建立包含步骤以上信息的免疫细胞的数据库，并使该数据库与步骤 (e)的冻存免疫细胞进行关联。

根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的免疫细胞进 行复苏的步骤：

(g)细胞复苏：将步骤(e)冻存的冻存容器从液氮罐中取出，水浴，清 洗冻存容器表面后转移至生物安全柜中，将免疫细胞转移至装有培养基的 离心容器中，重悬，混匀，补加培养基，离心洗涤；

以及任选的下列步骤：

(h)针对步骤(g)所得复苏的免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单 个核细胞总数、单个核细胞活率及复苏率、细胞污染、遗传病、 HLA-ABC/DR配型。

根据本发明第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的免疫细胞进 行扩增的步骤：

(i)细胞扩增：用含有培养基和血清的细胞培养液对复苏后的单个核细 胞进行重悬培养，吸出细胞培养液，转移至离心容器，反复吹洗贴壁细胞， 直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，获得未成熟树突状细胞(iDC)，添加培 养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将离心容器中的细胞培养液进行离心 处理，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，针对iDC细胞 和CIK细胞进行细胞计数，再分别针对iDC细胞及CIK细胞进行培养。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(a)中，将血样本充分混匀是将 血袋上下颠倒2-8次实现的，优选4-5次。

根据本发明第一方面的方法，其中所述离心容器是离心管。

根据本发明第一方面的方法，其中所述步骤(a)的离心容器是50ml的 离心管。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(a)中，转移至离心容器中的血 液是按照150ml血量计算，每个离心容器装有25ml血液，共装6管。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(a)中，转移至离心容器中的血 液留取5ml血样于15ml离心容器中，用于血型检测。

根据本发明第一方面的方法，其中所述步骤(a)的稀释血液是通过于 离心容器中加入生理盐水稀释实现的，优选生理盐水的加入量按照与离心 管内血液体积比5：1-1：5的比例加入稀释，优选2：1-1：2的比例加入 稀释，优选按照等体积1：1的比例加入稀释，优选加入生理盐水25ml 进行等体积1：1稀释。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(a)中，稀释血液后用吸液管充 分混匀，优选25ml移液管。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(b)中，离心容器为50ml的离心 管。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(b)中，按照150ml血量计算， 取12支50ml离心管。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(b)中，每个离心容器中加入 Ficoll细胞分离液5-25ml，优选10-20ml，优选15ml。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)所述的稀释后的血液样本 加入Ficoll细胞分离液的上层是通过移液管吸取血样本沿倾斜的离心容 器壁缓缓加入来实现的，优选移液管为25ml移液管。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)所述稀释后的血液样本的 加入量为10-35ml，优选15-30ml，优选25ml。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(b)中，加入的Ficoll细胞分离 液与稀释后血液样本的体积比为1：10-10：1，优选2：7-7：2，优选3： 5-5：3，例如3：5。本发明人发现，Ficoll细胞分离液与稀释后血液样本 的体积比为3：5是特别优选的，比之于按照该比例变化20%以上的比例 加样，能在加样过程中有效避免冲散界面。

根据本发明第一方面的方法，其中所述的离心处理是通过水平离心机 实现的。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)所述的离心处理是将加样 后的离心容器置于水平离心机内离心。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)所述的离心处理是设置水 平离心机升速为1，降速为0，转速为1000-4000rpm，离心时间为 10-40min，离心温度为15-30℃，优选转速为1500-3000rpm，优选转速为 2000rpm，优选离心时间为15-30min，优选离心时间为20min，优选离心 温度为20℃。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)所述离心容器为50ml的离 心管。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(c)中，每个离心容器内吸取约 10-50ml的白膜层，优选约25-30ml。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(c)中，补充生理盐水至总体积 为30-50ml，优选45ml。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(c)中，所述混匀是通过旋紧离 心容器的盖子，将离心容器上下颠倒3-8次实现的，优选颠倒4-5次。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)所述的离心处理是设置水 平离心机升速为9，降速为9，转速为1000-4000rpm，离心时间为5-20min， 离心温度为15-30℃，优选转速为1500-3000rpm，优选转速为2000rpm， 优选离心时间为10min，优选离心温度为20℃。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)所述的洗涤第一次是观察 细胞沉淀后，倾去上清液，回流液体轻轻悬浮细胞沉淀，补充生理盐水至 总体积30-50ml，优选40ml，用25ml移液管混匀，旋紧离心容器的盖子， 设置水平离心机升速为9，降速为9，转速为1000-3000rpm，离心时间为 5-15min，离心温度为15-30℃，优选转速为1200-2000rpm，优选转速为 1500rpm，优选离心时间为10min，优选离心温度为20℃，离心处理。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)所述的洗涤第二次是观察 细胞沉淀后，倾去上清液，回流液体轻轻悬浮细胞沉淀，补充生理盐水至 总体积30-50ml，优选40ml，用25ml移液管混匀，旋紧离心容器的盖子， 设置水平离心机升速为9，降速为9，转速为1000-2000rpm，离心时间为 5-15min，离心温度为15-30℃，优选转速为1200rpm，优选离心时间为 10min，优选离心温度为20℃，离心处理。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)所述的检测单个核细胞总 数和单个核细胞活率是向步骤(c)收集的细胞沉淀中加入10-30ml生理盐 水，优选20ml，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀，吸取20μl细 胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率， 记录结果。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的冻存液是按照20-60 重量份的X-VIVO无血清培养基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15 重量份的DMSO的配方配制而成的，优选X-VIVO无血清培养基的配方 量为30重量份、40重量份或50重量份，优选人血清白蛋白的配方量为 20重量份、30重量份或40重量份，优选DMSO的配方量为8重量份、 10重量份或12重量份。在一个实施方案中，冻存液中含有约50重量份 的X-VIVO无血清培养基、约40重量份的人血清白蛋白和约10重量份 的DMSO的冻存液。本发明人发现，含有约50重量份的X-VIVO无血清 培养基、约40重量份的人血清白蛋白和约10重量份的DMSO的冻存液 是特别优选的，比之于使该冻存液的任一成分含量变化10%以上的配方 在提高冷冻效果、保护冷冻细胞等效果方面具有显著优势。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的冻存液配置 10-20ml，优选15ml，放置于0-7℃冰箱中备存，优选4℃。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的重悬免疫细胞是将 步骤(c)获得的细胞沉淀按照2×10⁵-2×10⁹/ml的密度用冻存液充分混匀， 优选2×10⁷/ml的密度。

根据本发明第一方面的方法，其中所述的冻存容器为冻存管，优选 2ml的冻存管。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的将免疫细胞加入冻 存容器后，将冻存容器用封口膜封口，并标示免疫细胞的相关信息，优选 标示免疫细胞来源的标签。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述的程序降温是将冻存 容器放入程序降温装置(优选程序降温盒)中，放入0-7℃(优选4℃)冰箱中 备用，转移至-100℃至-40℃(优选-80℃)的冰箱中储存20-36小时(优选24 小时)，再将冻存容器从程序降温装置中取出。在一个实施方案中，冻存 容器取出后，程序降温装置放入4℃冰箱以备下一次使用。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(e)所述冻存容器置于液氮罐 中长期储存，同时记录样本储存的位置。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述水浴是将从液氮中取 出的冻存容器迅速放入水浴装置(优选水浴锅)中实施的。在一个具体实施 方式中，所述水浴装置的温度在体温附近，优选37℃。在一个具体实施 方式中，所述冻存容器在水浴装置中反复震荡5-15次，优选8-10次，震 荡时间控制在5min以内，优选控制在2min以内。在一个具体实施方式 中，直至看到冻存容器中只剩下一团冰晶后从水浴装置中取出冻存容器。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述清洗冻存容器表面是 用蘸有75%酒精的无尘布将冻存容器表面水滴擦拭。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述将免疫细胞转移至装 有培养基的离心容器中、重悬和混匀的步骤是用1ml移液枪将冻存容器 中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至装有2-10ml(优选5ml)X-VIVO无血 清培养基的10-20ml(优选15ml)离心容器中重悬，并用枪头反复吹洗混匀 2-8次(优选3-5次)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述补加培养基是补加 X-VIVO无血清培养基至5-15ml(优选10ml)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(g)所述离心洗涤是设置水平 离心机升速为9，降速为9，转速为1000-3000rpm，离心时间为5-20min， 离心温度为15-30℃，优选转速为1500-2500rpm，优选转速为1800rpm， 优选离心时间为10min，优选离心温度为20℃。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(h)所述的检测单个核细胞总 数和单个核细胞活率及复苏率是向步骤(g)收集的细胞沉淀中加入 10-30ml生理盐水，优选20ml，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀， 吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细 胞总数、活率及复苏率，记录结果。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞培养液为含有 X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述重悬培养是将细胞密度 为4×10⁴-4×10⁸(优选4×10⁶)的免疫细胞置于体温条件下(优选37℃)，在 2-10%(优选5%)的二氧化碳培养箱中孵育1-4小时(2小时)。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述转移至离心容器为 50ml离心管。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述贴壁细胞吹洗1-5遍， 优选2-3遍。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述重悬未成熟树突状细胞 (iDC)通过施加1-5ml的X-VIVO无血清培养基重悬，优选2-3ml。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞因子诱导的杀伤细 胞(CIK)细胞计数为吸取20μl细胞，加入180μl台盼兰染液，充分混匀后 加入计数板计算细胞总数和活率。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述未成熟树突状细胞(iDC) 细胞计数为单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述未成熟树突状细胞(iDC) 的培养为第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的 细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)1000U/ml和白细胞介素 4(IL-4)500U/ml；第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；第6天， 加入人肿瘤坏死因子α(TNF-α)1000U/ml过夜；第7天，DC第一次收获， 计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的 表达量；第9天，DC第二次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、 CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第11天，DC第三次收获， 计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的 表达量；第13天，DC第四次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、 CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(i)所述细胞因子诱导的杀伤细 胞(CIK)的培养为第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人 血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ1000U/ml；第2天，加入含有X-VIVO 无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子CD3单抗 375ng/ml、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml； 第4天，半量换液；第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自 体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素 1α(IL-1α)500U/ml；第8天，补加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10% 自体人血清的细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素 1α(IL-1α)500U/ml；第12天，CIK第一次收获，计数，测定CD3+、 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD 19+、CD4/CD8等细 胞表面抗原的表达量；第14天，CIK第二次收获，计数，测定CD3+、 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD 19+、CD4/CD8等细 胞表面抗原的表达量。

根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤：

(a)全血样本预处理：上下颠倒血袋4-5次，将血样本充分混匀，血液 转移至50ml离心管中，转移至离心容器中的血液按照150ml血量计算， 每个离心容器装有25ml血液，共装6管，留取5ml血样于15ml离心管 中，进行血型检测，于50ml离心管中加入生理盐水25ml进行等体积1： 1稀释，用25ml移液管轻轻充分混匀；

(b)Ficoll法分离：按照150ml血量计算，取12支50ml离心管，每管 加入Ficoll细胞分离液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀释的血样本沿 倾斜的管壁缓缓加入于Ficoll细胞分离液上层，Ficoll细胞分离液与血样 本比例为3：5，加样过程中避免冲散界面，将加样后的离心管置于水平 离心机内离心，水平离心机升速为1，降速为0，转速为2000rpm，离心 时间为20min，离心温度为20℃；

(c)单个核细胞收集和洗涤：离心结束后，将上层血浆转移至50ml离 心管内，轻轻吸取白膜层于50ml离心管内，通常每管约25-30ml，补充 生理盐水至总体积为45ml，旋紧管盖将离心管上下颠倒混匀4-5次，水 平离心，水平离心机升速为9，降速为9，转速为2000rpm，离心时间为 10min，离心温度为20℃；第一次洗涤，观察细胞沉淀后，倾去上清液， 回流液体，轻轻悬浮细胞沉淀，补充生理盐水至总体积40ml，25ml移液 管混匀，旋紧管盖，水平离心，水平离心机升速为9，降速为9，转速为 1500rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；第二次洗涤，观察细胞 沉淀后，倾去上清液，回流液体，轻轻悬浮细胞沉淀，补充生理盐水至总 体积40ml，25ml移液管混匀，旋紧管盖，水平离心，水平离心机升速为 9，降速为9，转速为1200rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；

(d)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml 移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl 台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。

进一步地，可以包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤：

(e)单个核细胞冻存：按照50%X-VIVO无血清培养基+40%人血白 蛋白+10%DMSO的配方配制冻存液15ml，放置4℃冰箱中备用，将上 述获得的细胞沉淀按照2×10⁷/ml的密度用冻存液充分混匀重悬，将细胞 转移至2ml冻存管中，用封口膜封口并贴上客户标签，将冻存管放入程 序降温盒中，放入4℃冰箱储存一个小时，转移至-80℃冰箱储存过夜，次 日，从程序降温盒中取出冻存管，转至液氮罐内进行储存，同时程序降温 盒放入4℃冰箱以备下一次使用，冻存管在液氮罐中长期储存；

(f)记录步骤(e)的冻存样本储存的位置，建立免疫细胞的数据库。

进一步地，可以包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤：

(g)细胞复苏：从液氮罐中取出单个核细胞冻存管，迅速放入预先准 备的37℃的水浴锅中，反复振荡8-10次，时间控制在2min以内，直至 看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴锅中取出冻存管，用蘸有75%酒 精的无尘布将冻存管表面水滴擦拭后，迅速转移至生物安全柜中，用1ml 移液枪将冻存管中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至一装有5ml X-VIVO 无血清培养基的15ml离心管中重悬，并用枪头反复吹洗混匀3-5次，补 加X-VIVO无血清培养基至10ml，离心洗涤，水平离心机升速为9，降 速为9，转速为1800rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；

(h)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml 移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl 台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率；

进一步地，可以包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤：

(i)细胞扩增：用含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清的 细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，细胞密度为4×10⁶个细 胞，置于37℃温度条件下，5%的二氧化碳培养箱中孵育2小时，2小时 后，取出细胞培养瓶，将细胞培养液吸出，转移至50ml离心管中，剩下 瓶中的贴壁细胞用生理盐水反复吹洗2-3遍，直至贴壁细胞完全不被吹洗 下来，此时的细胞为未成熟树突状细胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO无 血清培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)，将上述转移至50ml的离心管中 的细胞培养液进行离心，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK)，吸取20μl细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，加入180μl台盼蓝染 液，充分混匀后加入计数板计算细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞总数 和活率，单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数为未成 熟树突状细胞(iDC)细胞计数，然后分别针对细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK)和未成熟树突状细胞(iDC)进行细胞培养；

优选未成熟树突状细胞(iDC)的培养步骤如下：

第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞 培养液、粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)1000U/ml和白细胞介素 4(IL-4)500U/ml；

第4天，半量换液；第5天，加入抗原负载；

第6天，加入人肿瘤坏死因子α(TNF-α)1000U/ml过夜；

第7天，DC第一次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、 HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；

第9天，DC第二次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、 HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；

第11天，DC第三次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、 HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；

第13天，DC第四次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、 HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；

优选细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养步骤如下：

第1天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞 培养液及细胞因子INF-γ1000U/ml；

第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞 培养液及细胞因子CD3单抗375ng/ml、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、 白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；

第4天，半量换液；

第6天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞 培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；

第8天，补加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的 细胞培养液、白细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500 U/ml；

第12天，CIK第一次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、 CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的 表达量；

第14天，CIK第二次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、 CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的 表达量。

此外，在本发明的第一方面，提供了对血液免疫细胞的提取方法，以 及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法。因 此，本发明第二方面提供了一种免疫细胞。

根据本发明第二方面的免疫细胞，其是根据本发明第一方面任一实施 方案所述方法获得的。

根据本发明第二方面的免疫细胞，其细胞纯度大于90%，例如大于 95%。在一个实施方案中，所述免疫细胞经3代以上传代后，细胞纯度大 于90%，例如大于95%。

此外，在本发明的第二方面，提供了一种免疫细胞。因此，本发明第 三方面提供了一种免疫细胞用于治疗疾病的用途，同时提供了一种免疫细 胞制备用于治疗疾病的药物中的用途。

根据本发明第三方面的用途，其是根据本发明第一方面任一实施方案 所述方法获得的。

根据本发明第三方面的用途，其疾病选自肿瘤、肉瘤、淋巴瘤、霍奇 金病、黑色素瘤、间皮瘤、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓癌，优 选肿瘤。

此外,在本发明的第二方面，提供了一种免疫细胞。因此，本发明第 四方面提供了一种免疫细胞用于非治疗目的保健中的应用，同时提供了一 种免疫细胞制备保健品中的用途。

根据本发明第四方面的用途，其非治疗目的保健是在出现免疫低下时 提高免疫力。

在本发明中，如未特别另外地说明，%表示重量/重量的百分数。

下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中 所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。

在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同 样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并 且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。

附图说明

图1为细胞冻存过程的流程图的示意图。

图2为细胞冻存步骤的流程图的示意图。

图3为细胞复苏扩增步骤的流程图。

图4为张三细胞培养测试图。

图5为李四细胞培养测试图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明 的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发 明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对 试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然 为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本 发明仍然在此作尽可能详细的描述。

实施例1、免疫细胞提取和冻存的方法

免疫细胞提取方法包括以下步骤：

(1)全血样本预处理：上下颠倒血袋4-5次，将血样本充分混匀，血液 转移至50ml离心管中，转移至离心容器中的血液按照150ml血量计算， 每个离心容器装有25ml血液，共装6管，留取5ml血样于15ml离心管 中，进行血型检测，于50ml离心管中加入生理盐水25ml进行等体积1： 1稀释，用25ml移液管轻轻充分混匀；

(2)Ficoll法分离：按照150ml血量计算，取12支50ml离心管，每管 加入Ficoll细胞分离液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀释的血样本沿 倾斜的管壁缓缓加入于Ficoll细胞分离液上层，Ficoll细胞分离液与血样 本比例为3：5，加样过程中避免冲散界面，将加样后的离心管置于水平 离心机内离心，水平离心机升速为1，降速为0，转速为2000rpm，离心 时间为20min，离心温度为20℃；

(3)单个核细胞收集和洗涤：离心结束后，将上层血浆转移至50ml离 心管内，轻轻吸取白膜层于50ml离心管内，通常每管约25-30ml，补充 生理盐水至总体积为45ml，旋紧管盖将离心管上下颠倒混匀4-5次，水 平离心，水平离心机升速为9，降速为9，转速为2000rpm，离心时间为 10min，离心温度为20℃；第一次洗涤，观察细胞沉淀后，倾去上清液， 回流液体，轻轻悬浮细胞沉淀，补充生理盐水至总体积40ml，25ml移液 管混匀，旋紧管盖，水平离心，水平离心机升速为9，降速为9，转速为 1500rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；第二次洗涤，观察细胞 沉淀后，倾去上清液，回流液体，轻轻悬浮细胞沉淀，补充生理盐水至总 体积40ml，25ml移液管混匀，旋紧管盖，水平离心，水平离心机升速为 9，降速为9，转速为1200rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；

(4)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml 移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl 台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果。

与提取方法配套使用的冻存方法包括以下步骤：

(5)单个核细胞冻存：按照50%X-VIVO无血清培养基+40%人血白 蛋白+10%DMSO的配方配制冻存液15ml，放置4℃冰箱中备用，将上 述获得的细胞沉淀按照1×10⁷/ml的密度用冻存液充分混匀重悬，将细胞 转移至2ml冻存管中，用封口膜封口并贴上客户标签，将冻存管放入程 序降温盒中，放入4℃冰箱储存一个小时，转移至-80℃冰箱储存过夜，次 日，从程序降温盒中取出冻存管，转至液氮罐内进行储存，同时程序降温 盒放入4℃冰箱以备下一次使用，冻存管在液氮罐中长期储存；

(6)记录步骤(5)的冻存样本储存的位置，建立免疫细胞的数据库。

志愿者张三(化名)，年龄42岁，性别男，采血量150ml。步骤(4)计 算得到单个核细胞收集总量3.20×10⁸个细胞，折合成100ml血量计算为 2.13×10⁸个细胞。步骤(5)冻存管数为18管，其中至少有9管是按照 1×10⁷/ml的密度冻存。

实施例2、免疫细胞提取和冻存的方法

参考实施例1的方法进行。志愿者李四(化名)，年龄41岁，性别女， 采血量115ml。步骤(4)计算得到单个核细胞收集总量1.40×10⁸个细胞， 折合成100ml血量计算为1.22×10⁸个细胞。步骤(5)冻存管数为12管， 其中至少有7管是按照1×10⁷/ml的密度冻存。

实施例3、免疫细胞提取和冻存的方法

参考实施例1的方法进行。志愿者王五(化名)，年龄33岁，性别男， 采血量120ml。步骤(4)计算得到单个核细胞收集总量1.69×10⁸个细胞， 折合成100ml血量计算为1.41×10⁸个细胞。步骤(5)冻存管数为14管， 其中至少有2管是按照5×10⁶/ml的密度冻存，至少有3管是按照1×10⁷/ml 的密度冻存，其中至少有2管是按照2×10⁷/ml的密度冻存。

实施例4、免疫细胞提取和冻存的方法

参考实施例1的方法进行。志愿者孙六(化名)，年龄63岁，性别女， 采血量135ml。步骤(4)计算得到单个核细胞收集总量2.44×10⁸个细胞， 折合成100ml血量计算为1.81×10⁸个细胞。步骤(5)冻存管数为16管。

根据实施例1-4可以得出以下结论：

1.年龄在30-60岁之间的健康人群，100ml的采血量都可以获取MNC 在1×10⁸个细胞以上，符合要求；

2.健康人群的MNC在性别选择上没有显著性差异。

实施例5、免疫细胞复苏的方法

冻存后免疫细胞复苏的方法包括以下步骤：

(7)细胞复苏：从液氮罐中取出单个核细胞冻存管，迅速放入预先准 备的37℃的水浴锅中，反复振荡8-10次，时间控制在2min以内，直至 看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴锅中取出冻存管，用蘸有75%酒 精的无尘布将冻存管表面水滴擦拭后，迅速转移至生物安全柜中，用1ml 移液枪将冻存管中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至一装有5ml X-VIVO 无血清培养基的15ml离心管中重悬，并用枪头反复吹洗混匀3-5次，补 加X-VIVO无血清培养基至10ml，离心洗涤，水平离心机升速为9，降 速为9，转速为1800rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；

(8)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml 移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl 台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率；

志愿者张三(化名)，冻存密度为1×10⁷/ml的冻存免疫细胞复苏9管， 细胞数量为1.6×10⁸，复苏后细胞数量为7.4×10⁷，复苏率为66%。

实施例6、免疫细胞复苏的方法

参考实施例5的方法进行。志愿者李四(化名)，冻存密度为1×10⁷/ml 的冻存免疫细胞复苏7管，细胞数量为7.9×10⁷，复苏后细胞数量为 5.5×10⁷，复苏率为70%。

实施例7、免疫细胞复苏的方法

参考实施例5的方法进行。志愿者王五(化名)，冻存密度为5×10⁶/ml 的冻存免疫细胞复苏2管，细胞数量为1.52×10⁷，复苏后细胞数量为 9.52×10⁶，复苏率为62%。

实施例8、免疫细胞复苏的方法

参考实施例5的方法进行。志愿者王五(化名)，冻存密度为1×10⁷/ml 的冻存免疫细胞复苏3管，细胞数量为4.57×10⁷，复苏后细胞数量为 3.42×10⁷，复苏率为75%。

实施例9、免疫细胞复苏的方法

参考实施例5的方法进行。志愿者王五(化名)，冻存密度为2×10⁷/ml 的冻存免疫细胞复苏2管，细胞数量为6.1×10⁷，复苏后细胞数量为 5.16×10⁷，复苏率为85%。

根据实施例5-9可以得出结论：以2×10⁷冻存密度保存的免疫细胞复 苏率是最高的。

实施例10、复苏后免疫细胞扩增的方法

复苏后免疫细胞扩增的方法包括以下步骤：

(9)细胞扩增：用含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清的 细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，细胞密度为4×10⁶个细 胞，置于37℃温度条件下，5%的二氧化碳培养箱中孵育2小时；

2小时后，取出细胞培养瓶，将细胞培养液吸出，转移至50ml离心 管中，剩下瓶中的贴壁细胞用生理盐水反复吹洗2-3遍，直至贴壁细胞完 全不被吹洗下来，此时的细胞为未成熟树突状细胞(iDC)，添加2-3ml的 X-VIVO无血清培养基重悬未成熟树突状细胞(iDC)；

将上述转移至50ml的离心管中的细胞培养液进行离心，获得的细胞 沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)；

吸取20μl细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，加入180μl台盼蓝染液， 充分混匀后加入计数板计算细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)细胞总数和活 率，单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)总数为未成熟树 突状细胞(iDC)细胞计数；

未成熟树突状细胞(iDC)的培养为第1天，加入含有X-VIVO无血清 培养基及10%自体人血清的细胞培养液、粒细胞集落刺激生物因子 (GM-CSF)1000U/ml和白细胞介素4(IL-4)500U/ml；第4天，半量换液； 第5天，加入抗原负载；第6天，加入人肿瘤坏死因子α(TNF-α)1000U/ml 过夜；第7天，DC第一次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、 HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第9天，DC第二次收获，计数，测 定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量； 第11天，DC第三次收获，计数，测定CD80、CD86、CD83、CD11c、 HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；第13天，DC第四次收获，计数， 测定CD80、CD86、CD83、CD11c、HLA-DR等细胞表面抗原的表达量；

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的培养为第1天，加入含有X-VIVO 无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液及细胞因子INF-γ 1000U/ml；第2天，加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清 的细胞培养液及细胞因子CD3单抗375ng/ml、白细胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第4天，半量换液；第6天， 加入含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白细 胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第8天，补 加一倍含有X-VIVO无血清培养基及10%自体人血清的细胞培养液、白 细胞介素2(IL-2)1000U/ml、白细胞介素1α(IL-1α)500U/ml；第12天， CIK第一次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、 CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量；第14 天，CIK第二次收获，计数，测定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、 CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等细胞表面抗原的表达量。

扩增结果在100X显微镜下拍摄图片，见图4。

志愿者张三(化名)的免疫细胞扩增，在第8天细胞开始增殖，克隆球 明显，视野中仍有少许血小板(见图4a)，故在此换液，吹散克隆球，继续 培养；在第10天细胞克隆明显增大，细胞已经有活化现象，视野清亮， 血小板较少(见图4b)，此后继续加液即可。

实施例11、复苏后免疫细胞扩增的方法

参考实施例10的方法进行。扩增结果在100×显微镜下拍摄图片，见 图5。志愿者李四(化名)的免疫细胞扩增，在第8天细胞开始增殖，克隆 球明显，视野中仍有少许血小板(见图5a)，故在此换液，吹散克隆球，继 续培养；在第10天细胞克隆明显增大，细胞已经有活化现象，视野清亮， 血小板较少(见图5b)，此后继续加液即可。

实施例12、复苏后免疫细胞的药效实验

生物分布：通过生物分布分析来评价体内靶向性能。通过在10至12 周龄的Balb/c雌性裸鼠体内皮下注射10⁷个MDA-MB-231人乳癌细胞来 获得荷瘤小鼠(Charles River Labor atories)。当可明显触及肿瘤时将小鼠 分组(n≥5)并在生物分布8天、24h或2h之前，将复苏扩增的免疫细胞进 行放射性碘化并注射到所有小鼠的侧向尾静脉中。在注射后24小时处死 小鼠(12.5μg，3.3μCi/小鼠)。对器官进行称重并用Packard Cobra伽玛计 数器读出其放射性。代表性器官的放射性含量被表示为每克组织注射剂量 的百分比(％ID/g)。

这些实验的结果表明，冻存、复苏和扩增不会削弱免疫细胞的肿瘤靶 向作用。

治疗：过在10至12周龄的Balb/c雌性裸鼠体内皮下注射2×10⁷个 MDA-MB-231人乳癌细胞来获得荷瘤小鼠(Charles River Laboratories)。 在肿瘤细胞植入9天后，当可明显触及肿瘤时将小鼠分组(n＝5)并在侧向 尾静脉通过静脉注射盐水和复苏扩增后的免疫细胞。每天监测小鼠并且每 周用测径器测量三次肿瘤生长，利用以下公式计算体积：体积＝长度×宽 度2×0.5。当肿瘤达到体积＞2000mm³或当肿瘤坏死时，将动物处死。肿 瘤的尺寸由平均值±SE表示。

在植入到裸鼠体内的MDA-MB231人乳癌模型中观察到复苏扩增后 的免疫细胞具有抑制肿瘤的活性。