核苷酸还原酶亚单位M1基因表达荧光定量PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种检测核苷酸还原酶亚单位M1（RRM1）基因表达荧光定量PCR试剂盒。本发明所述的核苷酸还原酶亚单位M1基因表达荧光定量PCR检测试剂盒包括：荧光定量反应液预混液、荧光定量反应液、阳性对照样品。所述荧光定量反应液包括PCR引物一对及探针一条，该荧光探针是采用荧光标记的覆盖核苷酸还原酶亚单位M1基因检测位点的锁核苷酸探针，其5′端标记荧光报告基团，3′端标记荧光淬灭基团。所述阳性对照样品为包含所检测核苷酸还原酶亚单位M1基因检测位点的混合质粒基因组DNA。本发明适用于各种组织、细胞、血液中RRM1表达水平mRNA的定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种检测核苷酸还原酶亚单位M1（RRM1）基因表达荧光定量PCR试剂盒，适用于各种组织、细胞、血液中RRM1表达水平mRNA的定量检测。

背景技术

核苷酸还原酶亚单位M1(ribonuleotide reductase subunit M1,RRM1)是吉西他滨作用的靶点之一，吉西他滨为脱氧胞嘧啶核苷的类似物，属细胞周期特异性抗肿瘤药，主要作用于DNA合成期，即S期的细胞，在一定的条件下也可以阻止G期向S期的进展。吉西他滨为核苷酸还原酶抑制剂，使细胞内合成DNA所需的dCTP产生减少，抑制DNA合成。研究证实，RRM1的高水平表达与吉西他滨的耐药性相关。而且，晚期肿瘤患者高水平表达RRM1其预后较差。目前对RRM1基因表达与肺癌特别是非小细胞肺癌的研究比较多，RRM1基因表达情况的研究对肿瘤的临床个体化治疗和预后有重要意义。其他肿瘤与RRM1基因表达的研究也引起极大关注。

一、RRM1基因的结构

核苷酸还原酶（RR）是DNA合成通路中的限速酶，是唯一使核糖核苷酸转变为脱氧核糖核苷酸的酶，为DNA合成和修复所必需。RR全酶包括两个调节亚单位分别为RRM1和两个催化亚单位(RRM2或p53R2)。RRM1是核苷酸结合位点，能控制底物的特异性和全酶的活性，由一个活性位点(含Cys225、Asn437、Glu441、Cys439、Cys463残基)和三个独立的变构位点组成。RRM1还是一个肿瘤抑制基因，已证实该基因位于染色体11p15.5这是一个可出现于非小细胞肺癌的杂合子丢失（loss of heterozygosity，LOH）的区域，称为LOH11A。该区域与恶性肿瘤的转移有关系，75%的NSCLC患者有这样的杂合性缺失。有研究表明，该杂合子的丢失与预后有一定的关系，具有LOH丢失的非小细胞肺癌患者预后较差。

二、RRM1基因型与肿瘤的关系

肿瘤分子生物学领域的不断扩展使人们逐渐意识到，分子生物学基因表达谱的显著差异是不同个体对药物反应性差异的根本原因，也是指导肿瘤个体化治疗的基础。与药物作用靶标、药物代谢、转运以及细胞信号转导途径相关的特定基因的多态性，对药物的疗效起着决定性作用。RRM1是吉西他滨的作用靶点，RRM1(-37)和(-524)位点的基因多态性及mRNA的表达水平与吉西他滨的疗效有关。因此，能通过位点的基因多态性分析，在治疗前预测吉西他滨的疗效，不仅能提高患者受益可能性，还能减少无效治疗带来的巨大浪费。

据报道RRM1(-37)位点的基因多态性在不同种族有统计学差异。朝鲜人、西班牙人和美洲白人A/A的基因型频率基本一致；而在非裔美洲人中，A/A的基因频率为13.3%。本研究对150例中国人外周血基因组样本进行了RRM1(-37)位点的SNP检测，结果发现A/A的基因频率为31%，与Bepler等应用RFLP法报道的129例朝鲜族人中的A/A的基因型(27.1%)相似，本研究结果显示A/A基因型频率在健康人和肺癌患者中无统计学差异(P＞0.05)。

Bepler等报道286例非小细胞肺癌患者中，RRM1(-37)位点携带野生型基因型C/C的患者总生存率和无进展生存期明显高于A/C基因型和A/A基因型的患者，结果具有统计学意义。Taron等人研究了术后接受吉西他滨联合顺铂泰索帝治疗的非小细胞肺癌的RRM1(-37)基因型，结果表明A/C基因型患者无论从疾病进展时间(time to progress,TTP)和总生存时间(over survival time,OS )均优于C/C和A/A基因型的患者。Kim等研究了一线接受吉西他滨治疗的晚期非小细胞肺癌患者RRM1(-37)和(-524)位点的SNP，结果显示携带-37A/C和-524C/T基因型的患者，其有效率远高于其他基因型患者(65.5%和42.6%,P=0.039)，但无进展时间和总生存时间没有统计学差异。本组研究中RRM1(-37)位点的基因型与肺癌患者的一般状态，疗效及生存时间均无相关性，但由于纳入的病例数较少，要明确基因多态性与临床特征之间的关系尚需积累更多的病例，且多个基因位点的SNP以及RRM1基因mRNA的表达水平与吉西他滨临床疗效的关系同样值得进一步研究。

吉西他滨是目前治疗非小细胞肺癌的一线药物。研究表明作为吉西他滨作用靶点的RRM1，其启动子区域的基因多态性可以影响吉西他滨对非小细胞肺癌患者的疗效。

三、RRM1基因表达与预后

RRM1基因的表达可能阻断G2期细胞增殖，引起细胞凋亡和DNA损伤修复。体外研究表明，RRM1的过表达在RNA和蛋白质水平可诱导磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)表达，减少黏着斑激酶(FAK)的磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的迁移、浸润、转移，延长生存时间。因此，RRM1可作为肿瘤抑制基因而影响预后。

Goan等的研究认为在对吉西他滨耐药的鼻咽癌KB细胞克隆系中，RR的过度表达对耐药性起到重要作用。在对吉西他滨耐药的白血病细胞系K562中RR也有过度表达。然而，最近的研究却发现，在两株对吉西他滨耐药的NSCLC细胞系中，RRM1高表达而没有RR的活性相应增加。当细胞培养基中含有浓度较高的吉西他滨时，RRM1蛋白水平增高，而改用不含吉西他滨的培养基时，RRM1蛋白水平迅速下降到接近正常水平，说明这一效应是吉西他滨浓度改变引起的，这种现象的机制目前还没有充分的解释。一种可能的原因是吉西他滨能够不可逆地与RRMI结合造成酶失活，为了维持所需要的RR全酶的活性和量，细胞内的负反馈调节机制促使RRM1的表达增加，同时药物本身也失去活性，使肿瘤细胞表现出对吉西他滨的耐药。

目前多项临床研究结果显示低表达RRM1患者预后较好。Rosell等采用RT-PCR方法对晚期非小细胞肺癌患者的病理标本进行检测，发现RRM1低表达组较高表达组的中位生存期明显延长(13.7个月vs 3.6个月，95%CI=2.6~11.1个月)，因此RRM1表达水平可作为一个重要的预测预后的标志物。Rosell等又对67例ⅡB期、ⅢA期和ⅢB期术后非小细胞肺癌患者肿瘤组织进行检测，进一步证实了RRM1低表达组较高表达组死亡风险降低了70%，中位生存期延长，并且RRM1低表达组具有更好的肿瘤缓解率(65%vs 54%)、完全切除率(94%vs 72%)和病理完全缓解率(65%vs 0)。Ceppi等对70例晚期非小细胞肺癌患者进行回顾性研究，也证实在mRNA水平，RRM1低表达组中位生存期明显延长(13.9个月vs 10.9个月,P=0.0390)，RRM1与ERCC1表达水平具有高度相关性，两者低表达组预后较好，基因表达水平与组织学类型无相关性。而Bepler等对65例Ⅰ期、6例Ⅱ期、3例Ⅲ期和3例Ⅳ期术后非小细胞肺癌患者进行前瞻性分析，提取肿瘤组织及正常组织的RNA，用RT-PCR检测RRM1、PTEN的表达，结果发现，肿瘤组织中RRM1的表达和PTEN具有明显相关性(P=0.001)，高表达RRM1和PTEN的患者较低表达组中位生存期明显延长(52个月vs 24个月)，高表达RRM1和PTEN的患者无病生存期也较低表达者长(P分别为0.002和0.026)。zhong等对187例Ⅰ期手术后非小细胞肺癌患者进行回顾性分析，结果发现RRM1高表达组中位无进展生存期明显高于低高表达组(120个月vs 60.2个月)。

通过对上述出现不同结果的临床研究所入选的病例进行分析，发现：早期的非小细胞肺癌患者单独接受手术治疗时，高表达RRM1提示预后较好；而在晚期接受化疗的患者RRM1高表达提示预后较差，说明RRM1与非小细胞肺癌患者的预后关系可能因临床分期和治疗方案的不同而有所改变。在最近发布的美国国家癌症综合治疗联盟（NCCN）非小细胞肺癌的临床治疗指南（第二版，2009）中明确指出：在接受吉西他滨治疗前进行RRM1mRNA表达水平检测可提高治疗有效率和患者生存期。

RRM1的表达水平在与非小细胞肺癌预后的关系，吉西他滨耐药的相关性等方面的研究显示其在临床应用的重要价值，那么RRM1的表达水平是否可以预测不同分期的肺癌患者的预后，是否可以作为肺癌患者接受化疗的筛选指标，以预测不同人群对吉西他滨的敏感程度以指导临床用药，从而避免不必要的经济损失和化疗毒副作用，实现真正意义上的个体化治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能快速、高敏感度的检测血清、血浆RRM1基因表达的荧光定量PCR检测试剂盒。

本发明采用锁核酸（locked nucleic acid，LNA）技术合成覆盖RRM1基因检测位点的核苷酸序列探针，结合荧光定量PCR技术，研制一种快速、高度灵敏的检测RRM1基因荧光定量PCR试剂盒。该试剂盒包括荧光定量反应液预混液（PCR Master Mix）、LNA-荧光定量反应液（荧光定量反应液的特征是均含有正、反引物和荧光标记的RRM1基因检测位点核苷酸探针）、阳性对照样品。

荧光定量反应液：用于检测RRM1基因片断核酸序列，检测位点是-37位点上A/C和A/A两种基因型及-524位点上C/T和C/A两种基因型。

该反应液包括PCR引物一对及探针一条，其中：

正向引物序列为：

SEQ ID NO:1（5’-AAGAG CAGCG TGCCA GAGAT-3’）；

反向引物序列为：

SEQ ID NO:2（5’-ACACA TCAAA GACCA GTCCT GATTA G-3’）；

荧光探针序列为：

SEQ ID NO:3（FAM－TTGC TCTTT GGATT CCGGA TCTCT TCA-BHQ1）。该荧光探针的5′端标记FAM（荧光报告基团），3′端标记BHQ1（荧光淬灭基团）。

阳性对照样品：包含所检测RRM1基因检测位点的混合质粒基因组DNA质粒。

在本发明中提供的两端都标有荧光发光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5′端报告基团发出的荧光因为荧光共振能量转移（FRET）而被3′端淬灭基团淬灭，所以体系中没有荧光信号的变化。而一旦它与突变后的模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间，随着引物的延伸，Taq DNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板相结合的探针，其5′-3′外切酶活性就会将探针切断，荧光报告基团远离荧光淬灭基团，这样就破坏了两荧光基团之间的FRET，报告基团所释放出来的荧光就可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测到。PCR每经过一个循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，荧光信号的强弱就代表了模板DNA的拷贝数的多少。因此本发明不仅可用于简单的定性检测，亦可用做突变样本具体含量的定量检测。

与常规荧光定量PCR检测RRM1基因比较，本发明所述的CR检测试剂盒具有以下优势：

1.本发明采用LNA技术合成覆盖tubulin基因检测位点的核苷酸序列探针，提高检测敏感性和特异性，假阳性低。

2.灵敏度高，在混有野生型基因组DNA背景下，可准确检测出1%甚至更低含量的突变基因DNA；特异性好，PCR产物无需后续处理。

3.检测时间短（从标本送检到得出结果可在90分钟以内完成）。

4.操作过程简单，并且从PCR反应开始，就是在封闭的体系中完成扩增和实时测定，大大降低了污染的可能性，因此也就降低了结果偏差的几率（比较如下所示）。

5.本技术对标本DNA获取的质量要求较低，无论是血清、血浆、石蜡组织还是新鲜组织，都能取得理想的检测结果。

6.检测的样本量大，一次实验最多可检测95例。

7.安全：整个体系中不包含有毒有害物质，对操作员和环境都无危害。

附图说明

图1是RRM1基因-37位点上A/C的碱基部分阳性样本FQ-PCR图。

图2是RRM1基因-37位点上A/A的碱基阳性样本FQ-PCR图。

图3是RRM1基因-524位点上C/T的碱基部分阳性样本FQ-PCR图。

图4是RRM1基因-524位点上C/A的碱基阳性样本FQ-PCR图。

上述附图均为检测仪器自带软件的原始检测图，图中横坐标英文含义为“PCR循环数”，纵坐标英文含义为“扩增反应的荧光值”。

具体实施方式

本发明的实验材料是收集自中山大学附属肿瘤医院病理科2003年6月～2007年5月临床病理诊断为非小细胞肺癌（NSCLC）的90例女性患者的蜡块组织。所有患者术前均未接受过吉非替尼治疗。从蜡块中提取基因组DNA供以下的实验应用。

实施例1：本发明所述的RRM1基因表达荧光定量PCR试剂盒检测检测非小细胞肺癌病人组织中RRM1基因-37位点上A/C和A/A两种基因型。

设计能特异性检测-37位点检测A/C和A/A基因的探针各一条及公用引物一对。

正向引物序列为：

SEQ ID NO:1（5’-AAGAG CAGCG TGCCA GAGAT-3’）；

反向引物序列为：

SEQ ID NO:2（5’-ACACA TCAAA GACCA GTCCT GATTA G-3’）；

荧光探针序列为：

SEQ ID NO:3（FAM－TTGC TCTTT GGATT CCGGA TCTCT TCA-BHQ1）。该荧光探针的5′端标记FAM（荧光报告基团），3′端标记BHQ1（荧光淬灭基团）。

然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测：反应体系为15μl，正、反引物各0.15μl（20μΜ），探针各0.2μl（20μΜ)，模板DNA 2.5μl(100-300ng/μl)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix(购自美国应用生物公司)7.5μl，ddH2O 4.3μl。荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行。

PCR扩增反应程序：95℃预变性30秒；并按95℃5秒，62℃33秒，扩增反应45次循环

结果为：在90例样本中共检测出48例样本有-37位点上A/C的碱基（部分阳性样本见图1）；及16例样本有-37位点上A/A的碱基（（部分阳性样本见图2）。图1为部分存在-37位点上A/C的基因型样本的荧光定量PCR检测结果的扩增曲线；图2为部分存在-37位点上A/A的基因型样本的荧光定量PCR检测结果的扩增曲线。

实施例2：本发明所述的RRM1基因表达荧光定量PCR试剂盒检测检测非小细胞肺癌病人组织中RRM1基因-524位点上C/T和C/A两种基因型。

设计能特异性检测-524位点检测C/T和C/A基因的探针各一条及公用引物一对。

正向引物序列为：

SEQ ID NO:1（5’-AAGAG CAGCG TGCCA GAGAT-3’）；

反向引物序列为：

SEQ ID NO:2（5’-ACACA TCAAA GACCA GTCCT GATTA G-3’）；

荧光探针序列为：

SEQ ID NO:3（FAM－TTGC TCTTT GGATT CCGGA TCTCT TCA-BHQ1）。该荧光探针的5′端标记FAM（荧光报告基团），3′端标记BHQ1（荧光淬灭基团）。

然后优化反应体系进行FQ-PCR的检测：反应体系为15μl，正、反引物各0.15μl（20μΜ），探针各0.2μl（20μΜ)，模板DNA 2.5μl(100-300ng/μl)，2*Taqmanuniversal PCR Master Mix(购自美国应用生物公司)7.5μl，ddH2O 4.3μl。荧光定量反应在ABI7900检测仪上进行。

PCR扩增反应程序：95℃预变性10秒；95℃变性5秒，60℃退火/延伸20秒，40个循环。

结果为：在90例样本中共检测出36例样本有-524位点上C/T的碱基（部分阳性样本见图3）；及8例样本有-524位点上C/A的碱基（阳性样本见图4）。图3为部分存在-524位点上C/T的基因型样本的荧光定量PCR检测结果的扩增曲线；图4为部分存在-524位点上C/A的基因型样本的荧光定量PCR检测结果的扩增曲线。

由此看出，采用本发明所述的还原酶亚单位M1基因荧光定量PCR检测试剂盒，不仅可以快速、高效地检测出样品中的还原酶亚单位M1基因的突变，而且其结果的判读非常明确、直观，结果亦是可靠、特异的。