两株游动放线菌及其在抗细菌中的应用

摘要

本发明提供了两株游动放线菌及其应用，该游动放线菌Actinoplanes sp.PDF-1和PDF-2的保藏号分别为CGMCC No.4692和CGMCC No.4693。它们具有抗细菌尤其是抗耐药细菌的作用。本发明提供的菌种为可再生性微生物资源，可通过短期发酵，得到具有抗耐药菌活性的产物，该菌种可大规模用于工业化发酵生产，对环境污染相对化学合成较小。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及两株游动放线菌及 其在抗细菌中的应用。

背景技术

最近的一项调查表明在47家美国医院院内细菌感染中，65％的是 由革兰氏阳性细菌所引起的，其中最主要的是金黄色葡萄球菌和肠球 菌。随着抗菌药物的广泛应用，葡萄球菌属尤其是耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌(MRSA)的检出率和耐药率有逐年增加的趋势。上世纪50年 代发现的糖肽类抗生素万古霉素由于其独特的作用而被用作治疗多 重耐药革兰氏阳性菌感染的首选药物，并曾一度被誉为“人类对付顽 固性多重耐药革兰氏阳性菌感染的最后一道防线”。但自1986年万古 霉素耐药肠球菌(VRE)菌株在英国伦敦Dulwich医院被首次发现并 随着该耐药菌株又相继在其它许多国家被发现后，这最后一道防线也 面临着崩溃的危险。因此，寻找新的作用靶点，研发新型抗细菌，包 括耐药菌的药物已成为本世纪全球关注的研究热点之一。

微生物作为“绿色合成”中的重要资源，其代谢产物是创新药物主 要资源之一，据不完全统计，已分离和鉴定的微生物产物约50000个， 其中具有各种生物活性的高达22000个，直接作为临床药物和农牧业 用药实体多达200多个，微生物药物是临床用药中比例最大的药物， 也是近年来发展最为迅速的医药产品，在医药产品所占比例逐年上 升。至2002年，已发现的由细菌、放线菌和真菌产生的次级代谢产物 中，平均不到100个新化合物中就有一个可以成药或成先导化合物。 微生物来源的天然产物还具有化学结构多样性的特点，其结构有别于 来源于动物、植物和海洋的天然产物，是自然界中天然产物库的重要 组成部分。

微生物药物是近年来发展最为迅速的医药产品，在医药产品所占 比例逐年上升。2005年我国生物药品销售总额达到了157.4亿元，利 润总额为38.7亿元，预计2015年总产值可达1100亿到1300亿元， 随着生物技术的发展，由微生物发酵而来到生物药品的经济效益越来 越大。

在我国作为微生物药物代表的抗生素仍将占据药品市场的主要地 位，2005年我国抗生素产业达到300亿美元，抗生素产业规模已经成 为世界第一，销售额达到640亿元，占全国药品销售总额的30％之多， 并连续多年以超过17％的平均增长率增长，预计在今后较长时期内， 该类药物的市场需求仍将保持强劲的增长势头。但由于医药工业生产 的药品约97％是仿制外国的品种，虽然我国可称为医药生产的大国， 但在医药科技上还是一个弱国，使得医药产业总体经济效益偏低。因 此，研究开发创新微生物药物具有重要的现实意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供两株游动放线菌 Actinoplanes sp.PDF-1和PDF-2菌株。

为了实现本发明目的，本发明提供了两株游动放线菌。

其中，所述的游动放线菌Actinoplanes sp.PDF-1，已经于2011年3 月17日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，邮政编码为 100101，保藏号为CGMCC No.4692。其具有以下微生物学特性。

好氧菌，革兰氏阳性，无可溶性色素。孢囊呈亚球形至球形，直 径6μm孢囊孢子偏圆形。基丝丰富，无气丝。在ISP2等大多数培养基 上生长良好，基丝呈黄色至橙黄色。细胞壁含有meso-DAP，全细胞 水解液含阿拉伯糖和木糖，DNA的G+Cmol％含量为71.0％。硝酸盐 还原阴性，淀粉水解阴性，明胶液化阳性，七叶苷分解阳性，尿素分 解阳性，利用甘露糖、西蒙氏枸橼酸盐，不利用纤维二糖、丙二酸盐、 蜜二糖、酒石酸盐、糊精、棉子糖、肌醇、苯丙氨酸、水杨素、麦芽 糖、葡萄糖、乳糖、鼠李糖、半乳糖、甘露醇、醋酸盐作为碳源生长。 不能降解酪氨酸、弹性蛋白、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。

其中，所述的游动放线菌Actinoplanes sp.PDF-2已经于2011年3 月17日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心 (CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，邮政编码为 100101，保藏号为CGMCC No.4693。其具有以下微生物学特性。

好氧菌，革兰氏阳性，无可溶性色素。孢囊球形，直径5μm，着 生在孢囊梗上，孢囊孢子圆形，表面光滑，鞭毛周生。基丝丰富，无 气丝。在ISP2等大多数培养基上生长良好，基丝呈黄色至橙红色。细 胞壁含有meso-DAP，全细胞水解液含阿拉伯糖和木糖，DNA的 G+Cmol％含量为70.4％。淀粉水解阳性，明胶液化阳性，硝酸盐还 原阳性，七叶苷分解阳性，尿素分解阳性，利用丙二酸盐做碳源生长， 不利用酒石酸盐，甘露糖，糊精，苯丙氨酸，棉子糖，水杨素，麦芽 糖，乳糖，鼠李糖，肌醇，葡萄糖，醋酸盐作为碳源生长。不能降解 弹性蛋白、酪氨酸、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。酪素降解 阳性。

本发明的另一目的提供了所述菌株在抗细菌中的应用，尤其是在 抗革兰氏阳性细菌中的应用。

所述的革兰氏阳性细菌优选耐药的革兰氏阳性细菌。其中耐药的 革兰氏阳性细菌优选为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、 屎肠球菌。

PDF-1和PDF-2菌株具体的分离：

称取土壤样品1g(取自北京门头沟山区的草丛中)，悬浮于9ml 生理盐水中混匀，用生理盐水稀释至10^-2和10^-3，分别取200微升涂在 分离培养基上(M4(g/L)：腐殖酸1，植物蛋白0.5，MOPS 10Mm，甜 菜碱1.25，丙酮酸钠1.25，氯化钠10，琼脂12，pH 7.2)。在28℃，培 养10-20天，挑取单菌落至YM(ISP2，酵母膏4.0g，麦芽汁10.0g， 葡萄糖4.0g，1.5％agar，H₂O 1000ml，pH 7.0)斜面上。得到这两株 菌的纯培养物。

对这两株游动放线菌Actinoplanes sp.PDF-1和PDF-2菌株研究结 果表明：它们的发酵液粗提物可抑制多种细菌包括多种耐药细菌的生 长。

因此，本发明提供的游动放线菌Actinoplanes sp.PDF-1和PDF-2， 在采用一定的发酵培养基和培养条件下，它们的发酵液粗提物具有抗 细菌尤其是抗耐药细菌的作用。本发明提供的菌种为可再生性微生物 资源，可通过短期发酵，得到具有抗耐药菌活性的产物，该菌种可大 规模用于工业化发酵生产，对环境污染相对化学合成较小。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：菌株发酵产物的制备

菌株的发酵产物制备过程如下：分别将Actinoplanes sp.PDF-1和 PDF-2纯培养物接种到斜面培养基(酵母浸膏0.4％，麦芽浸膏1.0％， 葡萄糖0.4％，琼脂1.5％，pH7.3)上，28℃，培养10天。从斜面上挑 取0.5厘米见方的小块培养物种入盛有50ml发酵培养基(葡萄糖 0.5％，麦芽膏1％，棉子饼粉1％，可溶性淀粉2％，酵母浸膏0.5％， K₂HPO₄0.05％，(NH₄)₂SO₄0.5％，NaCl0.1％，CaCO₃0.3％，pH7.2。) 的250ml三角瓶中，28℃、190转/分旋转摇床培养4天。取50ml发酵 液用50ml的丙酮抽提，挥干后，用5ml的DMSO溶解。

实施例2：抑菌活性的验证

琼脂稀释法测定发酵液丙酮粗提物的抗菌活性，所测菌株包括金 黄色葡萄球菌的敏感菌株、耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄 球菌的敏感菌株、耐甲氧西林的表皮葡萄球菌、粪肠球菌的敏感菌株、 耐万古霉素的粪肠球菌、屎肠球菌的敏感菌株、耐万古霉素的屎肠球 菌、肠埃希氏菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯氏菌等20株菌。

1、制备培养基

培养基使用Mueller-Hinton(MH)琼脂培养基，按商品说明书进 行配制，pH7.2～7.4。

2、检定菌株的培养

20株检定菌株于37℃过夜培养。

3、含药平板制备

将1ml发酵液粗提物样品分别加入14毫升温度为45～50℃的MH 琼脂培养基中充分混匀后，全部倾倒入灭菌的平皿中。

4、接种物制备与接种

制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多 点接种器吸取制备好的菌液(约1～2μl)接种于各琼脂平板表面，每 点菌数约为10⁴CFU，形成直径为5～8mm的菌斑。接种后置37℃孵育 16～20h。

5、结果判断

与生长对照比较，“+”表示有可见抗菌活性，“-”表示无抗菌 活性。

表二菌株发酵液丙酮粗提物的抗菌谱测定结果

表中“+”表示有可见抗菌活性，“-”表示无抗菌活性

综上所述，游动放线菌Actinoplanes sp.PDF-1和PDF-2的发酵液 粗提物样品可抑制多种细菌包括多种耐药细菌的生长，所述的多种耐 药细菌优选为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌。 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的 描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域 技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所 做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。