DPAs 及高分子聚合物用于高脂血以及降低肥胖动物摄取食物量、脂肪组织重量

摘要

本发明提供DPAs类或/及其高分子聚合物，用于改善高脂血、动脉粥样硬化以及降低肥胖动物的食物摄取量与肥胖组织含量。

说明书

【技术领域】

本发明为将DPAs类化合物或或DPAs复合化合物，用于改善血中脂肪含量及肥胖状态，尤其涉及血脂过高、脂肪组织过量、新陈代谢恒定(metabolic homeostasis)的维护或食物摄取量以及混合上述状态相关型式的疗效。 

【背景技术】

以茶碱为骨架的黄嘌呤类衍生物其第七位氮基上进行修饰的KMUP-1，能活化上皮以及内皮的内皮性一氧化氮合成酶(eNOS)，部分活化平滑肌可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)、磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制作用。已经证实KMUP-1可影响环腺苷单磷酸盐(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶(protein kinase A,PKA)及环鸟嘌呤甘单磷酸盐(Cyclic guanosine monophosphate,cGMP)/蛋白激酶G(PKG)等路径，并且会引起气管上皮细胞一氧化氮的生成量增加，进而活化气管平滑肌细胞内sGC，DPA-1或直接活化气管平滑肌细胞内sGC，使cGMP量增加激活PKG。吴炳男等人于2004年British journal of pharmacology报导DPA-1也可活化腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)引起cAMP量增加而活化PKA，PKA和PKG两者都会引起平滑肌细胞膜钾离子通道开启，最后使气管平滑肌松弛。cAMP及cGMP为细胞内二次讯传讯者，同时调节多种生理反应，包括细胞生长及分化、细胞凋亡、醣解作用及酯解作用、免疫及发炎反应等。研究报告指出DPA-1不但可诱发内生性一氧化氮释放，具备类似供应一氧化氮(NO donor)的药理作用。因而历年以相关活性提出发明申请096121950号的抗高血压、095112923号治疗摄护腺肥大、094129421 号抗肺动脉高血压，以及美国12/878451复合盐等发明申请案。 

DPAs类化合物的哌嗪基经由化学合成方式，使得矿物酸、呈现机酸以及含呈现羧酸基团的史他汀(Statin)衍生物、抗炎类药物、前列环素，抗气喘类药物制备成为DPAs复合化合物。 

发明人曾经构思以KMUP类化合物或哌嗪(piperazine)经由化学合成方式制备的KMUP复合化合物。KMUP复合化合物的合成反应，可将KMUP类化合物混合着C1-C4低醇类与水的混合溶液，与足量的矿物酸，形成四级铵盐类。另外则为KMUP类化合物的矿物酸或有机酸，混合着C1-C4低醇类与水的混合溶液，其KMUP类化合物的用量需考虑混合溶液内足以将“RX”基团的反应药物如Statin的羧酸衍生物、Statin的酯衍生物、带保护基团statin的衍生物，抗炎类药物、前列环素，以及抗气喘类药物Montelukast、Cromolyn sodium、Nedocromil等含羧酸基团反应物溶解，随着水份的性质、反应温度，而选择C1-C4低醇类并调整混合溶液的用量，首选为乙醇、异丙醇而搭配5%-30%水分，10%水分搭配90%乙醇或异丙醇。于碱性催化剂水解Statin的酯衍生物的反应，于混合溶液添加Statin的酯衍生物的用量，约每升10毫摩尔至1摩尔。经回流混合溶液供反应物达到加速作用，应升高混合溶液的温度至40°C-70℃左右，而形成KMUP-1的KMUP复合化合物，过滤后需再度溶解于混合溶液，最好在室温下进行再结晶。上述的矿物酸为包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸(H₃PO₄)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)等。呈现机酸则选用包括柠檬酸、甘草酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、烟碱酸、异烟碱酸、酒石酸、丁二酸、己二酸、脂肪酸、甲磺酸、苯氧戊酸等。均揭示于2010年1月29日，案号为099102735号的本国专利申请案。 

Statins类药物有益于心血管系统，不仅在于降低胆固醇的作用，尚且涵盖着显著的异戊二烯(isoprenoid)合成的抑制作用，该产品为提供细胞内信号的重要脂质附件(lipid attachments)等多效性作用。 

【发明内容】

发明人鉴于公知技术尚呈现所不完备处，经过悉心试验与研究，并一本锲而不舍的精神，终构思出本申请“PAs及高分子聚合物用于高脂血、动脉粥样硬化可降低肥胖动物的食物摄取量与肥胖组织含量”，能够克服现有技术的不足，以下为本申请的简要说明。 

根据其构想，而于适当实施例，有效量主成分选自如式(I)的DPAs类化合物(DPAs derivative compound)，或式(II)的DPAs复合化合物(DPAs complex compound)，于添加适量赋形剂，运用制剂方式处理所制备的组合物，经由适宜方式给予动物体内的各种剂型，均可呈现上述改善肥胖状态，尤其涉及血中脂肪含量、动脉粥样硬化、脂肪组织含量、新陈代谢恒定(metabolic homeostasis)的维护、食物摄取量或混合上述状态的相关型式等功能。该动物，包括人类以及供肉用的家禽如鸡、鸭、鹅，家畜如猪、牛、鹿、马、羊或鱼类、鸽子等。而于减少脂肪组织且增加供肉用动物的精瘦体肉，将有利于提供消费者较少油脂的动物肉品。以包含添加DPAs类化合物作为食物、饲料的添加物，导致农场精简喂饲动物的饲料用量，有利于农场的经营费用上达到更节省的经济效果。 

根据其构想，如式(I)所示结构的哌嗪取代类似结构(disubstituted piperazine analogs,DPAs)以DPAs类化合物称之，其中R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组：氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基；碳数1-5烷氧基的取代基。 

而于适当实施例，DPAs类化合物为DPA-1、DPA-2、DPA-3及DPA-4类。于说明书为的叙述说明本发明技术，若非特别叙明以DPAs类代表 DPAs类化合物(DPAs derivative compound)、或DPAs复合化合物(DPAs complex compound)。 

发明人更构思该DPAs类化合物可经由化学合成方式与Statin类药物、羧甲基纤维素钠、高分子聚合物或聚麸胺酸基团衍生物等含有羧酸基团结构的化合物，制备成为式(II)的DPAs复合化合物(DPAs complex compound)。 

式(II) 

根据其构想，一种DPAs复合化合物化合物，具有如式(II)所示的结构，其中R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组： 

氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基； 

碳数1-5烷氧基的取代基； 

RX其选自以下所组成含羧酸基团群组中的一种： 

Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合物或聚麸胺酸基团衍生物药物；以及 

RX^-可为上述基团带负电的阴离子。 

而于适当实施例，DPAs复合化合物为DPA-1、DPA-2、DPA-3及DPA-4类与含羧酸基团衍生物的Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methycellulose,sodium CMC)、高分子聚合物、聚麸胺酸基团衍生物药物及其混合物等化合物经合成的DPAs复合化合物。 

如式(II)的DPAs类化合物或其DPAs复合化合物，其中DPAs类可代表为DPA-1、DPA-2、DPA-3与DPA-4等，如(7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤 (7-[2-[4-(2-chloro-phenyl)piperazinyl]-ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-1)，DPA-2为7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine)，DPA-3为7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine)，而DPA-4为7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]-ethyl]-1,3-dimethylxanthine)。 

上述式(II)的RX基团均可选自Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methycellulose,sodium CMC)、高分子聚合物(Co-polymers)药物、聚麸胺酸(γ-PGA)基团衍生物及其混合物等含羧酸基团的药物，^-RX可为上述基团带负电的阴离子，上述卤素为指氟、氯、溴、碘等基团。而于适当实施例，含羧酸基团的Statin类药物，必要时为指结构上含羧酸基团的市售史他汀(Statin)类药物，包括阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、罗瓦斯达汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、辛伐他汀(Simvastatin)及其混合物。高分子聚合物(Co-polymers)，必要时为指结构上含羧酸基团的高分子量聚合分子，包括玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(polymethacrylates)、优特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或称为polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚羟基乙酸钠(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)及其混合物。玻尿酸称为醣醛酸，为指含D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)及N-乙酰葡糖胺(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG)单元组成的高分子聚合物。聚甲基丙烯酸脂 (polymethacrylates,PMMA)为甲基丙烯酸的高分子聚合物，而优特奇(Eudragit)为一种聚甲基丙烯酸脂的产物。硫酸葡聚醣与硫酸乙酰肝素，为由硫酸基团聚合的多醣分子及其混合物。 

而于适当实施例，含羧酸基团的聚麸胺酸(poly-γ-polyglutamic acid,γ-PGA)基团衍生物，必要时为指结构上含羧酸基团的海藻酸钠(alginate sodium)、聚麸胺酸(poly-γ-polyglutamic acid,γ-PGA)、聚麸胺酸钠(poly-γ-polyglutamic acid sodium,γ-PGA sodium)或是聚赖胺酸与海藻酸钠交联的聚海藻酸钠(alginate-poly-lysine-alginate,APA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium;PLA sodium)、聚羟基乙酸钠(polyglycolic acid sodium;PGA sodium)及其混合物。 

根据其构想，DPAs类化合物选择与Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合药物及聚麸胺酸基团衍生物药物等含羧酸基团中的一种药物加以混和，抑或经由合成如式(II)的DPAs复合化合物，均可呈现改善高脂血及体重失衡等医疗功能。 

根据上述构想，DPAs类化合物所合成如式(II)的DPAs复合化合物，其间添加反应的RX基团为一单位摩尔量合成如上述式(II)复盐类，为DPAs类与单量体羧酸基团合成的复盐类。而基于反应酸的用量以及立体结合的因素，投与参与反应的RX量充足的状态下，可为二单位摩尔量以上，则可呈现如式(II)所示的双量体羧酸基团的复盐类。 

式(II) 

不论单量体或双量体的DPAs复合化合物于添加适量赋形剂均可 成为一种药物组合物，运用制剂方式处理成适宜给予哺乳类动物体内各种剂型，而呈现上述改善高脂血及体重失衡的医疗功能。 

将2-氯乙基茶碱(2-chloroethyl theophylline)、2-氯苯基哌嗪(2-chlorophenyl piperazine)依分子量的百分比溶解于含水乙醇(hydrous ethanol)的碱性溶液加热并回流3小时。静置过夜冷却后倒出上清液，经减压浓缩除去溶媒，再溶于1倍体积的乙醇及其3倍体积的2N盐酸(HCl)，置于50至60℃水浴形成pH 1.2的饱和溶液。经活性炭脱色、过滤、静置过夜、过滤，获得DPA-1HCl的白色结晶。 

将2-氯乙基茶碱及4-硝基苯基哌嗪依分子量的百分比溶解于含水乙醇溶液中加热并回流3小时。隔夜冷却后倒出上清液，经减压浓缩干固，再加入1倍体积的乙醇及其3倍体积的2N盐酸于50至60℃下水浴溶解成pH 1.2的饱和溶液。以活性炭脱色、过滤、放置隔夜、过滤，即可获得DPA-3HCl的黄色结晶。 

将2-氯乙基茶碱(2-chloroethyl theophylline)、2-甲氧基苯基哌嗪(2-methoxybenzene piperazine)依分子量的百分比溶解于含水乙醇(hydrous ethanol)的碱性溶液溶液中加热并回流3小时。静置过夜冷却后倒出上清液，经减压浓缩除去溶媒，再溶于1倍体积的乙醇及其3倍体积的2N盐酸(HCl)，置于50至60℃水浴形成pH1.2的饱和溶液。经活性炭脱色、过滤、静置过夜、过滤，获得DPA-2 HCl的白色结晶。 

羧甲基纤维素钠(sodium carboxyl methyl cellulose;sodium CMC)或高分子聚合物、聚麸胺酸基团的盐类溶于碱性溶液，添加KMUP类或其盐酸盐置于50至70℃水浴反应后，室温下添加乙醇放置过夜进行结晶，过滤获得KMUP类-羧甲基纤维素DPAs复合化合物、KMUP类-高分子聚合物或KMUP类-聚麸胺酸基团复合物。上述碱性溶液选自添加氢氧化钠(NaOH)或碳酸氢钠(NaHCO₃)所形成的溶液。 

根据上述构想本发明DPAs类化合物所合成式(II)或式(II)的DPAs复合化合物，为选择Statin类药物、羧甲基纤维素钠、高分 子聚合物或聚麸胺酸基团衍生物等含有羧酸基团结构的药物，适宜用于改善高脂血及体重失衡的医疗功能。具体而言为指DPA-1-阿托伐他汀复合化合物、DPA-2-阿托伐他汀复合化合物、DPA-3-阿托伐他汀复合化合物、DPA-4-阿托伐他汀复合化合物;DPA-1-西立伐他汀复合化合物、DPA-2-西立伐他汀复合化合物、DPA-3-西立伐他汀复合化合物、DPA-4-西立伐他汀复合化合物;DPA-1-氟伐他汀复合化合物、DPA-2-氟伐他汀复合化合物、DPA-3-氟伐他汀复合化合物、DPA-4-氟伐他汀复合化合物;DPA-1-罗瓦斯达汀复合化合物、DPA-2-罗瓦斯达汀复合化合物、DPA-3-罗瓦斯达汀复合化合物、DPA-4-罗瓦斯达汀复合化合物;DPA-1-美伐他汀复合化合物、DPA-2-美伐他汀复合化合物、DPA-3-美伐他汀复合化合物、DPA-4-美伐他汀复合化合物;DPA-1-普伐他汀复合化合物、DPA-2-普伐他汀复合化合物、DPA-3-普伐他汀复合化合物、DPA-4-普伐他汀复合化合物;DPA-1-瑞舒伐它汀复合化合物、DPA-2-瑞舒伐它汀复合化合物、DPA-3-瑞舒伐它汀复合化合物、DPA-4-瑞舒伐它汀复合化合物;DPA-1-辛伐他汀复合化合物、DPA-2-辛伐他汀复合化合物、DPA-3-辛伐他汀复合化合物、DPA-4-辛伐他汀复合化合物;DPA-1-羧甲基纤维素复合化合物、DPA-2-羧甲基纤维素复合化合物、DPA-3-羧甲基纤维素复合化合物、DPA-4-羧甲基纤维素复合化合物;DPA-1-玻尿酸复合化合物、DPA-2-玻尿酸复合化合物、DPA-3-玻尿酸复合化合物、DPA-4-玻尿酸复合化合物;DPA-1-聚丙烯酸复合化合物、DPA-2-聚丙烯酸复合化合物、DPA-3-聚丙烯酸复合化合物、DPA-4-聚丙烯酸复合化合物;DPA-1-聚甲基丙烯酸脂复合化合物、DPA-2-聚甲基丙烯酸脂复合化合物、DPA-3-聚甲基丙烯酸脂复合化合物、DPA-4-聚甲基丙烯酸脂复合化合物;DPA-1-优特奇复合化合物、DPA-2-优特奇复合化合物、DPA-3-优特奇复合化合物、DPA-4-优特奇复合化合物;DPA-1-聚乳酸复合化合物、DPA-2-聚乳酸复合化合物、DPA-3-聚乳酸复合化合物、DPA-4-聚乳酸复合化合物;DPA-1-聚羟基乙酸复合化合物、DPA-2-聚羟基乙酸复合化合物、DPA-3-聚羟基乙酸复合化合物、DPA-4-聚羟基乙酸复合化合物;DPA-1-硫酸葡聚醣复合 化合物、DPA-2-硫酸葡聚醣复合化合物、DPA-3-硫酸葡聚醣复合化合物、DPA-4-硫酸葡聚醣复合化合物;DPA-1-硫酸乙酰肝素复合化合物、DPA-2-硫酸乙酰肝素复合化合物、DPA-3-硫酸乙酰肝素复合化合物、DPA-4-硫酸乙酰肝素复合化合物;DPA-1-海藻酸钠复合化合物、DPA-2-海藻酸钠复合化合物、DPA-3-海藻酸钠复合化合物、DPA-4-海藻酸钠复合化合物;DPA-1-聚麸胺酸复合化合物、DPA-2-聚麸胺酸复合化合物、DPA-3-聚麸胺酸复合化合物、DPA-4-聚麸胺酸复合化合物;DPA-1-聚麸胺酸钠复合化合物、DPA-2-聚麸胺酸钠复合化合物、DPA-3-聚麸胺酸钠复合化合物、DPA-4-聚麸胺酸钠复合化合物;DPA-1-聚海藻酸钠复合化合物、DPA-2-聚海藻酸钠复合化合物、DPA-3-聚海藻酸钠复合化合物、DPA-4-聚海藻酸钠复合化合物等等。 

烷基为单价的饱和烃基(hydrocarbon radical)，以单链连接碳原子，该碳氢化合物可形成直链(straight-chain)、支链(branched)或环状(cyclic)。"碳数C1-C5烷基"为指含1到5个碳原子的烷基基团，较佳的碳数C1-C5烷基为甲烷基(methyl)、乙烷基(ethyl)、正丙烷基(n-propyl)、异丙烷基(isopropyl)、正丁烷基(n-butyl)、异丁烷基(iso-butyl)、仲丁烷基(sec-butyl)、叔丁烷基(tert-butyl)、正戊烷基(n-pentyl)、异戊烷基(iso-pentyl)、叔戊烷基(tert-pentyl)、新戊烷基(neo-pentyl)。. 

烷氧基(alkoxy)为一种烃基团，以单个氧原子取代烷基中的一个碳原子。碳数C1-C5烷氧基，较佳为甲烷氧基(methoxyl)、乙烷氧基(ethoxyl)、正丙烷氧基(n-propoxyl)、异丙烷氧基(isopropoxyl)。正丁烷氧基(n-butoxyl)、异丁烷氧基(iso-butoxyl)、仲丁烷氧基(sec-butoxyl)、叔丁烷氧基(tert-butoxyl)、正戊烷氧基(n-pentoxyl)、异戊烷氧基(iso-pentoxyl)、叔戊烷氧基(tert-pentoxyl)。 

经由肝细胞从甲羟戊酸(mevalonate)生合成异戊二烯化合物的异戊二烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)和四异戊二烯焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP），而后形成胆固醇 的过程，statins类药物可竞争性抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMG CoA reductase,HMGR)而减少甲羟戊酸的生成进而影响胆固醇的产量。 

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A，为以其HMGR还原酶(HMG-CoA-R)的催化部位(catalytic site)与statins类药物呈现特定的竞争性。该3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A代谢成甲羟戊酸(mevalonate)路径受竞争性抑制，则影响胆固醇合成的前驱分子(precursor molecule)以及诸如异戊二烯(isoprenoid)、异戊二烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)和四异戊二烯焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP）等分子。 

GGPP的衍生物能增加RhoA/ROCK以及后续的过氧化物酶体增殖物启动受体-γ(Peroxisome Proliferative Activated Receptor-γ,PPAR-γ)，均参与着高密度脂蛋白(HDL）的增加。基于从HMG-CoA reductase的抑制以阻断mevalonate的生成，抑制RhoA的四异戊二烯作用(Geranylgeranylation)，或为增加cGMP路径等均可使得RhoA去活化。当然分别运用GGPP、FPP与甲羟戊酸(mevalonate)，可以阻止细胞内HMGR功能的进行；耗尽GGPP后增加GTP RhoA的含量，又能增强Rho效应的信号。因此，黄嘌呤架构的DPA-1，其化学结构与statins类药物不同，可重新审视statins类药物的作用。 

Rho关联蛋白激酶(ROCK)已成为statins类药物和DPA-1，依赖NO/cGMP路径抑制RhoA/ROCK所呈现多效性作用的主要机制的新重心。eNOS为内皮性衍生一氧化氮(NO)的主要来源，其间涉及RhoA/ROCK，似乎可做为降低血脂和动脉粥样硬化的治疗目标。最近的证据显示statins类药物诱导eNOS表达于血管内皮细胞以改善血管的内皮功能，以及抑制HMGR而导致eNOS mRNA基因的增加。减少Rho GTPase蛋白反应可增加内皮性衍生NO的生成和生物利用度，经由Rho GTPases蛋白调节eNOS为保护心血管作用的重要机制。我们推论eNOS/cGMP的增加且减少RhoA/ROCK有益于包括DPA-1的类HMGR拮抗剂的多效性作用。 

高脂血症(Hyperlipidemia)为指血液中胆固醇、三酸甘油脂等脂肪物质呈现不正常的偏高含量。重量平衡为以基础代谢率(basic metabolic rate,BMR)为基准，不论小孩或成人的个体均不宜因为超过每日代谢热量的所需(anabolism)而增加正常的体重，或由于毒族每日热量代谢的所需(catabolism)而减轻正常的体重。而通常体重失衡(weight balance)的改善，偏重于改善因为超过每日代谢热量的所需(anabolism)而呈现体重偏高的现象。 

抗高脂血剂(Anti-hyperlipidemia agent)需要增加高密度脂蛋白(HDL)，因为低高密度脂蛋白胆固醇含量构成心血管疾病的另一危险因素；增加高密度脂蛋白可经由逆转胆固醇输送路径，预防动脉粥样硬化(atherosclerosis)现象（Brewer HB；2004年）。未知DPA-1能否从外周边细胞调解肝内过度的胆固醇含量排泄入胆，以增加高密度脂蛋白或其载脂蛋白(apo-lipoprotein)。腺苷三磷酸结合盒转运子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1）在胆固醇的逆运转(Reverse cholesterol transport,RCT)路径中扮演重要角色，ABCA1和载脂蛋白A－1(Apolipoprotein A-1ApoA-1）均与胆固醇从细胞流出调节的有关。研究指出胆固醇的排出作用，可通过抑制RhoA讯息传递路径使过氧化物酶体增殖物启动受体-γ(PPAR-γ）、肝细胞X受体α基因(liver X receptor-α,LXR-α)、ABCA1升高，这类蛋白质与活化RCT路径成现着重要的关联。 

细胞胆固醇的代谢路径，其中经由PPARs和LXRα部分已经完全被了解。statins类药物对激活LXRα和增强ABCA1的反应属于PPARs的活性证据，可增加LXRα的表达。statins类药物诱发RhoA/ROCK的抑制作用，与LXRα的活性和增加PPARs的活性有关。已知异戊二烯(isoprenoid)中间体影响PPARs和LXRα的活性，异戊二烯的活性可生成FPP和GGPP，直接经由LXRα的拮抗作用以及间接启动RhoA的geranylgeranylation，已经证实可抑制ABCA1。本发明提出DPA-1影响PPAR-γ及其相关的信号转导。 

内脏脂肪组织(visceral adipose tissues,VAT)主要可区分为 副睪脂肪(epididymal fat)、肾周脂肪(retroperitoneal fat)及背部脂肪(dorsal fat)。DPAs为经由恢复PPARγ调控eNOS和降低RhoA/ROCK活性，而提高脂肪组织的分解以及减少脂肪组织重量，抑制肥胖。 

动物肥胖状态和脂肪性肝脏疾病，为承受着内脏脂肪组织(VAT)的肥胖状态组织分解后，游离脂肪酸的分泌物所诱发而导致的不正常状态。然而由于摄食高脂肪饲料(HFD)的肥胖状态动物，给予刺激乙型交感神经接受体兴奋剂(β-agonist)，促使肥胖状态组织的过度分解现象，将造成细胞内三酸甘油酯的水解，以及经由磷酸化激素敏感性脂解酶(phosphorylated hormone-sensitive lipase,p-HSL)增加蓄积脂肪酸量，强制使得脂肪酸分泌物移出细胞外，因而减少脂肪组织的体积。 

将DPAs类化合物本身或哌嗪所合成本发明式(II)或式(II)的DPAs复合化合物进行实验，呈现如下所示的活性。 

一、DPA-1与Simvastatin影响老鼠的体重和饲料摄取量 

如表一所示每3天记录饲养8周老鼠的体重与饲料摄取量，喂食高脂肪饲料老鼠体重上升的幅度，比较标准饲料(STD)对照组大约增加2.3倍。给予DPA-1(2.5-5mg/kg)或simvastatin(5mg/kg)，均可有效地降低体重的增加。在饲料摄取方面，喂食高脂肪饲料的老鼠，不论同时给予DPA-1或simvastatin，均比喂食标准饲料对照组呈现减少摄取量的现象。而给予DPA-1的剂量1-5mg/kg或simvastatin(5mg/kg)的组别跟喂食高脂肪饲料(HFD)组比较并无差异性，显示DPA-1或simvastatin均不足以造成老鼠食欲减低，降低饲料摄取量现象。可推论DPA-1与simvastatin所呈现改善高脂血异常作用和预防体重上升的效果，并非老鼠摄取饲料量减少所造成的现象。 

表一 

(注)1.每组实验老鼠6只 

2.DPA-1-b的DPA-1用量2.5mg/kg， 

DPA-1-c的DPA-1用量5mg/kg， 

simvastatin用量5mg/kg 

3.#P＜0.05与标准饲料比较;*P＜0.05与高脂肪饲料比较 

二、DPA-1及simvastatin于高脂肪饲料所诱导的血脂异常的小鼠血清生化值的影响 

A.血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酸甘油酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)为评估血脂异常与否的生化指标。 

如表二所示饲养8周后，小鼠心脏血的的血清生化值。高脂肪饲料组的血清总胆固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)值都明显地比对照组高，而高密度脂蛋白(HDL)也比标准饲料对照组略高，显示老鼠喂食高脂肪饲料确实能诱导出血脂异常。高脂肪饲料组诱导的血脂异常老鼠，同时给予DPA-1可明显地改善高脂血异常，同时经口给予DPA-1(1-5mg/kg)组与单纯的高脂肪饲料组相比较，均可明显降低血清中血清总胆固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)的量。给予DPA-1组别不论1-5mg/kg所呈现高密度脂 蛋白(HDL)血清值，与单纯的高脂肪饲料组比较增高。给予Simvastatin与单纯的高脂肪饲料组比较，也显降低TC、TG、LDL血清值和增高高密度脂蛋白的作用。表三结果显示DPA-1和Simvastatin均具有改善高脂血异常的作用。 

表二 

(注)1.DPA-1-b的DPA-1用量2.5mg/kg， 

DPA-1-c的DPA-1用量5mg/kg， 

2.DPA-1-Simvastatinic Acid用量5mg/kg 

表三C57BL/6J小鼠的脂质降低作用 

(注)1.高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C) 

2.低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C) 

*,与高脂肪饲料(HFD)比较呈现显著差异 

表四高脂肪饲料(HFD)诱发动物体重的增加与DPAs影响体重 

表四(续) 

表四(续) 

(注)数据以平均标准偏差(mean±SEM)呈现，动物数(n=9). 

HFD=高脂肪饲料诱发的动物群;C57BL/6J小鼠在第23周牺牲; 

A组=高脂肪饲料诱发的动物群，第10～12周分别给予DPAs，1mg/kg DPA-1、1mg/kg DPA-2、1mg/kg DPA-3或1mg/kg DPA-4; 

B组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周的后6周分别给予DPAs，2.5mg/kg DPA-1、2.5mg/kg DPA-2、2.5mg/kg DPA-3或2.5mg/kgDPA-4; 

C组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周的后6周分别给予DPAs，5.0mg/kg DPA-1、5.0mg/kg DPA-2、5.0mg/kg DPA-3或5.0mg/kgDPA-4; 

与高脂肪饲料比较*P＜0.05,第10周与第23周比较#P<0.05, 

如表五所示，以高脂肪饲料饲养小鼠的体重，在第18周与第23周呈现显著的增加。以高脂肪饲料饲养的小鼠体重，给予DPAs治疗 呈现显著降低现象。其中随着1、2.5和5mg/kg给予剂量的不同，第17周体重获取量与第10周呈现显著差异(P<0.05)。A组(1mg/kg)DPAs治疗，比较第23周与第18周的体重获取量，无显著差异性。然而，B组(2.5mg/kg)和C组(5mg/kg)DPAs治疗，第23周与第18周的体重获取量，呈现显著差异性。 

表五 

(注)数据以平均标准偏差(mean±SEM)呈现，动物数(n=9).与高脂肪饲料(HFD)比较*P＜0.05, 

HFD=高脂肪饲料诱发的动物群;C57BL/6J小鼠在第23周牺牲; 

A组=高脂肪饲料诱发的动物群，第10～12周分别给予DPAs，1mg/kg DPA-1、1mg/kg DPA-2、1mg/kg DPA-3或1mg/kg DPA-4; 

B组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周的后6周分别给予DPAs，2.5mg/kg DPA-1、2.5mg/kg DPA-2、2.5mg/kg DPA-3或2.5mg/kgDPA-4; 

C组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周的后6周分别给予DPAs，5.0mg/kg DPA-1、5.0mg/kg DPA-2、5.0mg/kg DPA-3或5.0mg/kgDPA-4; 

如表六所示，喂饲率(Feeding-Rate)为全周小鼠饲料的百分率，肥胖状态小鼠在第18周再给予高脂肪饲料，秤量体重相接近的小鼠进行实验。在第22周或第23周的喂饲率，呈现显著的降低。其中随着DPAs给予剂量的不同，呈现显著节省饲料添加量，导致高脂肪饲料喂饲率下降。 

表六高脂肪饲料以及第18～23周给予DPAs的喂饲率(Feeding-Rate) 

(注)数据以平均标准偏差(mean±SEM)呈现，动物数(n=9).与高脂肪饲料(HFD)比较*P<0.05,与第18周比较#P＜0.05 

HFD=高脂肪饲料的动物群;C57BL/6J小鼠在第23周牺牲; 

A组=高脂肪饲料诱发的动物群，第10周起分别给予DPAs，1mg/kgDPA-1、1mg/kg DPA-2、1mg/kg DPA-3或1mg/kg DPA-4; 

B组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周起分别给予DPAs，2.5mg/kg DPA-1、2.5mg/kg DPA-2、2.5mg/kg DPA-3或2.5mg/kg DPA-4; 

C组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周起分别给予DPAs，5.0mg/kg DPA-1、5.0mg/kg DPA-2、5.0mg/kg DPA-3或5.0mg/kg DPA-4; 

如表七所示6周间给予DPAs促使双副睪脂肪组织重量/体重(epididymal fat Pads-Weight/Body-Weight Ratio)的比率下降，显示DPAs可抑制体脂肪的增生。 

表七双副睪脂肪组织重量/体重(epididymal fat Pads-Weight/Body-Weight Ratio)比率 

(注)数据以平均标准偏差(mean±SEM)呈现，动物数(n=9).与高脂肪饲料比较#P＜0.05 

HFD=高脂肪饲料的动物群;C57BL/6J小鼠在第23周牺牲; 

A组=高脂肪饲料诱发的动物群，第10周起给予DPAs，1mg/kgDPA-1、1mg/kg DPA-2、1mg/kg DPA-3或1mg/kg DPA-4; 

B组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周起分别给予DPAs，2.5mg/kg DPA-1、2.5mg/kg DPA-2、2.5mg/kg DPA-3或2.5mg/kg DPA-4; 

C组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周起分别给予DPAs，5.0mg/kg DPA-1、5.0mg/kg DPA-2、5.0mg/kg DPA-3或5.0mg/kgDPA-4;DPAs类与高脂肪饲料比较**P＜0.01。 

抗动脉粥样硬化与组织结构(Anti-atherosclerosis and morphology) 

高脂肪饲料诱发动脉组织结构的改变，包括血管壁的厚度比率减少。如表八所示，随着给予DPAs类剂量的不同对于防止血管壁的厚度减少现象，呈现显著差异(dose-dependently)性。 

表八 

  口服   血管壁厚度比率(%)

[0113] 

  标准饲料   26.9±2.7   高脂肪饲料   48.9±8.7^#  A-1   35.3±2.4*   B-1   32.3±1.8*   A-2   36.2±2.4*   B-2   31.3±1.8*   A-3   38.2±3.6*   B-3   34.3±2.7*

(注)数据以平均标准偏差(mean±SEM)呈现， 

动物数(n=6) 

与高脂肪饲料比较*P＜0.05;对照组，标准饲料比较^#P＜0.05; 

A组=高脂肪饲料诱发的动物群，第10周起给予DPAs，1mg/kgDPA-1、1mg/kg DPA-2、1mg/kg DPA-3或1mg/kg DPA-4; 

B组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周起分别给予DPAs，2.5mg/kg DPA-1、2.5mg/kg DPA-2、2.5mg/kg DPA-3或2.5mg/kg DPA-4; 

C组=高脂肪饲料诱发的动物群，第18周起分别给予DPAs，5.0mg/kg DPA-1、5.0mg/kg DPA-2、5.0mg/kg DPA-3或5.0mg/kg DPA-4; 

3-T-3脂肪细胞的分解活性与蛋白质表现 

评估cAMP/cGMP活性作为激活激素敏感性脂解酶(HSL)的第二个信息。 

HSL，为速率限制酶调控着脂肪细胞的分解，然后催化三酸甘油酯以及促使脂肪的分解，而释出游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)与甘油。磷酸二酯酶(Phosphodiesterases,PDE)是水解环腺苷单磷酸盐(cAMP)成为5,-磷酸腺苷(5’-AMP)的酵素，可降低脂肪的分解。PDE抑制剂能增加cAMP含量。一种非特异性PDE抑制剂(non-specific PDE inhibitor)3-异丁酰-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)，可作为PDE抑制剂。如表九、表十所示，PPAR/eNOS在脂肪的分解受DPA-1所调控，因而导致HSL和p-HSL的增加。 

表九 

   PPARγ   eNOS   Rho-kinase   p-HSL   对照组   100%   100%   100%   100%   DPA-1(0.1μM)   123%   121%   82%   120%   DPA-1(1.0μM)   135%   132%   78%   136%   DPA-1(10μM)   142%   138%   75%   144%   DPA-2(10μM)   135%   129%   81%   135%   DPA-3(10μM)   140%   131%   79%   138%   DPA-4(10μM)   143%   125%   83%   136%

表十 

DPA-1抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，但增加在人类肝癌细胞株(HePG2)HMGR的蛋白表现量 

在活性分析实验中DPA-1(0.001-10μM)如图1所示，可随着浓度呈现相关性减低羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoAreductase,HMGR)的活性，simvastatin(10μM)也可降低HMGR的活性。如图2(A)所示于人类肝癌细胞株(HepG2)给予DPA-1而与图2(B)的simvastatin(0.001-10μM)分别实验24小时，可发现HMGR的蛋白表现量明显上升。另外由如图3所示，老鼠在高脂肪饲料喂食8周后HMG-Co A reductase的表现量明显降低，而给予DPA-1(2.5-5mg/kg)或simvastatin(5mg/kg)的组别则呈现明显回升。 

四、HepG2细胞中添加mevalonate可降低HMGR的蛋白表现量 

在HePG2细胞中添加甲戊二羟酸(mevalonate)24小时测试HMGR能否被负回馈机制作用所抑制，如图4(A)所示mevalonate(60-100μM)确实会使HMG-CoA reductase下降。选择100μM的mevalonate添加细胞30分钟后，再给予simvastatin(10μM)或DPA-1(10μM)24小时，如图4(B)所示HMG-CoA reductase表现量受上述药物影响分别回升大约至50%和70%，此结果符合上述的负回馈机制与假设。 

五、DPA-1增加PPAR-γ、LXR-α、ABCA1、ApoA-I的蛋白表现 

高脂肪饲料喂食的老鼠分别给予1、2.5、5mg/kg剂量DPA-1或simvastatin(5mg/kg)，如图5(A)所示两种药物可增加过氧化物酶体增殖物启动受体-γ(PPAR-γ)的蛋白表现量，图5(B)显示两种药物可增加腺苷三磷酸结合盒转运子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)的蛋白表现量，而图5(C)显示两种药物可抑制Rho关联蛋白激酶2(Rho kinase II,ROCKII)的表现。于HePG2细胞中给予0.001-10μM剂量DPA-1与simvastatin经24小时，分别显示两种药物均可随着浓度呈现相关性增加蛋白的表现；如图6(A)与(B)显示PPAR-γ，图7(A)与(B)显示腺苷三磷酸结合盒转运子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)，图8(A)与(B)显示载脂蛋白A－1(apolipoprotein A-1,APOA-1)以及图9显示肝细胞X受体α基因(LXR-α)增加的现象。 

六、DPA-1与simvastatin影响着RhoA和ROCK II的活性 

于细胞膜与细胞质的分别实验各给予0.001-10μM剂量DPA-1经24小时后，如图10所示，于细胞膜具随着浓度呈现相关性的抑制RhoA的活性。如图11所示，喂食高脂肪饲料的老鼠给予DPA-1(1,2.5,5mg/kg)或simvastatin(5mg/kg)可呈现抑制ROCKII的表现。于HepG2细胞，如图12(A)所示DPA-1(0.001-10μM)与图12(B)所示simvastatin(0.001-10μM)均随着浓度呈现相关性的抑制Rho 关联蛋白激酶2(ROCK II)的表现。 

七、DPA-1、Simvastatin、C3胞外酶与Y27632影响HepG2细胞ROCK II、PPAR-γ、ABCA1的表现 

分别添加RhoA抑制剂的C3胞外酶(exoenzyme)或Rho kinase抑制剂的Y27632于细胞，24小时以确认ROCK II受抑制，观察ROCK II、PPAR-γ、ABCA1的表现量。如图13(A)所示simvastatin(10^-5M)、DPA-1(10^-5M)、C 3胞外酶(10μg/ml)、Y27632(10^-5M)均可抑制ROCK II。如图13(B)、(C)所示四个药物的影响下PPAR-γ、ABCA1的表现，呈现明显不同程度的增加现象。 

八、HepG2细胞经异戊二烯刺激引起RhoA的活性和ROCK II的表现受DPA-1所影响 

Argmann,C.A.等人于2005年J.Biol.Chem.第280卷第22212页报导异戊二烯(isoprenoid)可激活RhoA降低ABCA1的表现，而simvastatin则无类似的反转作用，代表simvastatin增加ABCA1表现的作用，确实为凭借着抑制HMG-CoA reductase的作用，减少isoprenoids的含量而抑制RhoA。 

上述实验的结果，DPA-1的作用几乎与simvastatin相近似，推论DPA-1可经由抑制HMG-CoA reductase而增加ABCA1的表现，为评估是否尚可经由抑制四异戊二烯焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)路径以抑制RhoA，因此于细胞中单独添加10μM异戊二烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)探讨ROCK II的表现。 

如图14(A)所示，单独以FPP处理24小时确实引起ROCK II表现的增加，以FPP处理30分钟后再给予DPA-1(0.001-10μM)经24小时则降低ROCK II的表现。如图14(B)所示，于细胞单独添加10μM GGPP，发现GGPP会活化RhoA且增加ROCK II的表现。以GGPP处理30分钟后再添加DPA-1(0.001-10μM)24小时，如图14(C)所示，于细胞膜可随着浓度呈现相关性减少RhoA/ROCK II的作用。但图 15显示0.001-10μM的simvastatin则无类似的作用。 

九、HepG2细胞经异戊二烯(isoprenoids)刺激引起PPAR-γ、ABCA1的表现受DPA-1所影响 

单独以FPP(10μM)处理HepG2细胞24小时，如图16(A)、(B)所示造成PPAR-γ、ABCA1蛋白表现降低的现象，30分钟后加入DPA-1(0.001-10μM)经24小时可上升PPAR-γ、ABCA1的表现。另外单独于细胞添加GGPP(10μM)经24小时，如图17(A)、(B)所示导致PPAR-γ、ABCA1表现的降低，而添加DPA-1(0.001-10μM)后，又具有随着浓度呈现相关性增加PPAR-γ、ABCA1表现的现象。 

十、DPA-1与cGMP抑制剂影响HepG2细胞的ROCK II表现 

于平滑肌细胞中，已知DPA-1可经由增加cGMP而抑制ROCK II表现。于HepG2细胞单独添加10μM的cGMP抑制剂Rp-8-pCPT-cGMPs，24小时后发现Rp-8-pCPT-cGMPs可增加ROCK II的表现。于该细胞，以相同浓度的Rp-8-pCPT-cGMPs与DPA-1同时添加，与单独添加Rp-8-pCPT-cGMPs相比较，如图18所示DPA-1(10μM)的添加可减少ROCK II的表现。 

上述赋形剂或称为“药学上可接受的载体或赋形剂”、“生物可利用的载体或赋形剂”，为包括溶媒、分散剂、包衣、抗菌或抗真菌剂，保存或延缓吸收剂等任何公知用于制备成剂型的适当化合物。通常此类载体或赋形剂，本身不具备治疗疾病的活性，且将本发明所揭示的衍生物，搭配药学上可接受的载体或赋形剂，制备的各剂型，给予动物或人类不致于造成不良反应、过敏或其它不适当反应。因而本发明所揭示的衍生物，搭配药学上可接受的载体或赋形剂，为适用于临床及人类。运用本发明化合物的剂型经由静脉、口服、吸入或经由鼻、直肠、阴道等局部或舌下等方式给药，可达到治疗效果。对于不同病症的患者，约每日给予0.1mg至100mg的活性成份。 

该载体随各剂型而不同，无菌注射的组成物可将溶液或悬浮于无 毒的静脉注射稀释液或溶剂中，此类溶剂如1,3-丁二醇。其间可接受的载体可为苷酸露醇(Mannitol)或水。此外固定油或以合成的单或双苷酸油酯悬浮介质，为一般习用的溶剂。脂肪酸，如油酸(Oleic acid)、橄榄油或蓖麻油等与其苷酸油酯衍生物，尤其经多氧乙基化的型态都可作为制备注射剂并为天然医药可接受的油类。此等油类溶液或悬浮液可含长链酒精稀释液或分散剂、羧甲基纤维素或类似的分散剂。其他一般使用的接口活性剂如Tween、Spans或其他相似的乳化剂或为一般医药制造业所使用于医药可接受的固态、液态或其他可用于剂型开发的生物可利用增强剂。 

用于口服给药的组合物则为采用任何一种口服可接受的剂型，其型式包括胶囊、锭剂、片剂、乳化剂、液状悬浮液、分散剂、溶剂。口服剂型一般所使用的载体，以锭剂为例可为乳糖、玉米淀粉、润滑剂，如硬脂酸镁为基本添加物。而胶囊使用的稀释液包括乳糖与干燥玉米淀粉。制成液状悬浮液或乳化剂剂型，为将活性物质悬浮或溶解于结合乳化剂或悬浮剂的油状接口，视需要添加适度的甜味剂，风味剂或为色素。 

鼻用气化喷雾剂或吸入剂组成物，可根据已知的制剂技术进行制备。例如，将组成物溶于生理食盐水中，添加苯甲醇或其他适合的防腐剂，或促吸收剂以增强生物可利用性。本发明化合物的组合物可制成栓剂，进行经直肠或阴道的给药方式。 

本发明化合物可运用“静脉给药”，其为包括经由皮下、腹腔、静脉、肌肉，或关节腔内、颅内、关节液内、脊髓内注射，主动脉注射，胸腔注射，疾病部位内注射，或其他适合的给药技术。 

【具体实施方式】

本申请所提出的“改善高脂血及体重失衡的DPAs类四级铵哌嗪盐类”将可由以下的实施例说明而得到充分了解，使得本领域技术人员可以据以完成的，然而本申请的实施并非可由下列实施例而被限制其实施型态，本领域技术人员仍可依据除既公开的实施例的精神推演出其他实施例，这类实施例都应当属于本发明的范围。 

实验材料及方法： 

活性实验： 

5周大雄性C57BL/6J，购自国家动物实验中心，喂养于高雄医学大学动物实验中心。 

实验药品的配置: 

(1).DPAs类，实验中所使用的KMUP或其复合铵盐类为本实验室所合成的化合物。以去离子水溶解，使其浓度为10^-2M，再依所需浓度以去离子水稀释。 

(2).Y27632((R)-(+)-trans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-Pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride monohydrate)以去离子水溶解，使其浓度为10^-2M，再依所需浓度以去离子水稀释。 

(3).辛伐他汀(2,2-dimethylbutanoic acid (1S,3R,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7-dimethyl-8-[2-[(2R,4R)-tetra-hydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl]ethyl-1-maphthalenyl ester,Simvastatin)以甲基亚砜(DMSO)溶解，使其浓度为10^-2M，再依所需浓度以去离子水稀释。 

实验药品： 

B.西德Merck公司： 

甲醇(CH₃OH)、氯化钠(NaCl)、氢氧化钠(NaOH) 

C.美国Sigma-Aldrich公司： 

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA) 

甘油(Glycerol) 

硫酸乙酰肝素(Heparin Sulfate) 

三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris(hydroxymethyl)amino-methane HCl,Tris-HCl) 

Tween-20 

磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)缓冲液 

(10倍) 

D,美国Bio-Rad公司： 

过硫酸铵(Ammonium Persulfate,APS) 

30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(Acrylamide/Bis-acrylamide,Acrylamide/Bis)(37.5:1)试剂 

2-巯基乙醇(2-Mercapethanol) 

四甲基乙二胺(N，N，N’,N’-Tetramethyl-Ethylene Diamine,TEMED) 

蛋白质分析染料(Protein Assay Dye) 

十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS) 

三羟甲基氨基甲烷(Tris Base) 

甘胺酸(Glycine) 

E.美国Roche公司： 

混合片剂(Complete Mini Cocktail表t) 

蛋白酶抑制混合片剂(Complete,Mini Protease Inhibitor Cocktail表ts) 

F.美国Millipore公司： 

聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride,PVDF)膜 

增强型化学冷光检测技术(Enhanced Chemiluminescence,ECL) 

G.日本OSAKA公司: 

羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose,sodium CMC) 

H.抗体(Antibody)： 

(1)一级抗体(Primary antibody) 

Anti-eNOS:Upstate Laboratories,U.S.A. 

Anti-ROCK:Upstate,U.S.A. 

Anti-RhoA:Santa Cruze,U.S.A. 

Anti-5-HT_2B:Upstate,U.S.A. 

Anti-AKT:Santa Cruz Biotechnology,U.S.A. 

Anti-phosphor-AKT:Santa Cruz Biotechnology,U.S.A. 

Anti-5-HTT:Chemicon Biotechnology,U.S.A. 

Anti-ERK1/2:Santa Cruz Biotechnology,U.S.A. 

Anti-phosphor-ERK1/2:Santa Cruz Biotechnology,U.S.A. 

Anti-β-肌动蛋白（actin）:Sigma-Aldrich,U.S.A. 

(2)二级抗体(Second antibody)： 

辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(Goat anti-mouse IgG Horseradish Peroxidase Conjugate:Santa Cruz Biotechnology,U.S.A) 

辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体(Goat anti-rabbit IgG Horseradish Peroxidase Conjugate:Santa Cruz Biotechnology,U.S.A) 

辣根过氧化物酶标记山羊抗山羊抗体(Goat anti-goat IgG Horseradish Peroxidase Conjugate:Santa Cruz Biotechnology,U.S.A) 

I.实验缓冲溶液的制备： 

(1)1.5M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl)pH 8.8：取27.23g三羟甲基氨基甲烷(Tris base)溶于80mL去离子水中，以1N氯化钠调整pH值至8.8，最后加去离子水使最终体积为150mL，储存于4°C。 

(2)0.5M Tris HCl,pH 6.8：取6.0g Tris base溶于60mL去离子水，以1N盐酸调整pH值至6.8，最后加去离子水使最终体积为100mL，储存于4°C。 

(3)10%十二烷基硫酸钠(SDS)：取10g SDS混匀于90mL去离子水，最后加去离子水使最终体积为100mL，储存于室温。 

(4)组织或细胞裂解液(Tissue or Cell lysis buffer)：取10ml培养细胞总蛋白提取试剂(Mammalian Protein Extraction Reagent,T-PER^TM)预冷，随后添加一锭蛋白酶抑制剂混合物(Complete mini protease inhibitor cocktail)混合均匀。置于-80 ℃贮存。 

(5)细胞培养液(cell culture)：将10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、20ml麸酰胺酸(glutamine)、20ml抗生素、3g碳酸氢钠(NaHCO₃)与最低必需培养基（Minimum Essential Medium，MEM）粉末混合添加去离子水至2公升，调整pH值至7.2。 

(6)细胞冷冻保存液(cell Cryopreservation medium)：10%胎牛血清(FBS)、7%二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和1x最低必需培养基(MEM medium) 

(7)胰酶细胞消化液：0.25%胰蛋白酶(Trypsin)与0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates,EDTA)混合 

(8)平衡缓冲液(Hank′s balanced salt solution,HBSS)：氯化钠(NaCl)8克、氯化钾(KCl)0.4克、硫酸镁(MgSO₄ 7H₂O)0.1克、氯化镁(MgCl 6H₂O)0.1克、无水氯化钙(CaCl₂)0.14克、葡萄糖1.0毫克、磷酸氢二钠(NaHPO₄)0.154克、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.06克，混合后添加0.4%酚红液5毫升、去离子水至1公升，有的不加酚红。 

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)的溶液配制 

(1)5X分离胶体缓冲液(Running buffer)： 

*使用前，以去离子水稀释成1倍running buffer。 

(2)转渍缓冲液(Transfer buffer)： 

(3)洗涤缓冲液(Washing buffer，t-TBS)： 

6N的HCl  调整酸碱度pH＝7.6。 

(4)5X检品溶液(Sample buffer)： 

泡制成5倍浓缩液，储存于室温。 

(5)阻隔缓冲液(Blocking buffer)： 

洗涤缓冲液                    100ml 

脱脂奶粉                      5.0g 

SDS-PAGE胶片的配制(Laemmli buffer system) 

(1)7.5％分离胶体(Separating gel)溶液的制备： 

均匀混合总体积为10mL 

(2)8.5％分离胶体(Separating gel)溶液的制备： 

均匀混合总体积为10mL 

(3)12％分离胶体(Separating gel)溶液的制备： 

均匀混合总体积为10mL 

(4)14％分离胶体(Separating gel)溶液的制备： 

均匀混合总体积为10mL 

混合均匀后，倒入MINI-PTOTEAM II装置内，并以去离子水压胶，静置约40～50分钟待其成型。依所需探讨的蛋白质分子量，选择胶片： 蛋白质分子量低者，适用高浓度胶片，反的亦然。 

(5)4％积层胶(Stacking gel)溶液的制备： 

均匀混合总体积为5mL 

倾出分离胶体上层的水层，加入均匀混合的上胶溶液，随即摆上样本齿模(Comb)，于室温静置待凝。若液面下降，须随时补充胶体溶液。 

实验仪器： 

(1)酸碱测定仪(pH meter/SP-701)：SUNTEX，Taiwan 

(2)酵素免疫分析仪(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay reader/MRX)：DYNEX Technologies，Germany 

(3)迷你蛋白电泳槽( 3Cell)：Bio-RadLaboratories Inc.，U.S.A. 

(4)迷你蛋白转印槽(Mini Electrophoretic Transfer Cell)Bio-Rad Laboratories Inc.，U.S.A. 

(5)电源供应器(Power supply/POWER PAC HC)： 

Bio-Rad Laboratories Inc.，U.S.A. 

(6)冷冻离心机：Kubota 8800，Japan 

(7)微量离心机：Eppendorf 5415C，Taiwan 

(8)自动冲片机及暗房工程：M43 716-7957，Kodak，U.S.A 

(9)荧光亮度计(spectroflurophotometer：Shimadzu，RF-5301PC，Japan) 

(10)计算机接口显微镜(computer-interfaced light microscope 

(Eclipse TE2000-S microscope,Nikon,Tokyo,Japan) 

实验方法 

C57BL/6J小鼠实验 

A.)DPA-1及Simvastatin影响血脂异常小鼠的血清生化值实验 

a.血脂异常的动物模式： 

将5周大的雄性C57BL/6J小鼠36只随机分成6组，分别如下。每只老鼠每3天记录1次饲料摄取量和体重。 

1.喂食标准饲料(standard diet,STD)组8周 

2.喂食高脂肪饲料(high-fat diet,HFD)组8周以引起血脂异常:其组成为60cal%脂肪(fat),21.3cal%碳水化合物(carbohydrates)以及18.7cal%蛋白质(protein) 

3.给予高脂肪饲料8周同时经口给予(p.o.)1mg/kgDPA-1 

4.给予高脂肪饲料8周同时经口给予2.5mg/kgDPA-1 

5.给予高脂肪饲料8周同时经口给予5mg/kgDPA-1 

6.给予高脂肪饲料8周同时经口给予5mg/kg Simvastatin b.)摘取老鼠组织和心脏血液： 

各组C57BL/6J小鼠饲养8周后，经氨基钾酸酯(urethane)麻醉后，以食指或中指趾腹轻压小鼠胸部感受其心跳确定其位置后，将1c.c.针筒26G的针头插入心脏，抽取心脏血液(过程应避免溶血)，立即以3000rpm离心15分钟将血清与血浆分离，在-80℃下保存其血清，以便分别进行血清总胆固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)生化值的测定。上述生化值检测使用Hitachi Clinical Analyzer 7070(Hitachi High-Technologies Co.Tokyo,Japan)与commercialkit(Sigma-Aldrich,StLouis,MO,USA).均委托尚捷医事检验所负责测定。 

将抽取心脏血后，立即取出老鼠的左叶肝脏，收藏至-80℃冰箱(待进行蛋白质印迹法的实验)。 

B.)小鼠的抑制肥胖实验 

将10周大的雄性C57BL/6J老鼠，均充分地供应50g饲料，调控室温为25℃，光暗周期为12-h，高脂肪饲料(HFD)与水随意食用。 

一、蛋白质印迹法(Western Blotting)探讨DPA-1及Simvastatin影响血脂异常小鼠肝脏组织的Rho kinase、PPARγ、HMGR、ABCA1蛋白表现： 

1.组织处理: 

取出上述冷藏于-80℃冰箱的左叶肝脏，浸泡在组织裂解液(Tissue lysis buffer)中，置于冰上以小剪剪碎，再以超音波均质机于冰上将组织均质化，并离心(15000rpm，30min，4℃)后，取上清液。 

2.蛋白质含量测定: 

以蛋白质测定浓缩剂(Bio-Rad染剂)测定蛋白质含量。Bio-Rad染剂为含有考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue G-250)的酸溶液，当该染剂和蛋白质结合形成复合体(Complex)，其光谱的最大吸收波长由456nm转移至595nm；依此特性可直接经由酵素免疫分析仪(ELISA reader)分别测定标准液的标准曲线，对照由波长595nm下检品的测定吸光值，即可知检品溶液所含的蛋白质量。 

标准液配置-以浓度0.1mg/ml胎牛血清(Bovine serum albumin，BSA)做为蛋白质含量标准，并配置成各种已知蛋白质含量的标准液(蛋白质含量为0、2、4、8、12、16、20和30μg/ml)。 

蛋白质萃取液的浓度测定方式-取237μl去离子水加上3μl细胞萃取液，分别添加60μl的蛋白质测定浓缩剂呈色后。以酵素免疫分 析仪测定波长595nm下的吸光值，并对照标准曲线以推算蛋白质萃取液的浓度。 

3.蛋白质电泳分离： 

定量分装、稀释蛋白质萃取液后，加入四分之一量的检品溶液(sample buffer)，并于沸腾的水中加热5分钟。然后依序将检品添加至10%硫酸十二酯钠-聚合丙酰胺凝胶(SDS-PAGE)上的各槽(well)，并同时以未染色蛋白质分子量标准品(prestained protein molecular weight standards)比对分子量位置。添加分离胶体缓冲液(running buffer)于电泳槽内，以固定80伏特的电压进行30分钟电泳，随后以180伏特电压继续进行电泳至SDS-PAGE的染剂跑出SDS-PAGE后，则中止电源。 

4.免疫印迹法(Immunoblotting)： 

完成电泳解析后，小心取下胶片置于转渍缓冲液(Transfer buffer)内平衡。另外裁下与胶片相同尺寸的3mm滤纸(filter paper)，将其浸润在转渍缓冲液中平衡。将事先裁好与胶片同样尺寸的聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride,PVDF)膜，依序以甲醇活化30秒、去离子水浸洗2分钟，最后浸润在转渍缓冲液中平衡15分钟以上。待胶片、滤纸、聚偏氟乙烯膜完成平衡后，在饱和吸湿的石墨负极板上，依序先垫上两张滤纸，铺上胶片，覆盖一张PVDF膜，滴少许转渍缓冲液至PVDF膜，盖上两张滤纸，并注意勿留下气泡，最后盖上饱和吸湿的石墨正极板，形成“三明治(sandwich)”夹层状。利用湿式转渍系统(Wet blotter system)进行转渍过程，将三明治夹层置于转渍缓冲液，以固定电流转渍1.5小时。其中固定电流的数值依照胶片面积×0.8毫安(mA/cm²)计算值设定。胶片的蛋白质完全转渍至PVDF膜后，取下PVDF膜浸润于适量的阻隔缓冲液(Blocking buffer)，放置于水平回转摇荡器上，于室温下缓慢震摇2小时。随后以洗涤缓冲液(T-TBS)连续洗涤6次每次5分钟，接着于4℃下将稀释完成的初级抗体(primary antibody solution)均匀覆盖在PVDF膜上过夜，进行作用。隔日以洗涤缓冲液持续涤6次每次5 分钟后，将带有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的二级抗体(Secondary antibody solution)稀释至合适浓度，均匀倾倒于PVDF膜上震荡反应1小时。反应完成后再以洗涤缓冲液持续涤7次每次5分钟。最后加入检测缓冲液(Detection buffer,ECL)作用2分钟，待略干后以底片压片、洗片即完成。将结果以密度计及分析软件进行分析及定量。 

二、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)活性分析实验 

1.原理： 

羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase,HMGR)的反应式：HMG-CoA+2NADPH+2H⁺→mevalonate+2NADP⁺+CoA-SH利用酵素免疫分析仪测定波长340nm，减少吸收波长340nm的量就是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的反应量，NADPH的反应量越多代表HMGR活性越高，给予具有抑制HMGR活性作用的药物，减少NADPH所参与反应的量则越低，由此可比较药物间抑制HMGR活性作用的高低。 

2.步骤： 

a.先将酵素免疫分析仪设定在37°C和波长340nm，依据表五在96槽反应盘添加适当的反应试剂。 

b.每个槽孔都添加适当试剂后，立即放入酵素免疫分析仪读取吸光值，第一次读取时必须震摇10秒钟，然后每30秒读取一次，达30分钟为止。 

c.读取的数值带入动力学公式： 

TV=反应盘的反应总容量(Total volume of the reaction in ml,0.2ml for plates) 

V=参与分析的酵素容量(volume of enzyme used in the assay,ml) 

LP=比色杯管径(Light path in cm,0.55 for plates) 

Units/mg-protein= 

(ΔA340/min_sample ΔA340/min_blank)*TV/12.44*V*0.6*LP 

单位为：μmol/min/mg-protein。 

表五HMG-CoA reductase活性分析实验各槽孔添加的试剂 

(注)1.缓冲液(buffer)为1×Assay buffer 

2.药物为选用Simvastatin或DPA-1 

三、细胞培养 

1.HepG2细胞初代培养： 

首先将细胞迅速移至37℃水浴箱内使其在1分钟内迅速解冻，随即将细胞冷冻保存液(cell Cryopreservation medium)吸至无菌离心管以1,000rpm离心5分钟，移除上清液，添加细胞培养液(cell culture)将离心管底部细胞打散并移至10公分培养皿，静置于37℃恒温及饱和水蒸气(5%二氧化碳，95%空气)的培养箱内，让细胞贴附。 

2.HepG2继代培养： 

将培养数日的培养液吸除后，以新鲜培养液冲下细胞，即可用椎蓝(trypan blue)染色计数细胞并分盘培养。 

3.冷冻细胞保存： 

10公分培养皿长满单层细胞，以1ml胰酶细胞消化液作用后，轻拍使细胞脱落，添加10ml培养液并将细胞打散，置于15ml离心管中离心1,000rpm 5分钟，倾去上清液，添加细胞冷冻保存液1ml 并打散细胞，分装于冷冻保存管中(1ml/vial)，逐渐降低温度，依序为-20℃，30分钟；-80℃，24小时；最后储存于-196℃液态氮槽。 

四、比较各组细胞中ROCK Ⅱ以及RhoA、ABCA1、PPAR-γ、LXR-α、APOA-1蛋白质的表现及差异 

1.HepG2细胞前处理： 

将药物依序加入细胞进行作用后，将细胞刮下并加入磷酸盐缓冲液(PBS)回溶。以1,500rpm、4℃离心5分钟。抽掉上清液，加入适当量的细胞裂解液(Cell Lysis Buffer)剧烈振摇后以13,000rpm、4℃离心15分钟。取出上清液进行试验。 

2.细胞质蛋白质的萃取： 

依各组条件进行反应后取出培养皿，以冷藏的平衡缓冲液(HBSS)洗涤2次，再将多余的HBSS甩干置于冰上。添加细胞裂解液和碘化丙啶(propidium iodide,PI)作用15分钟后将细胞刮下，最后在4℃下13,000rpm离心30分钟并取出上清液，此上清液为细胞质层的蛋白质淬取液。 

3.细胞膜蛋白质的萃取： 

依各组条件进行反应后取出培养皿，以冷藏的平衡缓冲液(HBSS)洗涤2次，再将多余的HBSS甩干置于冰上。添加细胞裂解液和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)作用15分钟后将细胞刮下，最后在4℃下13,000rpm离心30分钟并取出上清液，此上清液为细胞质层的蛋白质淬取液。 

加入1%Triton和PI，以超音波震荡均质化后，在4℃下15000rpm离心60分钟。上清液即为细胞膜蛋白质萃取液。后续进行蛋白质含量的测定，以蛋白质印迹法比较各组细胞蛋白质的表现及差异。 

五、统计分析(Statistical analysis) 

所有实验数据结果表示，都由平均值加减标准误(Mean±s.e.m.)及百分率(%)表示。统计的间的差异，在非配对及配对样本中分别采用非相依性的Student’s t-test或相依性的t-test。此 外，只有一组对照组比较多组实验组时，则采用repeated-measure ANOVA。当利用ANOVA统计有差异时，则使用Dunnett’s test作为事后检定。当p值小于0.05时，表示具有统计学上显著性差异。 

实施例1制备DPA-1盐酸盐(7-[2-[4-(2-chlorobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl xanthine HCl) 

取DPA-1(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与1N盐酸(60mL)的溶液，于50°C下反应20分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1盐酸盐(6.4g)。 

实施例2制备DPA-3盐酸盐(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl xanthine HCl) 

取DPA-1(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与1N盐酸(60mL)的溶液，于50°C下反应20分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-3盐酸盐(6.6g)。 

实施例3制备DPA-2-聚丙烯酸复合物 

取DPA-2(8g)溶于混合着乙醇(10mL)与聚丙烯酸(2.5g)的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-烟碱酸复合物(7.4g)。 

实施例4制备DPA-3-聚海藻酸钠复合物 

取12.5g聚海藻酸钠(APA)溶于40ml氢氧化钠(5%)的水溶液，加入8.3g的DPA-3HCl置于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-3-聚海藻酸钠复合物(31.4g)。 

实施例5制备DPA-1-聚麸胺酸复合物 

取DPA-1(7.9g)溶于混合着乙醇(10mL)与3.8g聚麸胺酸 的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-聚麸胺酸复合物(10.4g)。 

实施例6制备DPA-1-羧甲基纤维素DPAs复合化合物复合物 

取20g的羧甲基纤维素钠(sodium CMC)溶于40ml氢氧化钠(5%)的水溶液，加入16g的DPA-1HCl置于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-羧甲基纤维素DPAs复合化合物复合物(31.4g)。 

实施例7制备DPA-2-玻尿酸复合物 

取DPA-2(8g)溶于混合着乙醇(10mL)与玻尿酸(2.5g)的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-2-玻尿酸复合物(9.4g)。 

实施例8制备DPA-4-硫酸乙酰肝素复合物 

取DPA-4(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与硫酸乙酰肝素(8.5g)的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-4-硫酸乙酰肝素复合物(9.2g)。 

实施例9制备DPA-1-硫酸葡聚醣复合物 

取DPA-1(8g)溶于混合着乙醇(10mL)与硫酸葡聚醣(3.5g)的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-硫酸葡聚醣复合物(10.6g)。 

实施例10制备DPA-4-聚麸胺酸复合物 

取DPA-4(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与聚麸胺酸(3.8g)的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-4-聚麸胺酸复合物(9.2g)。 

实施例11制备DPA-1-聚麸胺酸复合物 

取DPA-1(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与聚麸胺酸(3.8g)的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-聚麸胺酸复合物(9.2g)。 

实施例12制备DPA-1-聚乳酸复合物 

取DPA-1(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与聚乳酸(3.2g)的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-聚麸胺酸复合物(9.4g)。 

实施例13制备DPA-1-聚羟基乙酸复合物 

取DPA-1(8.3g)溶于混合着乙醇(10mL)与聚羟基乙酸(3.5g)的溶液，于50°C下反应10分钟，室温下添加乙醇(20mL)放置过夜进行结晶，过滤获得DPA-1-聚麸胺酸复合物(9.6g)。 

实施例14制备锭剂的组合物 

分别依量秤取下列各成分，混和后充填于打锭机，制备成锭剂 

DPA-1-玻尿酸                        140mg 

乳糖                                qs 

玉米粉                              qs 

实施例15制备锭剂的组合物 

分别依量秤取下列各成分，混和后充填于打锭机，制备成锭剂 

DPA-1-羧甲基纤维素                  160mg 

乳糖                                qs 

玉米粉                              qs 

1.一种改善高脂血的DPAs复合化合物化合物，如式(II)所示结构的四级铵，其中 

式(II) 

R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组： 

氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基； 

碳数1-5烷氧基的取代基； 

RX其选自以下所组成含羧酸基团群组中的一种： 

Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合物或聚麸胺酸基团衍生物药物；以及 

^-RX可为上述基团带负电的阴离子。 

2.如实施例1的DPAs复合化合物化合物，其中含羧酸基团的聚麸胺酸基团衍生物选自海藻酸钠(alginate sodium)、聚麸胺酸(γ-PGA)、聚麸胺酸钠(γ-PGA sodium)或是聚海藻酸钠(APA)。 

3.如实施例1DPAs复合化合物化合物，其中含羧酸基团的Statin类药物选自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、罗瓦斯达汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。 

4.如实施例1的DPAs复合化合物化合物，其中高分子聚合物选自玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、优特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(Polylactic acid,PLA)、聚羟基乙酸(Polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸钠(Poly(lactic acid sodium),PLA sodium)、聚羟基乙酸 钠(Poly(glycolic acid sodium),PGA sodium)。 

5.一种改善高脂血DPAs复合化合物化合物，其选自以下的四级铵盐类： 

DPAs类与Statin类药物所合成的四级铵盐类; 

DPAs类化合物与羧甲基纤维素钠(sodium CMC)所合成的四级铵盐类; 

DPAs类化合物与高分子聚合物所合成的四级铵盐类;以及 

DPAs类与含羧酸基团的聚麸胺酸基团衍生物所合成的四级铵盐类。 

6.如实施例5的DPAs复合化合物化合物，其中DPAs类化合物选自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,DPA-1)； 

7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-2)； 

7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-3);以及 

7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-4)等DPAs类化合物。 

7.如实施例5的DPAs复合化合物化合物，其中含羧酸基团的聚麸胺酸基团衍生物选自海藻酸钠(alginate sodium)、聚麸胺酸(γ-PGA)、聚麸胺酸钠(γ-PGA sodium)或是聚海藻酸钠(APA)。 

8.如实施例5的DPAs复合化合物化合物，其中含羧酸基团的Statin类药物选自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、罗瓦斯达汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀 (Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。 

9..一种改善高脂血医药组合物，包含: 

药学上可接受的载体;以及 

一有效量如式(II)所示四级铵结构的主成分，其中 

式(II) 

R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组： 

氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基； 

碳数1-5烷氧基的取代基； 

RX其选自以下所组成含羧酸基团群组中的一种： 

Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合药物或聚麸胺酸基团衍生物药物；以及 

^-RX可为上述基团带负电的阴离子。 

10.一种改善高脂血医药组合物，包含: 

药学上可接受的载体;以及 

选自以下的四级铵盐类： 

DPAs类与Statin类药物所合成的四级铵盐类; 

DPAs类化合物与羧甲基纤维素钠(sodium CMC)所合成的四级铵盐类; 

DPAs类化合物与高分子聚合物所合成的四级铵盐类;以及 

DPAs类与含羧酸基团的聚麸胺酸基团衍生物所合成的四级铵盐类。 

11.一种改善体重失衡的DPAs复合化合物化合物，如式(II)所 示结构的四级铵，其中 

式(II) 

R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组： 

氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基； 

碳数1-5烷氧基的取代基； 

RX其选自以下所组成含羧酸基团群组中的一种： 

Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合药物或聚麸胺酸基团衍生物药物；以及 

^-RX可为上述基团带负电的阴离子。 

12.一种改善体重失衡DPAs复合化合物化合物，其选自以下的四级铵盐类： 

DPAs类与Statin类药物所合成的四级铵盐类; 

DPAs类化合物与羧甲基纤维素钠(sodium CMC)所合成的四级铵盐类; 

DPAs类化合物与高分子聚合物所合成的四级铵盐类;以及 

DPAs类与含羧酸基团的聚麸胺酸基团衍生物所合成的四级铵盐类。 

13.一种改善体重失衡医药组合物，包含: 

药学上可接受的载体;以及 

一有效量如式(II)所示四级铵结构的主成分，其中 

式(II) 

R₂与R₄可分别选自以下所组成的群组： 

氢基、卤素、胺基、硝基的取代基； 

碳数1-5烷基的取代基； 

碳数1-5烷氧基的取代基； 

RX其选自以下所组成含羧酸基团群组中的一种： 

羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合药物或聚麸胺酸基团衍生物药物；以及 

^-RX可为上述基团带负电的阴离子。 

14.一种改善体重失衡医药组合物，包含: 

药学上可接受的载体;以及 

选自以下的四级铵盐类： 

DPAs类与Statin类药物所合成的四级铵盐类; 

DPAs类化合物与羧甲基纤维素钠(sodium CMC)所合成的四级铵盐类; 

DPAs类化合物与高分子聚合物所合成的四级铵盐类;以及 

DPAs类与含羧酸基团的聚麸胺酸基团衍生物所合成的四级铵盐类。 

15如上述实施例的DPAs复合化合物化合物，其中DPAs类化合物选自 

7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,DPA-1)； 

7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-2)； 

7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-3);以及 

7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-4)等DPAs类化合物。 

16.如上述实施例的DPAs复合化合物化合物，其中含羧酸基团的聚麸胺酸基团衍生物选自海藻酸钠(alginate sodium)、聚麸胺酸(γ-PGA)、聚麸胺酸钠(γ-PGA sodium)或是聚海藻酸钠(APA)。 

17.如上述实施例的DPAs复合化合物化合物，其中含羧酸基团的Statin类药物选自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、罗瓦斯达汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。 

18.如上述实施例的医药组合物，其中DPAs类化合物选自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤 

(7-2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,DPA-1)； 

7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-2)； 

7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-3);以及 

7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基〕乙基〕-1,3-二甲基黄嘌呤 (7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,DPA-4)等DPAs类化合物。 

19.如上述实施例的医药组合物，其中高分子聚合物选自玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、优特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或称为polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚羟基乙酸钠(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)。 

20.如上述实施例的医药组合物，其中含羧酸基团的Statin类药物选自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、罗瓦斯达汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。 

21.如上述实施例的医药组合物，其中高分子聚合物选自玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、优特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或称为polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚羟基乙酸钠(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)。 

22.一种改善肥胖的组合物，包含: 

选自DPAs类化合物与DPAs复合化合物的主成分。 

23.如权利要求22所述的组合物，其中DPAs类化合物为DPA-1、DPA-2、DPA-3及DPA-4化合物中的一种。 

24.如权利要求22所述的组合物，其中DPAs复合化合物为DPAs类化合物与选自以下含有羧酸基团结构化合物所合成的DPAs复合化 合物： 

Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合物、聚麸胺酸基团衍生物及其混合物。 

25.如权利要求24所述的医药组合物，其中高分子聚合物选自玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、优特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或称为polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸钠(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚羟基乙酸钠(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)及其混合物。 

26.如权利要求24所述的组合物，其中聚麸胺酸基团衍生物选自海藻酸钠(alginate sodium)、聚麸胺酸(γ-PGA)、聚麸胺酸钠(γ-PGA sodium)或聚海藻酸钠(APA)及其混合物。 

27.如权利要求24所述的组合物，其中Statin类药物选自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、罗瓦斯达汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、辛伐他汀(Simvastatin)及其混合物。 

28.如权利要求22所述的医药组合物，其肥胖与以下的状态有关： 

血中脂肪含量、动脉粥样硬化、脂肪组织含量、新陈代谢恒定(metabolic homeostasis)的维护、食物摄取量或混合上述状态的相关型式。 

29.一种改善肥胖的方法，包含: 

选自DPAs类化合物与DPAs复合化合物的主成分所形成的组合物;以及给予有效量的组合物于动物。 

30.如权利要求29所述的方法，其中动物为人类、鸡、鸭、鹅、猪、牛、鹿、马、羊或鱼类、鸽子。 

31.如权利要求29所述的方法，其中DPAs类化合物为DPA-1、 DPA-2、DPA-3及DPA-4化合物中的一种； 

DPAs复合化合物为DPAs类化合物与选自以下含有羧酸基团结构化合物所合成的DPAs复合化合物：Statin类药物、羧甲基纤维素钠(sodium CMC)、高分子聚合物、聚麸胺酸基团衍生物及其混合物。 

参考文献 

1.Robidoux J,Martin TL,Collins S.Beta-adrenergic receptors and regulation of energy expenditure:a family affair.Annu Rev Pharmacol Toxicol 2004;44:297-323. 

2.Andrea Armani,Vincenzo Marzolla,Giuseppe M.C.Rosanol,Andrea Fabbri and Massimiliano Caprio.Phosphodiesterase type 5(PDE5)in the adipocyte:a novel player in fat metabolism?Trends in Endocrinology and Metabolism.2011;22,404-411. 

3.Koh EH,Kim M,Ranjan KC,Kim HS,Park HS,Oh KS,Park IS,Lee WJ,Kim MS,Park JY,Youn JH,Lee KU.eNOS plays a major role in adiponectin synthesis in adipocytes.Am J Physiol Endocrinol Metab.2010;298(4):E846-53. 

【附图说明】

图1 HMGR蛋白表现量 

给予0.001-10μM剂量的DPA-1，以及给予simvastatin(10μM)观察羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的蛋白表现量，*P＜0.05与对照组(CTL)相比。 

图2 HePG2细胞株的HMGR蛋白表现量比率 

图2(A)分别给予10^-9-10^-5M剂量的DPA-1，*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图2(B)分别给予10^-9-10^-5M剂量的给予simvastatin，*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图3高脂肪饲料喂食的HMGR蛋白表现量比率 

高脂肪饲料(HFD)喂食的老鼠，依照体重给予1、2.5、5mg/kg剂量的DPA-1或5mg/kg剂量的simvastatin，^##P＜0.01与标准饲料(STD)相比，*P＜0.05与未给予DPA-1相比，**P＜0.01与未给予DPA-1相比。 

图4影响HMGR的蛋白表现量比率 

图4(A)添加10-100μM mevalonate观察HMGR表现量的减少比率，*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图4(B)添加100μM mevalonate，再给予10^-5M药物simvastatin或DPA-1观察HMGR的蛋白表现量比率，^####P＜0.01与空白试剂相比，**P＜0.01与未添加mevalonate相比。 

图5高脂肪饲料喂食老鼠的蛋白表现量比率 

图5(A)高脂肪饲料喂食的老鼠分别给予1、2.5、5mg/kg剂量DPA-1或5mg/kg的simvastatin，影响过氧化物酶体增殖物启动受体-γ(PPAR-γ)的蛋白表现量比率。 

图5(B)分别给予1、2.5、5mg/kg剂量DPA-1或5mg/kg的simvastatin，影响腺苷三磷酸结合盒转运子A1(ABCA1)的表现量比率。 

图5(C)分别给予1、2.5、5mg/kg剂量DPA-1或5mg/kg的simvastatin，影响Rho关联蛋白激酶2(ROCKII)的表现量比率，*P＜0.05与未给予DPA-1相比，**P＜0.01与未给予DPA-1相比。 

图6 HePG2细胞的PPAR-γ表现量 

图6(A)给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响PPAR-γ的表现量比率。 

图6(B)给予10^-9-10^-5M剂量simvastatin影响PPAR-γ的表现量比率。^##P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图7 HePG2细胞的腺苷三磷酸结合盒转运子A1表现量 

图7(A)给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响ABCA1的表现量比率。 

图7(B)给予10^-9-10^-5M剂量simvastatin影响ABCA1的表现量比率。^##P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图8 HePG2细胞的载脂蛋白A－1表现量 

图8(A)给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响APOA-1的表现量比率。 

图8(B)给予10^-9-10^-5M剂量simvastatin影响APOA-1的表现量比率。^##P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图9 DPA-1影响肝细胞X受体α基因(LXR-α)的表现量给予0.001-10μM剂量DPA-1影响LXR-α的表现量比率。*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图10细胞膜的RhoA活性 

给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响RhoA的表现量比率，*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图11高脂肪饲料老鼠的ROCKII表现 

分别给予1、2.5、5mg/kg剂量DPA-1或5mg/kg剂量simvastatin影响Rho关联蛋白激酶2(ROCKII)的表现量比率，*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图12 HepG2细胞的ROCKII表现 

图12(A)给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响ROCKII的表现量比率。 

图12(B)给予10^-9-10^-5M剂量simvastatin影响ROCKII的表现量比率，*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图13影响HepG2细胞蛋白的表现 

图13(A)分别给予DPA-1(10^-5M)、Simvastatin(10^-5M)、C3胞外酶(10mg/kg)与Y27632(10^-5M)影响ROCK II的表现比率。 

图13(B)分别给予DPA-1(10^-5M)、Simvastatin(10^-5M)、C3胞外酶(10mg/kg)与Y27632(10^-5M)影响PPAR-γ的表现比率，^#P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图13(C)分别给予DPA-1(10^-5M)、Simvastatin(10^-5M)、C3胞外酶(10mg/kg)与Y27632(10^-5M)影响ABCA1的表现比率，^#P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图14 RhoA/ROCK II蛋白的表现 

图14(A)添加10μM异戊二烯焦磷酸(FPP)处理后再给予 10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响ROCK II蛋白的表现比率。 

图14(B)添加10μM四异戊二烯焦磷酸(GGPP)处理后再给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响ROCK II蛋白的表现比率，^#P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图14(C)添加10μM  四异戊二烯焦磷酸处理后再给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响细胞膜ROCK II蛋白的表现比率，^#P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，^##P＜0.01、**P＜0.01与对照组相比。 

图15 GGPP处理后simvastatin影响蛋白的表现 

添加10μM四异戊二烯焦磷酸处理后再给予10^-9-10^-5M剂量的simvastatin影响PPAR-γ蛋白的表现比率，^#P＜0.05与对照组相比。 

图16 HepG2细胞经FPP处理后蛋白的表现 

图16(A)添加10μM焦磷酸处理后再给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响PPAR-γ蛋白的表现比率。 

图16(B)添加10μM焦磷酸处理后再给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响ABCA1蛋白的表现比率，^#P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，^##P＜0.01、**P＜0.01与对照组相比。 

图17 HepG2细胞经GGPP处理后蛋白的表现 

图17(A)添加10μM四异戊二烯焦磷酸(GGPP)处理后再给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响PPAR-γ蛋白的表现比率。 

图17(B)添加10μM四异戊二烯焦磷酸处理后再给予10^-9-10^-5M剂量DPA-1影响ABCA1蛋白的表现比率，^#P＜0.05、*P＜0.05与对照组相比，**P＜0.01与对照组相比。 

图18 Rp-8-pCPT-cGMPs影响ROCK II的表现 

于HepG2细胞单独添加10μM的cGMP抑制剂Rp-8-pCPT-cGMPs，或以相同浓度的Rp-8-pCPT-cGMPs与DPA-1同时添加，影响ROCK II蛋白的表现比率，^##P＜0.01、**P＜0.01与对照组相比。