基于TAS途径增强病毒诱导基因沉默效率的方法及应用

摘要

本发明公开了一种基于trans-acting smallRNA即TAS途径增强病毒诱导基因沉默效率的方法及应用。本发明通过对沉默载体中靶基因片段进行修饰，从而达到增强基因沉默效率的效果。该方法一方面提高了单位长度基因沉默效率，另一方面也提供了一种特异沉默植物同一家族中单个成员的新方法，从而为植物基因组功能的分析和研究服务。本发明构建棉花皱叶病毒基因沉默载体，并对该载体中插入沉默靶基因序列进行修饰，从而使该沉默载体通过TAS途径对宿主进行高效基因沉默。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基于trans-acting smallRNA即TAS途径增强病毒诱导基因沉默效率的方法及应用。 

背景技术

病毒诱导的基因沉默(VIGS)现象是植物抗病毒侵染的一种自然机制。当病毒入侵植物时，病毒基因组转录产生病毒来源的RNA（vsRNA）被植物细胞防御机制中一些蛋白所识别，经过RNA-dependent RNA Polymerase 6（RDR6）复制，使原本单链的vsRNA形成了双链RNA（dsRNA）。该dsRNA在植物体内迅速被Dicer-like (DCL)的RNaseIII酶切割形成大小约为21-24 nt的 short interfering RNA（siRNA），siRNA与Argonaute (AGO)RNA结合蛋白以及其他RNase结合形成RNA诱导的沉默复合体( RNA-induced silencing complex，RISC)，这一RISC复合体能够特异地与同源的靶标mRNA结合，并降解这些靶标mRNA，从而达到抗病毒的目的。利用这一机制，我们可以在病毒侵染性克隆上插入植物内源的基因片段，当该病毒侵染植物时，诱发VIGS反应，从而可以特异沉默植物内源基因的表达。 

Trans-acting smallRNA（tasiRNA）是一种特殊的small RNA，主要存在于植物当中。TAS途径主要是一段非编码的RNA，在miRNA特异识别后， RISC和RDR6等蛋白相互作用后产生的一系列特定大小的sRNA片段。在拟南芥中TAS途径主要有三种，分别是TAS1、TAS2和TAS3。其中TAS1和TAS2都是依赖于ath-miR173识别，从而发生切割过程。而TAS3是依赖于ath-miR390识别从而发生切割。 

棉花皱叶病毒（Cotton leaf crumple virus, CLCrV）属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），是棉花上的重要病毒之一，对棉花的生产有着严重威胁。本发明利用CLCrV基因沉默载体，通过对外源目的片段进行修饰，使其通过TAS途径对棉花内源基因进行沉默，以达到增强目的基因沉默效率的作用，从而为植物基因组功能的研究和分析服务。 

  

发明内容

本发明的目的是提供一种基于trans-acting smallRNA即TAS途径以增强病毒诱导基因沉默效率的方法及应用。 

基于trans-acting smallRNA即TAS途径以增强病毒诱导基因沉默效率的方法是通过分子生物学方法对植物病毒沉默载体中沉默靶基因片段进行修饰，使其同时含有如下序列：5’TS（5’-GTGATTTTTCTCTACAAGCGAA-3’）的5’TS结构和3’MIR(5’-ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGAATCTGAACAAAGCATAAAAAAGTCAACAAAACTTAAAGCGGCGGTCTCATCGTAATCTCAGCCCAATACCCTATTTTCCTCTCCCCTATATAAATACTTTCTTCTTCTACTGATCTTCTTCTCACAAATAAACCCAAATATATCAATCTACTGTGTTGGTGATTAAGTACTTTCGCTTGCAGAGAGAAATCACAGTGGTCAAAAAAGTTGTAGTTTTCTTAAAGTCTCTTTCCTCTGTGATTCTCTGTGTAAGCGAAAGAGCTTGCTCCCTAAACTTATCTCTCTGATGATTTAATGTTAGAGATCTTCGTAAATCTATGTGTTTGATAGATCTGATGCGTTTTTTGAGTTGATGATTTGATTATTTTTCACTGGAAAGTATCTCATTAGGGTAACGATAATGTTTTATGGATTTGGTTGTATAACAGATCCATGAAATCTTGACTGGTTATAAAATCTGAATAATGTATTTCAAT-3’)的miR73前体片段两部分序列，以达到增强基因沉默效率。 

所述的对植物病毒沉默载体中沉默靶基因片段进行修饰的方法的步骤如下： 

1）在NCBI网站的GenBank中通过序列比对，搜索需要沉默的靶基因如CHLI序列，设计PCR克隆靶基因序列的特异引物Mir173_TS F：5’-gactagtcGTGATTTTTCTCTACAAGCGAAAGAAGTCCAGGCTCAAAT-3’和Mir173 su86bp R: 5’-ccttaattaaggTAGGTGCTACTGAAGATAGG-3’，其中F中的下划线为5’TS结构;

2）以植物如棉花基因组DNA为模板，用步骤1设计的特异引物Mir173_TS F和Mir173 su86bp R通过PCR方法，使克隆的靶基因5’端含有5’TS结构，命名为tsSU。然后将tsSU通过SpeI和PacI酶切位点，构建到病毒沉默载体pCLCrVA中，得到pCLCrVtsSU；

3）以拟南芥基因组为模板，通过miR173F：ccttaattaagg ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGA和miR73R：aggcgcgcctATTGAAATACATTATTCAGATTTTATAACC这对引物扩增得到500bp左右miR73前体片段，命名为3’MIR，然后将3’MIR通过AscI和PacI酶切位点，连入步骤2）的pCLCrVtsSU中，得到pCLCrVtsmiR173；

4）将pCLCrVtsmiR173和pCLCrVB分别电击转化到农杆菌EHA105中，得到含pCLCrVtsmiR173的EHA105和含pCLCrVB的EHA105两个菌株；

5）将含pCLCrVtsmiR173的EHA105和含pCLCrVB的EHA105菌液以1:1 的比例混合后，一次性1ml注射器吸取上述混合液，在2-3周棉花幼苗子叶背面进行浸润，用针头在子叶背面刺小洞以便于浸润；

6）浸润后的棉花幼苗，放于温室培养，培养条件为：温度为23～27℃，相对湿度为65 %～75 %，光周期为16L：8D；10-20天后观察CHLI基因沉默表型变化；

7）经过实时定量PCR检测，相比于对照组CLCrVtsSu接种植株，接种CLCrVtsmiR173的植株体内CHLI表达量下降情况。

基于trans-acting smallRNA即TAS途径以增强病毒诱导基因沉默效率的方法用于植物基因组功能的分析和研究。 

本发明相比于传统的siRNA途径，通过tasiRNA途径可以使病毒诱导的基因沉默效率提高20%，这为提高病毒诱导基因沉默中短片段沉默效率提供了一种新的方法，从而更好得用于植物基因组功能的分析。 

附图说明

图1是基于TAS途径沉默棉花CHLI 基因20天表型图； 

图2是基于TAS途径沉默棉花CHLI 基因20天沉默效率检测结果图。

具体实施方式

基于trans-acting smallRNA即TAS途径以增强病毒诱导基因沉默效率的方法是通过分子生物学方法对植物病毒沉默载体中沉默靶基因片段进行修饰，使其同时含有如下序列：5’TS（5’-GTGATTTTTCTCTACAAGCGAA-3’）的5’TS结构和3’MIR(5’-ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGAATCTGAACAAAGCATAAAAAAGTCAACAAAACTTAAAGCGGCGGTCTCATCGTAATCTCAGCCCAATACCCTATTTTCCTCTCCCCTATATAAATACTTTCTTCTTCTACTGATCTTCTTCTCACAAATAAACCCAAATATATCAATCTACTGTGTTGGTGATTAAGTACTTTCGCTTGCAGAGAGAAATCACAGTGGTCAAAAAAGTTGTAGTTTTCTTAAAGTCTCTTTCCTCTGTGATTCTCTGTGTAAGCGAAAGAGCTTGCTCCCTAAACTTATCTCTCTGATGATTTAATGTTAGAGATCTTCGTAAATCTATGTGTTTGATAGATCTGATGCGTTTTTTGAGTTGATGATTTGATTATTTTTCACTGGAAAGTATCTCATTAGGGTAACGATAATGTTTTATGGATTTGGTTGTATAACAGATCCATGAAATCTTGACTGGTTATAAAATCTGAATAATGTATTTCAAT-3’)的miR73前体片段两部分序列，以达到增强基因沉默效率。 

所述的对植物病毒沉默载体中沉默靶基因片段进行修饰的方法的步骤如下： 

1）在NCBI网站的GenBank中通过序列比对，搜索需要沉默的靶基因如CHLI序列，设计PCR克隆靶基因序列的特异引物Mir173_TS F：5’-gactagtcGTGATTTTTCTCTACAAGCGAAAGAAGTCCAGGCTCAAAT-3’和Mir173 su86bp R: 5’-ccttaattaaggTAGGTGCTACTGAAGATAGG-3’，其中F中的下划线为5’TS结构;

2）以植物如棉花基因组DNA为模板，用步骤1设计的特异引物Mir173_TS F和Mir173 su86bp R通过PCR方法，使克隆的靶基因5’端含有5’TS结构，命名为tsSU。然后将tsSU通过SpeI和PacI酶切位点，构建到病毒沉默载体pCLCrVA中，得到pCLCrVtsSU；

3）以拟南芥基因组为模板，通过miR173F：ccttaattaagg ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGA和miR73R：aggcgcgcctATTGAAATACATTATTCAGATTTTATAACC这对引物扩增得到500bp左右miR73前体片段，命名为3’MIR，然后将3’MIR通过AscI和PacI酶切位点，连入步骤2）的pCLCrVtsSU中，得到pCLCrVtsmiR173；

4）将pCLCrVtsmiR173和pCLCrVB分别电击转化到农杆菌EHA105中，得到含pCLCrVtsmiR173的EHA105和含pCLCrVB的EHA105两个菌株；

5）将含pCLCrVtsmiR173的EHA105和含pCLCrVB的EHA105菌液以1:1 

的比例混合后，一次性1ml注射器吸取上述混合液，在2-3周棉花幼苗子叶背面进行浸润，用针头在子叶背面刺小洞以便于浸润；

6）浸润后的棉花幼苗，放于温室培养，培养条件为：温度为23～27℃，相对湿度为65 %～75 %，光周期为16L：8D；10-20天后观察CHLI基因沉默表型变化；

7）经过实时定量PCR检测，相比于对照组CLCrVtsSu接种植株，接种CLCrVtsmiR173的植株体内CHLI表达量下降情况。

基于trans-acting smallRNA即TAS途径以增强病毒诱导基因沉默效率的方法用于植物基因组功能的分析和研究。 

  

本发明以棉花皱叶病毒（Cotton Leaf Crumple Virus）病毒诱导基因沉默载体，通过对该载体中插入沉默靶基因序列进行修饰，从而使该沉默载体通过TAS途径对宿主进行高效基因沉默，从半定量PCR结果看，当靶基因序列片段为86bp长时，沉默效率增加约20%。

  

实施例1 农杆菌介导的棉花皱叶病毒基因沉默载体的构建。

pJRTCLCrVA.008,pCLCrVB载体(Tuttle, J.R., et al., Geminivirus-Mediated Gene Silencing from Cotton Leaf Crumple Virus Is Enhanced by Low Temperature in Cotton. Plant Physiology, 2008. 148(1): p. 41-50.)由Dominique Robertson教授馈赠，该载体只能采用基因枪的方式对棉花进行轰击，将病毒粒子导入棉花体内。我们将其改造成适合于农杆菌浸润方式的病毒诱导的基因沉默载体。 

首先我们将质粒pJRTCLCrVA.008和双元表达载体pCambia2300同时进行KpnⅠ +SacⅠ双酶切，具体反应条件为37℃30分钟 65℃20分钟。将经过双酶切反应后的pJRTCLCrVA.008 经过1%琼脂糖胶分离后，割胶回收大约2500bp片段，命名为CLCrVA.1。同时将经过KpnⅠ +SacⅠ双酶切的目的载体pCambia2300命名为2300.1。将CLCrVA.1利用KpnⅠ和SacⅠ酶切位点连接到2300.1上，得到pCLCrVA。 

PCLCrVB和pCambia2300同时进行XbaI和SalI双酶切具体反应条件为37℃30分钟 80℃10分钟。将经过双酶切反应后的pJRTCLCrVB 经过1%琼脂糖胶分离后，割胶回收大约2200bp片段，命名为CLCrVB.1。同时将经过XbaI和SalI双酶切的目的载体pCambia2300命名为2300.2。另一方面，将pCLCrVB进行XbaI单酶切后，经过1%琼脂糖胶分离后，割胶回收大约2500bp片段，命名为CLCrVB.2 

将CLCrVB.1利用XbaI和SalI酶切位点连接到2300.2载体上，得到pCLCrVB.1。再将pCLCrVB.1进行XbaI单酶切，得到pCLCrVB.2.再利用XbaI酶切位点将CLCrVB.2连接到pCLCrVB.2，得到含有1.9个正向重复的CLCrV DNA-B组分载体，命名为pCLCrVB。

实施例2 在靶基因序列片段加入5’TS结构

以棉花cDNA为模板，通过Mir173_TS F（5’-gactagtcGTGATTTTTCTCTACAAGCGAAAGAAGTCCAGGCTCAAAT-3’小写为speⅠ位点）和Mir173 su86bp R(5’-ccttaattaaggTAGGTGCTACTGAAGATAGG-3’小写为pacⅠ位点)这对引物，通过PCR反应（反应参数为反应参数为：94℃ 3 min；94℃变性45 sec，50℃退火1 min，72℃延伸10s， 35个循环，最后72℃延伸10 min）扩增得到约100bp左右片段，其中包含CHLI基因片段86bp，命名为tsSu。

实施例3 从拟南芥基因组中扩增得到miR73前体序列

以拟南芥基因组为模板，通过miR173F（5’-ccttaattaagg ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGA-3’ 小写为pacⅠ位点）和miR173R（5’-aggcgcgcctATTGAAATACATTATTCAGATTTTATAACC-3’ 小写为AscⅠ位点）两对引物，PCR反应（反应参数为：94℃ 3 min；94℃变性45 sec，50℃退火1 min，72℃延伸10s， 35个循环，最后72℃延伸10 min）扩增得到ath-miR173前体500bp片段，命名为miR173

实施例4 将TsSU和miR173构建到CLCrVA沉默载体上。

将PCR得到的TsSU和miR173片段分别进行PacⅠ;SpeⅠ和PacⅠ;AscⅠ，在水浴37℃ 30分钟双酶切后80℃ 20分钟孵育，使内切酶失活。此时得到的两个片段，两端分别带有PacⅠ;SpeⅠ和PacⅠ;AscⅠ粘性末端，分别命名为TSU-1和miR173-1。 

再将pCLCrVA沉默载体进行PacⅠ和SpeⅠ水浴37℃ 30分钟双酶切后80℃ 0分钟孵育，使内切酶失活，此时得到的沉默载体片段两端含有SpeⅠ和PacⅠ粘性末端，命名为pCLCrV-1. 

将pCLCrV-1和TsSU-1以1:7的摩尔比混匀，加入T4连接酶和配套缓冲液，在16℃条件下，反应过夜。次日，将连接反应液热激转化大肠杆菌DH5α，具体步骤为：1.将连接反应液加入DH5α感受态细胞中，置于冰上30min；2.将冰浴30min后的 感受态细胞置于42℃，热激1min，立即置于冰上5min；3.在冷却的感受态细胞中加入1ml LB恢复培养液，37℃ 220rpm摇菌；4.一小时后，菌液经过1200rpm 1min离心，弃上清，将菌体均匀涂布于含有Km（50mg/ml）的LB固体培养基上，37℃培养过夜。第二天，通过PCR方法利用特异引物008F：5'-GCCTAATGGGTATAGAGCAAAATGGCA-3'和008R：5'-AAGCTTACCTGAACTTCCAAGTCTGGA-3'进行菌落PCR，具体步骤为：94℃ 3 min；94℃变性30 sec，55℃退火1 min，72℃延伸1min， 35个循环，最后72℃延伸10 min，筛选阳性克隆，由此得到CLCrVtsSU（DH5α）。将CLCrVtsSU（DH5α）接种5ml含Km（50mg/ml）LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养后，离心收集菌体，利用Axgen质粒提取kit提取质粒pCLCrVtsSU。

将pCLCrVtsSU进行PacⅠ和AscⅠ双酶切，水浴37℃ 30分钟双酶切后80℃ 0分钟孵育，使内切酶失活，得到pCLCrVtsSU-1.再将pCLCrVtsSU-1与miR173-1以1:7的摩尔比混匀后，加入T4连接酶和配套缓冲液，在16℃条件下，反应过夜。次日，将连接反应液热激转化大肠杆菌DH5α，具体步骤为：1.将连接反应液加入DH5α感受态细胞中，置于冰上30min；2.将冰浴30min后的 感受态细胞置于42℃，热激1min，立即置于冰上5min；3.在冷却的感受态细胞中加入1ml LB恢复培养液，37℃ 220rpm摇菌；4.一小时后，菌液经过1200rpm 1min离心，弃上清，将菌体均匀涂布于含有Km（50mg/ml）的LB固体培养基上，37℃培养过夜。第二天，通过PCR方法利用特异引物miR173F（5’-ccttaattaagg ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGA-3’）和miR173R（5’-aggcgcgcctATTGAAATACATTATTCAGATTTTATAACC-3’）两对引物，PCR反应（反应参数为：94℃ 3 min；94℃变性45 sec，50℃退火1 min，72℃延伸10s， 35个循环，最后72℃延伸10 min）筛选阳性克隆，由此得到CLCrVtsmiR173（DH5α）。将CLCrVtsmiR173（DH5α）接种5ml含Km（50mg/ml）LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养后，离心收集菌体，利用Axgen质粒提取kit提取质粒pCLCrVtsmiR173。 

实施例5. pCLCrVtsSU，pCLCrVtSmiR173和pCLCrVB电击转化农杆菌EHA105

农杆菌EHA105接种5ml 含Rif（50mg/ml）YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；离心后弃上清培养液，用无菌水重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复3-4次，得到EHA105感受态细胞。

分别取质粒CLCrVtsSU，CLCrVtSmiR173和CLCrVB 各2ul，与EHA105感受态细胞混匀，用Bio-rad gene pluser xcell 电击仪，电压2400V，电击转化EHA105，将转化后的农杆菌加入1mlYEP恢复培养基，28℃ 220rpm摇菌3小时后，取50ul菌液，均匀涂布在含有Rif（50mg/ml）和Km（50mg/ml）双抗性的YEP固体培养基上，28℃培养两天。第三天，利用M13F: 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’和M13R：5‘-CAGGAAACAGCTATGAC-3’这对引物，进行PCR筛选阳性菌落（反应参数为：94℃ 3 min；94℃变性45 sec，50℃退火30s，72℃延伸3min， 35个循环，最后72℃延伸10 min），选取阳性单克隆含CLCrVtsSu的EHA105、含CLCrVtSmiR173的EHA105和含CLCrVB的EHA105。 

实施例6. 含CLCrVtsSu的EHA105、含CLCrVtSmiR173的EHA105分别和含CLCrVB的EHA105混合后浸润棉花

将含CLCrVtsSu的EHA105、含CLCrVtSmiR173的EHA105和含CLCrVB的EHA105分别接种于含有Rif（50mg/ml）和Km（50mg/ml）的YEP培养液中，28℃下200rpm培养48小时后，含CLCrVtSmiR173的EHA105和含CLCrVB的EHA105按1：1比例混合菌液，12000rpm 离心1分钟，离心后弃上清培养液，用浸润缓冲液（10 mM MgCl₂、10mM 2-吗啉乙磺酸、and 200m M乙酰丁香酮）重悬菌体，室温放置2-3小时。含CLCrVtsSu的EHA105和含CLCrVB的EHA105的组合同样处理后，作为对照组浸润棉花子叶。

用不带针头的1ml一次性注射器，吸取适量浸润液，在2-3周棉花幼苗子叶背面进行浸润，必要时可以用针头在子叶背面刺适量小洞，便于浸润。浸润后的棉花幼苗，放于温室培养，温度为23～27℃，相对湿度为65 %～75 %，光周期为16L：8D；10-20天后观察表型。 

实施例7.棉花RNA提取，反转录和实时定量PCR检测

取浸润后20天棉花真叶100mg，利用液氮磨成粉末状后，利用天根miRcute miRNA分离提取试剂盒，提取总RNA，实验步骤依据试剂盒说明书。

取1ug总RNA，利用promega 反转录系统，进行反转录反应，所有步骤依据试剂盒说明书。 

将反转录得到的cDNA稀释10倍后，利用Roche lightcycle 480 仪器，对CHLI沉默效率进行半定量检测。其中CHLI特异检测引物为SuF（5’-GAACCATTGACATTGAGAAAGCC-3’）和SuR（5’-CGATGAGAATAAACCGAGCAGG-3’）, 内参基因UBQ7特异检测引物为UBQ7F（5’-AAGAAGACCTACACCAAGCCCAAG-3’）和UBQ7R（5’-GACTCTACTCAATCCCCACCAGCC-3’）。 

半定量QPCR程序为孵育：94℃ 2分钟，扩增：94℃ 20秒，63℃ 10秒 72℃ 10秒 共45个循环 

结果表明，CLCrVTSmiR与对照CLCrVtsSU相比，CHLI沉默效率增加20%。

  

序列：

SEQ ID NO:1：5’TS   5’-gtgatttttctctacaagcgaa-3’

SEQ ID NO:2：3’MIR

5’ -atatttggagaccgtcagattcgaatctgaacaaagcataaaaaagtcaacaaaacttaaagcggcggtctcatcgtaatctcagcccaataccctattttcctctcccctatataaatactttcttcttctactgatcttcttctcacaaataaacccaaatatatcaatctactgtgttggtgattaagtactttcgcttgcagagagaaatcacagtggtcaaaaaagttgtagttttcttaaagtctctttcctctgtgattctctgtgtaagcgaaagagcttgctccctaaacttatctctctgatgatttaatgttagagatcttcgtaaatctatgtgtttgatagatctgatgcgttttttgagttgatgatttgattatttttcactggaaagtatctcattagggtaacgataatgttttatggatttggttgtataacagatccatgaaatcttgactggttataaaatctgaataatgtatttcaat-3’

SEQ ID NO:3：Mir173_TS F：5’-gactagtcgtgatttttctctacaagcgaaagaagtccaggctcaaat-3’

SEQ ID NO:4：Mir173 su86bp R: 5’-ccttaattaaggtaggtgctactgaagatagg-3’

SEQ ID NO:5：miR173F：5’ccttaattaaggatatttggagaccgtcagattcga 3’

SEQ ID NO:6：miR73R： 5’aggcgcgcctattgaaatacattattcagattttataacc 3’

SEQ ID NO:7：SuF 5’-gaaccattgacattgagaaagcc-3’

SEQ ID NO:8：SuR 5’-cgatgagaataaaccgagcagg-3’

SEQ ID NO:9：UBQ7F 5’-aagaagacctacaccaagcccaag-3’

SEQ ID NO:10：UBQ7R 5’-gactctactcaatccccaccagcc-3’