香草酸苷衍生物在治疗系统性自身免疫性疾病中的用途

摘要

本发明公开了如式(I)所示的香草酸苷衍生物在制备治疗系统性自身免疫性疾病的药物中的应用。优选的系统性自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎。

说明书

技术领域

本发明涉及香草酸葡萄糖苷在治疗系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病中的新用途。

背景技术

自身免疫性疾病是指机体对自身成分发生免疫应答产生自身抗体和/或针对自身抗原的效 应T淋巴细胞，造成自身组织或细胞损伤和功能障碍。由于抗原抗体复合物沉积于血管壁等原 因导致全身多器官损伤的，又称为系统性自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)、类风湿关节炎(RA)、系统性硬化症(SSc)、口眼干燥综合征(SS) 等。其基本特征是患者血液抗核抗体阳性，使用免疫抑制剂治疗有一定效果。

以较为严重的系统性红斑狼疮为例。SLE是一种可累及皮肤和全身多系统的自身免疫性疾 病，确切病因尚不明确。本病以青年女性多见，病情常缓重交替出现，发病形式多样，受累 器官、病变程度和并发症各不相同。我国患病率约为70/10万，确诊病例50％以上肝、肾等重 要脏器受损。SLE尚不能根治，但经治疗可有效缓解病情。常用治疗药物有：1)羟氯喹：用 于仅皮肤受累的轻度病例。2)糖皮质激素：激素标准疗程治疗用于急性、暴发性病例，或主 要脏器受累时，是目前治疗本病的主要药物。3)免疫抑制剂：主要用于激素减量后病情复发 或激素有效但需用量过大出现严重副作用，以及狼疮肾炎、狼疮脑病等难以单用激素控制的 病例。常用的有环磷酰胺、环孢菌素、麦考酚酯、硫唑嘌呤、来氟米特、他克莫司、以及中 药雷公藤多苷等，其中许多为标签外用药。现有的免疫抑制剂长期使用会产生骨髓抑制，降 低肌体的抗感染力，也常常不同程度地影响糖、脂代谢。因此，相对安全、针对B淋巴细胞的 靶向生物治疗药物被认为是今后的治疗方向。用于RA治疗的利妥昔单抗是一种抗CD20单克隆 抗体，尽管由于II期临床未达治疗终点未被美国FDA批准，其标签外SLE用药仍在大大继续。 贝利单抗(belimumab)是人源化IgG1型抗B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BlyS) 单克隆抗体，能高度特异地与B细胞表面的BlyS受体结合，使产生自身抗体的B淋巴细胞凋亡， 高IgG血症正常化。2011年3月9日FDA批准贝利单抗用于治疗活动期、自身抗体阳性的红斑狼 疮(SLE)，成为自羟氯喹后56年来首个获批的SLE一线治疗药物。据分析，仅中国、印度和墨 西哥三国的SLE患者就超过了220万人，而其中只有极少部分患者能够负担得起昂贵的生物治 疗药物。因此，价格低廉的糖皮质激素和免疫抑制剂将会作为SLE的主要治疗药物继续存在。 新的、作用机制明确、疗效确切且副作用小的小分子免疫抑制剂不仅临床需要，也会给广大 SLE患者以及其他系统性自身免疫疾病患者带来获益。

香草酸葡萄糖苷曾在洋李等植物中分离出，但除抗氧化活性外，其他生物活性未见报道。 试验中偶然发现，香草酸苷类化合物具有免疫抑制活性。随后通过植物提取和化学合成制备 化合物，经结构确证后用于药理实验。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的治疗系统性自身免疫性疾病的药物，这类药物 具有优良的疗效且毒副作用低。

为解决本发明的技术问题，本发明采用如下的技术方案：具体而言是提供如式(I)所示 的香草酸苷衍生物在制备治疗系统性自身免疫性疾病的药物中的应用；

其中：R₁选自H或M，M选自碱金属或碱土金属；

R₂为H，C1-6的烷基；C1-6烷基取代的酰基；

R₃为

优选的碱金属选自Li、Na或K。

优选的碱土金属选自Mg、Ca或Ba。

优选的的C1-6的烷基选自CH₃，CH₂CH₃，CH₂CH₂CH₃。

优选的的C1-6烷基取代的酰基选自COCH₃，COCH₂CH₃，COCH₂CH₂CH₃。

更优选的式I化合物选自如下的群组：

上述式I所示的化合物可以通过常规的植物化学的方法提取或通过常规的药物化学的方 法合成制备。例如将香草酸和单糖作为原料，通过常规的有机化学的方法合成制备。

本发明中所述的系统性自身免疫疾病包括但不限定于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、 系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎。

本发明通过药理试验证明式I所示的化合物能够明显抑制体外培养的小鼠脾T、B淋巴 细胞增殖，明显抑制小鼠迟发性超敏反应的发生，并且能够明显降低活性DNA诱导的系统性 红斑狼疮综合征样小鼠血清抗ds-DNA抗体水平，减少IgG免疫复合物在肾组织的沉积和肾组 织损伤。因此式I所示的化合物可作为一种新的免疫抑制剂，用于治疗系统性自身免疫疾病， 尤其是系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎。

附图说明

图1香草酸葡萄糖苷对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响

图2.香草酸葡萄糖苷减少SLE综合征样小鼠肾组织IgG免疫复合物沉积

A1～A3模型组动物肾组织弥漫性损伤，肾小球增生，肾小球系膜细胞、毛细血管及肾小管、 血管强荧光(++++)；B1香草酸葡萄糖苷1.1mg/Kg组，仅小血管中度荧光(+～++)；B2香草 酸葡萄糖苷3.3mg/Kg组，小血管中强荧光，肾小球、肾小管轻度荧光(++)；B3泼尼松龙 5mg/Kg组，肾小球、肾小管轻度荧光(+)。

具体实施方式

下面通过式I化合物中代表性的香草酸葡萄糖苷的优选实施例并结合附图具体说明本发 明的各个方面和特征。本领域的技术人员应该理解，这些实施例只是用于说明目的，而不限 制本发明的范围。本发明的保护范围只受权利要求书的限制。在不背离权利要求书范围的条 件下，本领域的技术人员可以对本发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也 属于本发明的保护范围。例如，将实施例中所使用的香草酸葡萄糖替换为其他的式I化合物， 是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。

另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是本领域 中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技术人员公知的 常规方法。

实施例1.香草酸葡萄糖苷对体外培养的小鼠脾T、B淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用

1.1材料与方法

清洁级BALB/c小鼠，雄性，体重(19±2)g，购自中国医学科学院实验动物中心。LPS、 ConA、DMSO、MTT Sigma产品。RPMI 1640完全培养基含青霉素100U/L，链霉素100U/L，谷 氨酰胺2mM及10％胎牛血清。脱颈处死小鼠，无菌取脾脏，按常规制备睥淋巴细胞悬液，用RPMI 1640完全培养基调整细胞8×10⁹/L，0.1mL/孔接种96孔板。分别加入ConA(终浓度为2.5mg/L) 或LPS(终浓度为10mg/L)，以及香草酸葡萄糖苷(终浓度为1X10^-9-1X10^-5mol/L)，每个浓度 6个复孔。37℃、5％CO₂培养箱中培养。44小时后每孔加入MTT(5g/L)10μL，继续孵育4h， 离心后轻轻吸弃上清液，加入DMSO 100μL，用酶标仪测定570nm处吸收值。

1.2试验结果

香草酸葡萄糖苷对ConA诱导的小鼠睥T淋巴细胞的增殖具有明显的抑制作用， 1X10^-9、1X10^-6和1X10^-5mol/L浓度下抑制率分别为71％、48％和57％(p＜0.05，见表1和图1)。 香草酸葡萄糖苷对LPS诱导的小鼠睥B淋巴细胞的增殖也具有一定的抑制作用，1X10^-10- 1X10^-7mol/L浓度下抑制率24％-29％(见表2和图1)。

表1香草酸葡萄糖苷对CoA诱导的小鼠脾T-淋巴细胞增殖反应的影响

(**p＜0.01，***p＜0.001vs对照组)

表2香草酸葡萄糖苷对LPS诱导的小鼠脾B-淋巴细胞增殖反应的影响

(*p＜0.05vs对照组)

实施例2.香草酸葡萄糖苷对小鼠迟发性超敏反应具有明显的抑制作用

2.1材料与方法

Balb/c小鼠，雄性，18-20g，购自中国医学科学院实验动物中心。随机分组，每组3只， 适应性饲养一周后开始实验。致敏mBSA(Sigma)加注射用生理盐水至5mg/mL，与等体积弗 氏完全佐剂(CFA，Sigma)充分乳化。除正常对照组外，每只小鼠腹部皮内注射乳化剂100μl。 给药致敏第5日起每日灌胃给药，0.2ml/只，连续3次。正常和模型对照组给予蒸馏水，试 验药香草酸葡萄糖苷1.1，3.3，10，20mg/Kg体重4个剂量组，阳性药吲哚美辛3.3，10mg/Kg 体重2个剂量组。再次攻击末次给药2小时后，小鼠左足皮内注射生理盐水25μl，右足皮 内注射mBSA(5mg/mL)25μl。24hr后，脱颈处死动物，剪取左、右下肢称重，计算肿胀 度(mg/10g体重)及肿胀抑制率。同时摘取胸腺、脾脏称重，计算脏器指数。

2.2试验结果

mBSA再次攻击致敏小鼠可引起明显的迟发性超敏反应，吲哚美辛(3.3，10mg/Kg)和香 草酸葡萄糖苷(3.3mg/Kg)均具有明显的抑制作用，抑制率分别为34.6，66.6和48.0％。吲哚 美辛明显升高小鼠脾脏指数，而香草酸葡萄糖苷对小鼠的胸腺和脾脏指数均无明显影响。详 见表3。

表3香草酸葡萄糖苷对小鼠迟发性超敏反应的影响

(*p＜0.05，**p＜0.01vs模型对照组)

实施例3.香草酸葡萄糖苷对活性DNA诱导的系统性红斑狼疮综合征样小鼠抗体水平和肾组 织损伤的改善作用

3.1材料与方法

脾淋巴细胞活化和基因组DNA的提取处死BALB/c小鼠，无菌取脾脏，常规制备脾细胞悬 液，台盼蓝计数(存活率＞95％)，用RPMI 1640-20％胎牛血清调整细胞2X10⁹/L，加入Con A使终 浓度为3mg/L，每瓶20mL加入培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中直立培养，48h后取出，离心收 集活化细胞。利用动物基因组DNA大量快速提取试剂盒(北京博大泰克生物基因技术公司)， 按照试剂盒操作步骤进行活性DNA的制备。系统性红斑狼疮综合征样小鼠模型的建立BALB/ c小鼠，6wk，雌性。小鼠随机分组，每组6只，模型组和药物组行免疫，空白组不做任何处 理。免疫程序为：皮内多点注射，每2周一次，每次0.1mg/0.2mL，共计3次。首次免疫将DNA干 粉加生理盐水至2mg/mL，与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后注射。第2次免疫注射DNA和弗氏 不完全佐剂乳化剂；第3次免疫为DNA混悬液。致敏过程中眼眶取血检测血清抗ds-DNA抗体水 平。给药第3次免疫后第8天开始每日灌胃给药，0.2mL/10g体重，共15次。给药剂量分别为 香草酸葡萄糖苷1.1，3.3和10mg/Kg体重；阳性对照药醋酸泼尼松龙5mg/Kg；模型组和正常 对照组给予纯净水。末次给药后，摘眼球取血处死动物；取血清待测抗体；取胸腺、脾脏、 肝脏称重计算脏器指数；取肾脏以4％甲醛溶液固定进行病理学检查。抗ds-DNA抗体的检测96 孔酶标板(COSTAR)，每孔加入100μL鲑鱼dsDNA(Sigma，50mg/L)4℃包被过 夜，PBS-0.5％Tween 20洗板，2mg/mL BSA-PBS吸附，洗板后加入100μL稀释血清，使用山羊- 抗小鼠IgG-HRP(eBioscience)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒(武汉博士德)，按照 试剂盒操作方法测定450nm OD值(酶标仪，Labsystems)。肾脏组织免疫病理学检查小鼠肾 脏以4％甲醛溶液固定，5μm石蜡切片。常规切片处理，使用山羊-抗小鼠IgG-FITC (eBioscience)进行肾组织IgG免疫复合物荧光检查，盲法病理学评分：0＝基本无荧光；1＝ 灶性肾小球轻度荧光；2＝一定数量的肾小球轻中度荧光，肾小管轻中度荧光；3＝大量肾小球、 肾小管、侵润炎细胞中强度荧光；4＝肾小球大面积强荧光，荧光显示弥漫性肾小球、肾小管 坏死。

3.2试验结果

(1)第3次免疫后第7天，所有免疫组小鼠血清抗ds-DNA抗体水平均明显高于空白对照 组，表明造模成功。

(2)给药15天后，1.1，3.3和10mg/Kg体重香草酸葡萄糖苷给药组小鼠血清抗ds-DNA 抗体水平分别为0.368±0.047，0.303±0.060，0.328±0.053(OD)，与模型组0.445±0.110 比较降低明显(p＝0.149、p＜0.05和p＜0.05，n＝6，表4)。

表4香草酸葡萄糖苷对SLE综合征样小鼠血清抗ds-DNA抗体的作用

(*p＜0.05，**p＜0.01vs模型对照组)

(3)给药15天后，模型组小鼠肾组织免疫病理学评定分值为3.2±0.9(n＝6)，三个给 药组(1.1，3.3和10mg/Kg体重)的评定分值分别为1.6±0.7(n＝6)，2.5±0.8(n＝6)，2.8 ±1.1(n＝2)，与模型组相比均有下降，其中1.1mg/Kg剂量组改变明显(p＜0.01，表5，图2)。

表5香草酸葡萄糖苷对SLE综合征样小鼠肾组织免疫复合物沉积的影响

(**p＜0.01vs模型对照组)

以上结果表明，香草酸葡萄糖苷能够明显降低活性DNA诱导的系统性红斑狼疮综合征样 小鼠血清抗ds-DNA抗体水平，减少IgG免疫复合物在肾组织的沉积和肾组织损伤。

综上所述，香草酸葡萄糖苷能够明显抑制体外培养的小鼠脾T、B淋巴细胞增殖，明显 抑制小鼠迟发性超敏反应的发生，并且能够明显降低活性DNA诱导的系统性红斑狼疮综合征 样小鼠血清抗ds-DNA抗体水平，减少IgG免疫复合物在肾组织的沉积和肾组织损伤。香草酸 葡萄糖苷可作为一种新的免疫抑制剂，用于系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗。