一种白喉类毒素疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种白喉类毒素疫苗的制备方法，该方法是以白喉杆菌菌株为原料，经过白喉类毒素的培养、菌液分离、超滤浓缩、两次盐析和超滤脱盐等步骤制备而成的。本发明先将培养液用中空纤维滤膜除去菌体，再进行精制，从而减少后续过滤工艺中菌体和其他杂质碎片堆积引起的孔道堵塞；通过改进盐析方法，有效去除了培养液中的毒素蛋白和其他致敏原；培养液的浓缩和盐析后的脱盐方法采用的均是切向流超滤方法，减少了因对毒素蛋白的剪切造成的抗原破坏，避免了蛋白的沉淀。本发明缩短了白喉类毒素疫苗的制备时间，提高了生产效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种白喉类毒素疫苗的制备方法。

背景技术

白喉类毒素疫苗由白喉杆菌菌种制成，白喉杆菌菌体分泌出来的毒素 是单一的多肽链，不含糖基和辅基，蛋白质由560个氨基酸组成，分子 量为62kDa，是一种酶原，只有在蛋白酶的作用下，将其切成缺口毒素 ，才具有生物活性。等电点约为pH4.1，在pH6时，加热至55℃就很快 失去活性而凝固。白喉类毒素包括A、B两个片段，其中B片段是受体结 合和穿膜片段，A片段是毒性片段，通过阻抑蛋白合成中的酶活性，最 终引起细胞死亡。它对远端组织和器官也可产生毒性，尤其是心脏及 外周和中枢神经系统。

现有的制备方法所得到的白喉类毒素疫苗选择性差，质量不高，纯度 低（400-600Lf/mg TN），色泽深，用聚丙烯酰胺电泳检查，仍然是 一个多种成分的混合体。特别是菌液分离、白喉毒素溶液的浓缩、白 喉毒素的提纯、脱盐这些过程较为简单粗放，有些工艺不符合GMP要求 而被淘汰，有些工艺方法在大生产条件下使用会受到限制。例如菌液 分离工艺中，一般大生产要处理的体积要达到500L以上，若采用离心 则不太适合，处理的时间会很长，耗费大量的劳动力；若采用帆布过 滤除菌，存在过滤不彻底和帆布材料不符合GMP要求的缺陷；板框过滤 的缺点是滤板易堵塞，过滤时间可能过长；切向流过滤不易堵塞，过 滤速度也较理想，但对菌体、蛋白的剪切力较大。白喉类毒素溶液的 浓缩可采用沉淀剂沉淀后用绸布过滤得到沉淀，然后重悬沉淀，但是 绸布用到生产中不符合GMP要求；采用切向流过滤，同样也存在对蛋白 的剪切力较大和过滤速度较慢的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种白喉类毒素疫苗的制备方法，以提高白喉类 毒素疫苗的生产效率和产品质量。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种白喉类毒素疫苗的制备方法：将白喉杆菌菌种经传代发酵，甲醛 脱毒后，将培养液调节pH至6.9~7.5，然后用孔径为0.22~0.45μm的中 空纤维滤膜过滤除去菌体，滤液用孔径为10~40KD中空纤维滤膜进行超 滤，直至滤液的体积为原体积的1/8~1/10，然后向滤液中加入质量体 积比为25%~27%的硫酸铵，第一次盐析后过滤，向滤液中再次加入质量 体积比为15%~19%的硫酸铵，第二次盐析后离心分离，将离心后的沉淀 用注射用水完全溶解后，再次用孔径为10~40KD的中空纤维滤膜进行超 滤，直至滤液中硫酸铵含量小于0.025%。

优选的，超滤中所用的空纤维滤膜的孔径为30KD。

所述超滤的进口压力为1.5~2.5bar，回流口压力为0.2~1bar，流速为 200~240L/小时。

优选的，所述超滤的流速为220L/小时。

本发明先将培养液用孔径为0.22~0.45μm的中空纤维滤膜除去菌体， 再进行精制，从而减少后续过滤工艺中菌体和其他杂质碎片堆积引起 的孔道堵塞；通过改进盐析方法，有效去除了培养液中的毒素蛋白和 其他致敏原；培养液的浓缩和盐析后的脱盐方法采用的均是切向流超 滤方法，减少了因对毒素蛋白的剪切造成的抗原破坏，避免了蛋白的 沉淀，缩短了制备时间，提高了生产效率。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图；

图2是本发明中空纤维滤膜超滤的工作原理图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

白喉类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）白喉类毒素的培养

采用白喉杆菌PW8株（CMCC 38007），在马丁培养基中培养5代后，转 入大罐中以深层搅拌，在34~36℃条件下表面通气法培养48~50小时， 培养结束后按培养量的0.6%（V/V）加入甲醛溶液，30~35℃杀菌30分 钟，用管道输送至精制罐中。

2）菌液分离

取白喉类毒素培养液30L（324Lf/ml），用NaHCO₃调节溶液pH值至6.9 ，采用中空纤维超滤系统中的微滤模块（该系统型号为MUF-HF7美国P ALL，其中包含中空纤维膜柱、隔膜泵、储罐、必要的能够承受3Bar以 上压力的管道、回流阀和滤出阀，此时所用中空纤维膜柱的孔径为0. 22μm），对发酵液进行切向流超滤，去除菌体，所述的切向流超滤步 骤为：

开启泵前，检查管道流路，打开微滤柱管道滤出端和回流端的阀门， 关闭超滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；

打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5~3.5b ar,回流口压力达到0.2~1bar，开始微滤，收集滤出端液体；

待料液浓缩到5000ml开始洗滤，洗滤时，将洗滤用缓冲液出口连接到 出液罐上，调整缓冲液出液的流速和滤出端流速相一致，洗滤到3~5倍 ，停止洗滤；

洗滤停止后，关掉泵的电源开关，先打开滤出端的低位排放阀，收集 系统内的滤出液并合并到收集罐内，待排放干净后打开回流端的低位 排放阀门，将系统内的液体全部排放完毕。

3）超滤浓缩

收集滤出液1.5L，用孔径为30KD的中空纤维滤膜进行切向流超滤浓 缩，具体步骤为：

开启泵前，检查管道流路，打开超滤柱管道滤出端和回流端的阀门， 关闭微滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；

打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5~2.5b ar,回流口德压力达到0.2~1bar，开始超滤，控制滤液的流速为200L/ 小时，收集回流端液体；

待浓缩至原体积的1/8时，停止超滤浓缩。关掉泵的电源开关，先打开 回流端的低位排放阀门，收集系统内的回流液体，合并到浓缩液中， 待回流液排放干净后，再打开滤出端的低位排放阀门，将系统内的滤 出液全部排放完毕；收集浓缩液200ml。

4）两次盐析

将浓缩液用硫酸铵二段盐析法进行盐析沉淀，一段盐析时，向浓缩液 中加入质量体积比为25%的硫酸铵，静置24小时，用板框滤器(型号为 40*40*10)过滤，收集滤液230ml，在收集到的滤液中再次加入质量体 积比为19%的硫酸铵，静置24小时，在低温（2~8℃）离心机上离心， 5020g，30min，取糊状沉淀70ml。

5）超滤脱盐

上述沉淀用注射用水300ml完全溶解后，采用中空纤维超滤系统中的超 滤模块（该系统型号为MUF-HF7包含中空纤维膜柱、隔膜泵、储罐、必 要的能够承受3Bar以上压力的管道、回流阀和滤出阀，此时所用中空 纤维膜柱的孔径为30KD，对上清液进行切向流透析洗滤，所述洗滤步 骤为：

开启泵前，检查管道流路，打开超滤柱管道滤出端和回流端的阀门， 关闭微滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；

打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5~2.5b ar,回流口的压力达到0.2~1bar，开始超滤，控制滤液的流速为240L/ 小时，收集回流端液体；

超滤脱盐时，将脱盐用缓冲液出口连接到出液罐上，并通过调整滤出 阀和隔膜泵的频率控制滤出液的流速，使缓冲液出液的流速和滤出端 流速相一致，检测样品中残余硫酸铵的质量百分含量小于0.025%时为 合格，停止超滤脱盐。

得到白喉类毒素疫苗280ml，浓度为1140Lf/ml，批号为20090201。

实施例2

白喉类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）白喉类毒素的培养

培养方法同实施例1。

2）菌液分离

取发酵液30L，用NaHCO₃调节溶液pH值在7.5，采用中空纤维超滤系统 中的微滤模块（该系统型号为MUF-HF7美国PALL，其中包含中空纤维膜 柱、隔膜泵、储罐、必要的能够承受3Bar以上压力的管道、回流阀和 滤出阀，此时所用中空纤维膜柱的孔径为0.45μm），对发酵液进行切 向流超滤，去除菌体，所述的切向流超滤步骤为：

开启泵前，检查管道流路，打开微滤柱管道滤出端和回流端的阀门， 关闭超滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；

打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5~2.5b ar,回流口德压力达到0.2~1bar，开始微滤，收集滤出端液体；

待料液浓缩到一定体积时6000ml开始洗滤，洗滤时，将洗滤用缓冲液 出口连接到出液罐上，调整缓冲液出液的流速和滤出端流速相一致， 洗滤到所需要的倍数后3~5倍，停止洗滤。洗滤停止后，关掉泵的电源 开关，先打开滤出端的低位排放阀，收集系统内的滤出液并合并到收 集罐内，待排放干净后打开回流端的低位排放阀门，将系统内的液体 全部排放完毕。

3）超滤浓缩

收集滤出液1.9L，用孔径为30KD的中空纤维滤膜进行切向流超滤浓 缩，所述超滤步骤为：

开启泵前，检查管道流路，打开超滤柱管道滤出端和回流端的阀门， 关闭微滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；

打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5~2.5b ar,回流口的压力达到0.2~1bar，开始超滤，控制滤液的流速为220L/ 小时，收集回流端液体；

待浓缩至原体积的1/10时，停止超滤浓缩。关掉泵的电源开关，先打 开回流端的低位排放阀门，收集系统内的回流液体，合并到浓缩液中 ，待回流液排放干净后，再打开滤出端的低位排放阀门，将系统内的 滤出液全部排放完毕，收集浓缩液230ml。

4）两次盐析

将浓缩好的样品溶液230ml用硫酸铵二段盐析法进行盐析沉淀，一段盐 析时，向浓缩液中加入质量体积比为27%的硫酸铵，静置24小时，用板 框滤器(型号为40*40*10)过滤，收集滤液270ml，再在收集到的滤液中 加入质量体积比为15 %的硫酸铵，静置24小时，在低温（2~8℃）离 心机上离心，5020g，30min，取糊状沉淀90ml。

5）超滤脱盐

沉淀用注射用水300ml完全溶解后，采用中空纤维超滤系统（该系统型 号为MUF-HF7，包含中空纤维膜柱、隔膜泵、储罐、必要的能够承受3 Bar以上压力的管道、回流阀和滤出阀，此时所用中空纤维膜柱的孔径 为30KD，对上清液进行切向流透析洗滤，所述洗滤步骤为：

开启泵前，检查管道流路，打开超滤柱管道滤出端和回流端的阀门， 关闭微滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；

打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5~2.5b ar,回流口的压力达到0.2~1bar，开始超滤，控制滤液的流速为220L/ 小时，收集回流端液体。

超滤脱盐时，将脱盐用缓冲液出口连接到出液罐上，并通过调整滤出 阀和隔膜泵的频率控制滤出液的流速，使缓冲液出液的流速和滤出端 流速相一致，检测样品中残余硫酸铵的质量百分含量小于0.025%为合 格，停止超滤脱盐。

得到白喉类毒素疫苗290ml，浓度为1110Lf/ml，批号为20090202。

上述两批疫苗的动物免疫效果试验，结果见表1。 

表1.  20090101、20090202批白喉类毒素疫苗的效价结果

批次 效价 20090101 97 IU/ml 20090202 91 IU/ml 传统工艺均值 93 IU/ml

本发明制备的两个批次的白喉类毒素疫苗的各项生化检测结果如下：

表2. 20090201、20090202批白喉类毒素疫苗的各项生化检测结果

由上表可看出，用本发明方法制得的白喉类毒素疫苗纯度与收率有较 明显的提高，制备所用的时间明显缩短，工作效率和产品质量得到了 改善。

而且可大幅减少硫酸铵的用量，从以前每批次大约125Kg左右，降低到 目前的40Kg左右。