一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法

摘要

本发明提供了一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，包括：（1）黄姑鱼或条石鲷精子的遗传灭活；（2）黄姑鱼未受精卵与灭活精子的授精；（3）雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定；（4）染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选。本发明首次建立了采用黄姑鱼精子和条石鲷精子诱导黄姑鱼卵子进行雌核发育并获得雌核发育二倍体鱼苗的方法，筛选到适合黄姑鱼卵雌核发育的冷休克起始时间、冷休克温度和持续时间。本发明具有操作方便，高效、实用、可靠的特点；通过本发明诱导获得的黄姑鱼后代只含有雌性亲本的遗传物质，可加速优良基因纯化、使优良的遗传性状得以迅速固定，在黄姑鱼育种和性别控制研究方面具有重要的应用价值和推广应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程培育领域，涉及海水鱼类雌核发育方法，尤其涉及一 种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法。

背景技术

利用细胞工程技术培育水产优良品种具有重要的理论意义和广阔的应用 前景。雌核发育作为一种细胞工程技术，是进行鱼类品种改良的重要途径。在 鱼类养殖中采用雌核发育技术的主要目的就是建立纯系和生产全雌鱼。通过不 同纯系间杂交技术，把一些隐性基因几乎全部去掉，从杂交后代中筛选培育出 性状优良的新品种（系）。人工诱导雌核发育已经广泛应用于国内外多种鱼类遗 传育种的研究与实践中。例如：日本利用该技术培育出全雌虹鳟和牙鲆等供养 殖利用，美国则利用该技术培育出草鱼优良品系。我国自20世纪70年代中期 开始展开雌核发育研究，在鲤、鲫、草、鲢等人工诱导雌核发育取得了一定的 成就。在海水鱼类中，我国利用雌核发育技术已经在牙鲆、大黄鱼等重要经济 鱼类培育出新品种，在养殖过程中显示了明显的优势。

黄姑鱼是我国是重要的海水经济鱼类。近年来，随着黄姑鱼繁育技术的日 趋成熟，其养殖规模也逐渐扩大，成为继大黄鱼后我国网箱养殖的重要品种。 借鉴其他海、淡水鱼养殖中良种培育的经验，对黄姑鱼进行品种改良是保证其 养殖业健康持续发展的重要因素。采用传统的育种方式（定向选择+近交）基 因纯合速度慢，育种周期长，不符合当前养殖业发展的迫切需要。利用雌核发 育技术可以快速排除与减少群体中存在的不良及有害基因，增加优良基因与基 因型的频率，是对黄姑鱼进行遗传改良的有效方法。另一方面，黄姑鱼的雌雄 两性个体的生长存在着显著的差异，雌鱼生长显著快于雄鱼。因此有必要开展 可加速育种进程的人工雌核发育技术研究，而关于黄姑鱼人工雌核发育研究， 国内外尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，本发明的目的是建 立人工诱导黄姑鱼雌核发育诱导方法，培育雌核发育二倍体苗种。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法，它包括以下步骤：

(1)黄姑鱼或条石鲷精子的遗传灭活

黄姑鱼精子的遗传物质灭活：将黄姑鱼精液用精子稀释液稀释25～75倍， 置于18～72mJ/mm²紫外线强度照射；

条石鲷精子的遗传物质灭活：将条石鲷精液用精子稀释液稀释20～50倍， 置于12～54mJ/mm²紫外线强度照射；

(2)未受精卵与灭活精子的授精

将经紫外照射的灭活精液5～30mL与成熟的黄姑鱼卵子20～200mL混合， 轻轻摇动混匀，加入5～10mL海水后继续混匀，再加入20～200mL海水置于 22～23℃室温下放置1～4min，用于染色体加倍处理；

(3)雌核发育鱼卵染色体加倍

在授精后1～4min，将卵浸入0～4.5℃的海水浴中进行处理5～20min，取 出处理后的卵在12～15℃海水过渡10～15min，然后放入22～23℃海水中准备 进行孵化；

(4)染色体加倍冷休克诱导处理

在休克温度0～4.5℃、冷休克时间5～20min条件下诱导雌核发育二倍体。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中精子稀释液配方为NaCl 6g/L，KCl 0.4g/L，CaCl₂0.2g/L，pH值7.0。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中黄姑鱼精液稀释40～50倍， 黄姑鱼精子紫外灭活的最适剂量为42mJ/mm²。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中条石鲷精液稀释30～40倍， 条石鲷精子紫外灭活的最适剂量为30mJ/mm²。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(1)中黄姑鱼精子和条石鲷精子遗 传物质灭活所用稀释液的厚度为0.1～0.3cm。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(3)中授精后2min染色体开始加 倍的诱导率最高。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(4)中在2.5～3.5℃下冷休克处理 8min的雌核发育诱导率最高。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明利用异源精子和同源精子诱导黄姑鱼雌核发育，首次建立了黄 姑鱼人工雌核发育诱导方法，获得了雌核发育二倍体苗种，所述诱导方法操作 方便，高效、实用、可靠，获得了较高的雌核发育诱导率。

2、通过本发明诱导获得的黄姑鱼后代只含有雌性亲本的遗传物质，可加速 优良基因纯化，使优良的遗传性状得以迅速固定，因此，本发明可以应用于黄 姑鱼的快速育种，在黄姑鱼遗传分析和性别控制研究方面也具有重大的应用价 值和推广应用前景。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得 更加清楚。

附图说明

图1为本发明实施例获得的黄姑鱼初孵仔鱼图，其中图1a为雌核发育二 倍体初孵仔鱼图，图1b为单倍体初孵仔鱼图。

图2为本发明实施例获得的黄姑鱼初孵仔鱼的细胞流仪检测图，其图2a 为正常二倍体初孵仔鱼的细胞流仪检测图，图2b为黄姑鱼单倍体初孵仔鱼的细 胞流仪检测图，图2c为黄姑鱼雌核发育二倍体初孵仔鱼的细胞流仪检测图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明所述黄姑鱼雌核发育二倍体的诱导方法包括以下步骤：1、黄姑鱼 和条石鲷精子的遗传物质灭活；2、未受精卵与灭活精子的授精；3、确定染色 体加倍的起始时间；4、确定染色体冷休克温度及处理时间。

1、黄姑鱼和条石鲷精子的遗传物质灭活

利用浙江省海水增养殖重点实验室培育的黄姑鱼雌鱼和雄鱼（采集自舟山 海域）各10尾，条石鲷雄鱼（采集自舟山海域）5尾，经人工催产后采集精子 和卵子。经过实验表明，同源的黄姑鱼精子和异源的条石鲷精子均可诱导黄姑 鱼卵子进行雌核发育。

黄姑鱼精子的遗传灭活条件为：将黄姑鱼精液用预冷的精子稀释液（配方 为NaCl 6g/L，KCl 0.4g/L，CaCl₂0.2g/L，pH值7.0）稀释25～75倍，平铺于 培养皿中，调整稀释液厚度0.1～0.3cm，设置18、30、36、42、48、60、72、 84mJ/mm²等不同紫外线强度照射，然后与黄姑鱼卵混合。

条石鲷精子的遗传物质灭活条件为：将条石鲷精液用精子稀释液稀释20～ 50倍，平铺于培养皿中，调整稀释液厚度0.1～0.3cm，用12、18、24、30、36、 42、48、54、60mJ/mm²等不同紫外线强度照射，然后与黄姑鱼卵子混合。

人工授精后在22～23℃的海水中孵化，培育期间统计受精率、孵化率和 单倍体率。综合考虑受精率、孵化率和单倍体率的情况，表明黄姑鱼精液稀释 40～50倍，紫外灭活的最适剂量为42mJ/mm²(如表1所示)；条石鲷精液稀释 30～40倍，紫外灭活的最适剂量为30mJ/mm²(如表2所示)。

表1不同紫外照射剂量对受精率、孵化率和单倍体诱导率的影响（黄姑鱼，n=3）

表2不同紫外照射剂量对受精率、孵化率和单倍体诱导率的影响（条石鲷，n=3）

2、未受精卵与灭活精子的授精

将经紫外照射的灭活精液5～30mL与成熟的黄姑鱼卵子20～200mL混合， 轻轻摇动混匀，加入5～10mL海水后继续混匀，再加入20～200mL海水置于 22～23℃室温下放置1～4min，用于染色体加倍处理。

3、雌核发育鱼卵染色体加倍起始时间的确定

在授精后1min、2min、3min、4min，将卵倒入网袋中扎紧后浸入0～4.5℃ 的海水浴中进行处理，处理时间为5～20min，冷休克处理后的卵取出后首先经 12～15℃海水过渡10～15min，然后放入22～23℃海水中准备进行孵化；统计 受精率以及雌核发育二倍体孵化率：结果表明在授精后1～4min中均能诱导产 生雌核发育二倍体，授精后2min染色体开始加倍的诱导率最高(表3)。

表3不同染色体加倍起始时间对受精率和正常二倍体孵化率的影响

4、染色体加倍冷休克温度和持续时间的筛选

确定冷休克起始时间后，再进行冷休克温度和持续时间的确定。将与灭活 精液混合后的卵，放置于0℃、1.5℃、3℃、4.5℃海水中，在每个温度梯度下 分别处理5min、8min、10min、12min、15min、20min；最后统计受精率和雌 核发育二倍体孵化率；结果表明在休克温度0～4.5℃、休克时间5～20min条 件下都可以诱导雌核发育二倍体，其中在2.5～3.5℃下冷休克处理8min的雌核 发育诱导率最高（表4，表5）。

表4不同冷休克温度对受精率和正常二倍体孵化率的影响

表5不同冷休克诱导时间对受精率和正常二倍体孵化率的影响

5、黄姑鱼雌核发育二倍体鱼苗的鉴定

将照射后的黄姑鱼精子或条石鲷精子与黄姑鱼卵子受精，采用初孵仔鱼外 部形态和流式细胞仪检测DNA相对含量鉴定遗传物质的灭活效果和雌核发育 鱼苗。单倍体初孵仔鱼及雌核发育二倍体初孵仔鱼如图1所示，雌核发育二倍 体初孵仔鱼形态正常（图1a），单倍体初孵仔鱼表现出单倍体综合症（图1b）， 表明精子遗传物质灭活完全，雌核发育二倍体诱导成功。

用PARTEC Cell counter Analyser(CCA-Ⅱ)细胞计数仪分析检测DNA相 对含量，以正常二倍体黄姑鱼鱼苗对照组个体的DNA相对含量设为100，其在 200处有一个分裂峰（图2a），测定单倍体和雌核发育二倍体鱼苗的DNA相对 含量；如此测定的单倍体鱼苗的DNA相对含量在50处有一峰值，其在100处 有一分裂峰（图2b）；雌核发育二倍体鱼苗的DNA相对含量在100处有一峰值， 在200处有一分裂峰（图2c）。初孵仔鱼外部形态比较及流式细胞仪分析结果 表明精子遗传物质灭活完全，雌核发育二倍体诱导成功。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依 然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进 行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要 求保护的技术方案的精神和范围。