全人源抗人VEGF单抗分子及其应用

摘要

本发明涉及抗人VEGF单抗及其编码核酸序列。本发明特别与高亲和力低解离速率的抗人VEGF单抗有关。本发明的优选抗人VEGF单抗包含全人源Fc区和框架区以及通过分子进化获取的全人源的轻链和/或重链可变区。本发明还披露了这种全人源抗体组成的药物组成在人疾病的治疗中的应用以及在治疗中使用这种全人源抗体的方法。

说明书

发明领域

本发明涉及抗人VEGF单抗及其编码核酸序列。本发明特别与高亲和力低解离速率的抗人VEGF单抗有关。本发明的优选抗人VEGF单抗包含全人源Fc区和框架区以及通过分子进化获取的全人源的轻链和/或重链可变区。本发明还披露了这种全人源抗体组成的药物组成在人疾病的治疗中的应用以及在治疗中使用这种全人源抗体的方法。

背景技术

血管内皮生长因子的生物学功能

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，简写为VEGF)是一种由刺激新生血管生长的细胞产生的信号蛋白，它是在血液循环系统供氧不足的情况下恢复向组织供氧机制的一个组成部分。

VEGF是生长因子的一个亚族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PlGF)，它们都是与血管发生和血管生成中的重要信号蛋白。在发现其他成员之前，VEGF-A一直称为VEGF。

本发明中，除特别指定的外，VEGF即指VEGF-A。

VEGF亚族的所有成员都能通过与细胞表面的酪氨酸激酶受体(VEGFRs)结合而引起二聚体化，并通过转磷酸化作用(尽管位点、时间和程度不同)而活化，从而刺激细胞反应。血管发生(Vasculogenesis)是指从循环或组织的内皮干细胞分化成新的能形成血管的内皮细胞的过程。这一过程特别与血管系统的胚芽发育有关。

血管生成(angiogenesis)是指由已存在的血管内皮以出芽、分裂增殖等方式形成毛细血管丛的过程。这一过程与受伤组织的修复机制有关，在人的一生中都起着重要作用。

已有很多工作证明，VEGF对正常和非正常血管生成有重要调节作用(Ferrara，et al，1997，Endocr Rev，18：4-25)。研究发现，即使丢失了一个VEGF等位基因也将导致胚胎死亡，说明这一因子在血管系统发育和分化中起着不可取代的作用。此外，VEGF还是肿瘤和眼睛疾病新生血管化作用(neovascularization)的重要介导因子。研究证明，大多数人类癌症涉及VEGF的过量表达(Berkman，et al，1993，J Clin Invest，91：153-159；Brown，et al，1995，Human Pathol，26：86-91；Brown，et al，Cancer Res，53：4727-4735；Mattern，et al，1996，Brit J Cancer，73：931-934；and Dvorak，et al，Am J Pathol，146：1029-1039)。另外，VEGF在眼液中的浓度与糖尿病患者以及缺血性肌萎缩相关的视网膜病人血管分化活性高度相关(Aiello，et al，1994，N Engl J Med，331：1480-1487)。最近的研究表明，受AMD影响的病人中，VEGF定位于无脉络新生血管膜(Lopez，et al，1996，Invest Ophtalmo Vis Sci，37：855-868)。抗VEGF中和抗体可以抑制裸鼠中多数人类肿瘤细胞系的生长(Kim，et al，1993，Nature，362：841-844；Warren，et al，1995，J ClinInvest，95：1789-1797；Borgstrom，et al，1996，Cancer Res，56：4032-4039；and Melnyk，et al，1996，Cancer Res，56：921-924)，并抑制缺血性肌萎缩视网膜病模型中眼内血管生成(Adamis，et al，1996，Arch Opthalmol，114：66-71)。因此，抗VEGF单抗或其他VEGF抑制剂是治疗实体瘤和各种眼内新生血管病的有前途的候选分子。

血管生成是涉及从现有血管生成新生血管的生理过程(John SP，2008，Retinal andChoroidal Angiogenesis，Springer pp119)。尽管对这一名词长期争论，但血管发生是用于描述血管自发形成的术语。

血管生成在生长、发育以及伤口癒合中是正常的、至关重要的过程。同时，它还是癌症从休眠向恶性转换的关键步骤。癌症中出现的血管发生可扩散因子是Greenblatt和Shubik(Greenblatt M，Shubik，PJ，1968，Natl Cancer Inst，41：111-124)发现的。VEGF的正常功能是，在胚胎发育过程中、受伤后以及产生新血管阻塞后形成旁路时产生新的血管。若VEGF过量表达，则可导致疾病。如果没有充足的营养供应，实体瘤就不能超过一定的体积(体积限制)。可以产生VEGF的肿瘤因形成新的血管从而获得营养，就能够体积限制继续生长并转移。VEGF的过量表达可引起眼睛或人体的其他部位出现血管性疾病。像bevacizumab这样的药物能够抑制VEGF并控制或延缓这些疾病的发生和发展。

细胞缺氧可诱发产生VEGF。当一个细胞缺乏氧气时，它就产生HIG(低氧症诱导因子，是一种转录调控因子)。HIF刺激VEGF的释放。然后循环中的VEGF可以与内皮细胞的VEGF受体结合，引发导致血管生成的酪氨酸激酶途径。HIF1α和HIF1β总是表达的。但HIF1α遇氧不稳定，在氧气充足的情况下很容易降解。在缺氧情况下，HIFα很稳定，且HIF1α/β复合物可刺激VEGF释放。

在实体瘤中，新生血管化作用使得肿瘤细胞相对于正常细胞获得生长优势并可自主分化。因此，在乳腺癌和若干种其他肿瘤中发现，肿瘤切片中微血管的密度与病人生存率有密切关系(Weidner，et al，1991，N Engl J Med，324：1-6；Horak，et al，Lancet，340：1120-1124(1992)；Macchiarini，et al，1992，Lancet，340：145-146)。VEGF的过量表达可能是转移过程的早期步骤，是一个“血管生成”的开关。尽管VEGF与低生存率有关，但是在肿瘤发展中的真实机理尚不清楚。

在类风关病人中，与TNFα相对应，也有VEGF的释放，从而导致内皮细胞通透性增强和浮肿，并刺激血管生成(形成毛细血管)。

VEGF在糖尿病视网膜病(DR)也是重要的，在糖尿病人视网膜微循环可诱发视网膜缺氧性肌萎缩，这正是VEGF引起的。VEGF是前血管生成VEGF异构体超过正常表达的VEGFb异构体平衡的转换器。VEGF可进而引起在视网膜和眼睛的其他部位产生新血管，预示视力将受到威胁。

VEGF在湿性AMD病理中具有重要作用，它导致了当今全球老龄化社会中失明的主要原因。尽管在病因和新生血管化作用的典型起源方面不同，AMD的血管病理学与DR具有很多相同特征。

一旦释放，VEGF就可引发多种反应。它可以引起一个细胞存活、移动，甚至分化。因此VEGF是治疗癌症的潜在靶点。第一种抗VEGF药物是一种叫做bevacizumab的单抗，于2004年被批准上市。大约10至15％的病人从bevacizumab治疗中获益，但是bevacizumab有效性的生物标志物至今仍不清楚。

已经知道VEGF具有促进内皮祖细胞(EPC)动员并使循环的EPCs数量增加，这种效应可以被同时注射的重组人VEGF中和抗体消除(Asahara T，et al，1999，Embo J，18：3964-72；Kalka C，et al，Ann Thorac Surg，2000；70：829-34)。研究还证明，用重组人VEGF处理可使角膜新生血管化作用比对照明显增强。用移植了转基因小鼠骨髓(带有内皮细胞特异性基因tie-2的转录调控序列控制下的lacZ基因)的小鼠模型进行的研究证明，lacZ基因编码的半乳糖苷酶基因可持续表达，这说明来自EPC的骨髓整合到了角膜新生血管的毛细血管以及基质组织(Asahara T，et al，1999，Circ Res，85：221-8)。这些试验数据证明，VEGF动员的EPC细胞确实参与了缺血性肌萎缩的新生血管化作用的过程。

有几种类型的细胞对于肿瘤的生长是重要的。特别是EPC，是肿瘤血管生长中极为重要的细胞群。在著名杂志Science(2008)和Gene and Development(2007)发表的研究结果也说明EPC细胞对于转移和血管生成是关键的(Gao D，et al，2008，Sci，319：195-198；Nolan DJ，et al，2007，Genes and Dev，21(12)：1546-1558)。EPC细胞在肿瘤生长、血管生成和转移中的重要作用在Cancer Research发表的结果得到了进一步证明(MellickAS，et al，2010，Cancer Res，70(18)：7273-7282)。

肺气肿病人肺动脉中的VEGF水平降低。

VEGF在肾小球炎中的表达升高，直接导致与蛋白尿症有关的肾小球囊过度生长(Liu E，et al，2007，J Am Soc Nephrol，18(7)：2094-104)。

VEGF受体有一种包含7个免疫球蛋白样结构域的胞外蛋白部分，这是一种单一穿膜蛋白，其胞内部分包含一个分开的酪氨酸激酶结构域。VEGF-A可以与VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(KDR/Flk-1)结合。VEGFR-2似乎介导了对VEGF的几乎所有的已知反应(HolmesK，et al，2007，Cell Signal，19(10)：2003-2012)。尽管认为它通过对VEGFR-2信号进行调变，但VEGFR-1的功能仍未搞清。VEGFR-1的另一个功能是欺骗受体，从VEGFR-2没收VEGF(这似乎在胚胎血管生成期间是特别重要的)。VEGF-C和-D是第三种受体VEGFR-3的配体，可介导淋巴管生成，但VEGF-A不能。

肿瘤血管生成

现在已经很清楚，血管生成与包括但不限于实体瘤、眼内新生血管症(例如分化性视网膜病或AMD)、类风湿关节炎和银屑病等疾病的病理过程有密切关系(Folkman J，1971，NEngl J Med，285(21)：1182；Folkman，et al，1992，J Biol Chem 267：10931-10934；Klagsbrun，et al，1991，Annu Rev Physiol，53：217-239)。

癌症细胞可以以一种可控的方式失去分裂能力。一个肿瘤是由一群快速分裂和生长的癌症细胞组成的。在该群体快速发生和积累突变。这些突变(变异)可使癌症细胞或一个肿瘤内的亚群产生抗药性并逃避治疗。由于缺乏氧气和其他必需的营养，肿瘤生长不能超过一定的体积，一般来说是1～2立方毫米(McDougall SR，et al，2006，J Theor Biol，241(3)：564-89)。肿瘤可通过分泌多种生长因子，例如VEGF而诱导血管生长，从而诱导毛细血管生长到肿瘤组织并为肿瘤的生长提供营养。研究发现，癌症细胞停止产生抗VEGF的酶PKG。也有一些人相信，血管生成是一种消耗途径，它可以消耗快速分裂的细胞快速分泌的生物学终端产物。无论哪种情况，血管生成都是从一个小而无害的小细胞团转化成大的肿瘤的必需步骤。

血管生成也是肿瘤扩散，即转移，所需要的。单个癌症细胞可以从已经形成的实体瘤脱落，然后进入血管，运动到远处并在那里移殖，最终长成次级肿瘤。已有证据表明，一个特定实体瘤中的血管事实上可能都是嵌合的，由上皮细胞和肿瘤细胞共同组成。这种杂合性使得肿瘤细胞脱落并进入血管，很可能是在恶性肿瘤病人的外周血出现循环肿瘤细胞的原因(Allard WJ，et al，2004，Clin Cancer Res，10(20)：6897-6904)。这种转移肿瘤的后续生长将需要营养和氧气的供应以及废物的排泄通道。

一直认为内皮细胞比癌症细胞遗传稳定性更高。这种基因组稳定性使其具有作为靶点的优势。因此，内皮细胞被认为是利用抗体治疗的理想靶点

肿瘤血管形成

肿瘤血管有血管周分离、血管膨胀和形状异常。认为肿瘤血管不像正常组织那样是平滑的，也不能给组织提供充足的氧气(John SP，2008，Retinal and ChoroidalAngiogenesis，Springer.pp119)。然而，内皮细胞分化和向血管周空间迁移并形成肿瘤细胞。VEGF在血管形成中是一个关键因子，它导致了肿瘤的生长，并使血管膨胀。这称之为出芽血管发生(Brown JM，Giaccia AJ，1998，Cancer Research，58(7)：1408-16；Bergers G，Benjamin LE，2003，Nat Reviews-Cancer，3(6)：401-10；Rafii S，etal，2002，Gene Therapy，9(10)：631-41)。

血管发生研究在癌症研究中是一个巨大的突破。最近的证据表明，常规治疗，例如放疗，只部分地通过基因组稳定的内皮细胞起作用，而对基因组不稳定的肿瘤细胞则近乎无效。新的血管形成是一个相对脆弱的过程，可以因多方面的干扰而终止。简单点地说，治疗是选择可以用来杀死细胞的治疗剂。由于很短的世代时间和基因组的不稳定性，肿瘤细胞可以很快地进化出抗性。但是内皮细胞的世代时间长，基因组稳定，因此是很好的靶点。

临床意义

如同上述，VEGF是与实体瘤中血管生长有关的因子，它与肿瘤的营养供应有关，决定了肿瘤的生长和转移。因此，它是治疗所有实体瘤的潜在靶点。

VEGF与乳腺癌不良预后直接相关。许多研究表明，VEGF过度表达可能是转移的早期步骤。

VEGF还与对TNFα有反应的类风湿关节炎有关，它可增加内皮细胞的通透性并使其肿胀，并且刺激血管生成，促进毛细血管的形成。

VEGF在DR中也是重要因子。糖尿病人视网膜微循环问题可引起缺血性肌萎缩，这将这将导致VEGF的释放。这是pro-血管生成VEGF异构体与正常表达的VEGF异构体之间平衡的开关，从而引起视网膜或眼睛的其他部位形成新的血管，进而对视力造成威胁。

VEGF在湿性AMD的病理学中具有重要作用，它可导致老年人失明。AMD的血管病理学与DR有许多共同之处，但它们在病因和新生血管化作用的典型起源方面有所不同。

血清VEGF-D水平在血管肉瘤病人中显著升高(Amo Y，et al，2004，Br J Dermatol，150(1)：160-1)。

一旦释放，VEGF即可诱发多重反应。它可以引起细胞存活、运动或进一步分化。因此，VEGF是一个治疗癌症的潜在靶点。

第一个抗VEGF药物bevacizumab是一种单抗，于2004年被FDA批准上市。它可以使10～15％的病人获益，但是其机理仍不清楚。

最近的研究证明，VEGF不是血管生成的唯一促进因子，至少FGF2和HGF也是与血管生成有关的因子。

发现肺气肿病人肺动脉的VEGF水平降低。

在肾小球炎，VEGF升高，直接导致与蛋白尿有关的肾小球囊肥大(Liu E，et al，2007，J Am Soc Nephrol，18(7)：2094-104)。

血管生成抑制因子

血管生成抑制剂是一类能够抑制血管生成的物质。它可以是内源的，也可以是外源的药物或饮食的组成部分。每一种实体瘤都需要产生血管以保证达到一定体积后能保持存活。通常，除非启动了组织修复过程，在成年人体内不是任何部位都能生长血管的。

已知的抑制剂包括与VEGF结合的单抗bevacizumab，它可抑制VEGF与其受体结合，从而阻断其促进血管生成作用。

血管生成为基础的肿瘤治疗依赖于天然的或合成的血管生成抑制剂，例如angiostatin，endostatin和tumstatin。这些因子都是已经存在的结构蛋白如胶原蛋白或血纤维蛋白溶酶原的特异性片段。

FDA批准的第一个以癌症中血管生成为靶点的药物就是商品名为Avastin的单抗bevacizumab，可与已有的化学疗法结合用于治疗结直肠癌。

湿性AMD是另一种可用这类药物治疗的与不希望的血管生成有关的疾病。这种类型的AMD主要导致老年人视网膜损伤，使视野中央(黄斑)丧失视力。它有干、湿两种类型，是老年人(＞50岁)视力损伤的主要原因。黄斑退化使得病人难易阅读或看清他人面部，但周边视力尚存，能进行其他日常活动。

眼睛的内层是带有视觉神经的视网膜，后面是带有给黄斑供血的脉络膜。在非渗出型的干型AMD，称之为drusen的细胞碎片在视网膜和脉络膜之间积累，视网膜可以被剥离。更为严重的渗出型湿性AMD，从视网膜后面的脉络膜长出血管，视网膜也可被剥离。这种疾病可以用laser coagulation激光凝结术治疗，也可以用终止甚至逆转血管生长的药物治疗(de Jong PT，2006，N Engl J Med，355(14)：1474-1485；Jonathan C Horton，Chapter25，Disorders of the Eye，in Harrison’s Principles of Internal Medicine，16th ed.)。

尽管某些影响年轻人的黄斑营养不良也发生黄斑退化，但这一术语主要指老年性黄斑退化症，简写为AMD或ARMD。

AMD起始于在视网膜色素上皮细胞和脉络膜之间的黄斑(即视网膜中央，提供中央视力，称为中央凹)中发生称之为drusen的特征性黄色沉淀。多数具有这些早期变化的人视力是正常的。有drusen的人可能继续发展为更重的AMD。当drusen变大变多并干扰了黄斑下面的色素细胞层的时候，风险将明显增加。最近的研究证明，大而软的drusen与胆固醇沉积增加有关，可能对降低胆固醇的制剂有响应。

在某些癌症和AMD的治疗上抗VEGF治疗是重要的手段。这种治疗包括单抗(如Avastin)、单抗衍生物(如Lucentis)或可口服的能由VEGF刺激的抑制酪氨酸激酶的小分子，如lapatinib(Tykerb)，sunitinib(Sutent)，sorafenib(Nexavar)，axitinib和pazopanib。

两种基于单抗的物质已经商品化。口服药物的前三种也已经商品化，后两种正在临床试验中。

2008年，Bergers and Hanahan得出结论：抗VEGF药物在癌症的小鼠模型以及数量正在不断增长的人类癌症中有治疗效果。但是，“治疗效果最好的情况下也是短暂的，接着就是肿瘤生长的恢复和发展”(Folkman J，Klagsbrun M，1987，Sci，235(4787)：442-7)。VEGF也可以被thiazolidinediones(用于mellitus2型糖尿病及项疾病)抑制，对粒层细胞的这种效应使thiazolidinediones有了用于卵巢hyperstimulation综合征的可能性(Folkman J，1996，Sci American，275(3)：150-4)。

抗VEGF治疗

抗VEGF治疗在某些癌症和AMD的治疗上是重要的。这种治疗包括单抗(如Avastin)、单抗衍生物(如Lucentis)或可口服的能由VEGF刺激的抑制酪氨酸激酶的小分子，如lapatinib(Tykerb)，sunitinib(Sutent)等。基于抗体的和一些化学物质已经商品化。

在某些实体瘤和AMD治疗上，抗体已经成为主要的疗法。

人源化单抗Bevacizumab，其商品名为Avastin，是第一种商品化的血管生成抑制剂。它能通过抑制VEGF(VEGF-A)的功能阻止新血管的形成，从而终止肿瘤的生长。

Bevacizumab自2004年以来已被FDA批准单用或与其他标准化疗法联用治疗以下实体瘤：

1.转移性结直肠癌；

2.非磷状非小细胞肺癌；

3.转移性乳腺癌；

4.Glioblastoma，单用

5.转移性肾癌；

6.正在临床试验的有：卵巢癌和胰腺癌。

Ranibizumab是一种从bevacizumab衍生的单抗片段(Fab)，被批准用于有新生血管的治疗湿性AMD。

发明内容

本发明小结

本发明提供了一种全人源抗人VEGF单克隆抗体(后简称：抗人VEGF单抗分子)及其编码核酸序列与应用。特别是，本发明的这种分子对人VEGF分子具有高亲和力和低解离速率。

本发明中，所述抗体分子的重链和轻链是全人源的，尽管嵌合的或人源化的也可以使用，但是用于人体时，全人源的可以避免很多副作用，例如HAMA和HACA反应引起的那些副作用。

本发明的某些实施例提供了包括抗人VEGF单抗分子的组合物，所述分子包含：(a)一个由可变区和Fc片段等部分构成的完整的或不完整的轻链，其可变区由氨基酸序列SEQ IDNO：1或由SEQ ID NO：3或编码同样氨基酸序列的等效序列编码的SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成；和b)一个由可变区和Fc片段等部分构成的完整的或不完整的重链，其可变区包含由SEQ.ID NO：2或由SEQ.ID NO：5或其等效序列编码的SEQ.ID NO：6氨基酸序列。

本发明的抗人VEGF单抗分子包括重链与轻链；所述轻链包含有序列如SEQ ID NO：1所示的轻链可变区或其一部分，所述重链包含有序列如SEQ ID NO：2所示的重链可变区或其一部分；或所述轻链包含有序列如SEQ ID NO：4所示的轻链可变区或其一部分，所述重链包含有序列如SEQ ID NO：6所示的重链可变区或其一部分。

本发明的优选抗人VEGF单抗包含全人源Fc区和框架区以及通过分子进化获取的全人源的轻链和/或重链可变区。

本发明中，轻链和重链的框架区都是全人源的，其框架区来自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型；优选的是来自人IgG1，最优先选择的是来自IgG1 kappa。

本发明中，重链和轻链的Fc区都是全人源的，其Fc区来自人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM亚型，优选的是人IgG1。本发明所述抗体分子的Fc可以是天然的，也可以是修改过的。所述Fc区可以是采用任何有效的基因工程方法或其他方法改造过的，其效应功能得到提高或降低的变异体。

本发明的全人源框架和Fc区是直接或间接从人体得到的。所述的直接方法包括但不限于基因组DNA克隆、cDNA、cDNA文库。所述的间接方法包括但不限于根据包括但不限于GenBank或其他出版物提供的生物信息为基础部分合成或完全从头合成完整的DNA。DNA合成技术包括但不限于以PCR为基础的DNA合成方法。

在某些实施例中，所述抗人VEGF抗体分子包括全长分子或其一个片段(例如Fv、Fab、F(ab’)₂等)。在特定实施例中，所述抗人VEGF抗体分子包含一个单域(即CDR)，单链Fv、Fab或F(ab)₂等。

在某些实施例中，轻链可变区包括全人源框架。在另一些实施例中，轻链可变区包含一种人源的种系框架。在特定的实施例中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。在特定的实施例中，重链可变区包含人的种系框架区。在另外一些实施例中，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

在某些情况下，所述抗人VEGF抗体分子可以是为延长其在循环系统中的半衰期用化学方法进行了PEG修饰的。PEG修饰是通过活化scFv、Fab或Fab’2分子上截短的铰链区的一个氨基酸残基实现的，方法是Chapman AP等的论文中描述的(PEG)-lysyl maleimide方案(Chapman AP，et al，1999，Nature Biotechnology 17，780-783。其他替代方法的细节可以在许多出版物中找到，例如Knight DM，et al，2004，Platelets 15(7)：409-18和美国专利US5824784。

在某些实施例中，所述抗人VEGF单抗分子包含由轻链和重链组成的Fab分子。所述轻链是由SEQ ID NO：7所示的DNA片段或编码同样氨基酸序列的等效DNA序列编码的SEQ IDNO：8所示的氨基酸序列。其重链包括由SEQ ID NO：9或编码同样氨基酸序列的等效DNA序列编码的如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

在某些实施例中，所述抗人VEGF抗体分子包含一种Fab，并进一步包含完整的Fc区，从而形成全长的mAb分子，或者进一步包含Fc的一部分，从而形成不完整的mAb分子。

此外，Fc区应当具有补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。这些功能可以通过氨基酸替换进行修饰，以减少或消除或增强其效应功能。

本发明的抗人VEGF抗体分子是在真核或原核受体细胞中表达的。在某些实施例中，编码轻链和/或重链的核酸序列包含在一种质粒或其他表达载体中。

本发明提供了在治疗中使用这种抗体的方法。这些方法包括：(1)一种包含本发明所述抗人VEGF抗体分子的药物组合；(2)对客体施用这种药物组合。所述客体是指具有本品适应症症状的病人。在某些实施例中，所述适应症可从以下疾病中选择：(1)各种实体瘤，包括但不限于淋巴细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌等；(2)眼内异常血管生长，包括但不限于干性和湿性老年性黄斑退化症等。(3)其他与VEGF有关的疾病。本发明内容的详细描述

本发明提供了抗人VEGF单抗分子及其编码核酸序列。特别是，本发明提供了具有结合力和低解离速率的抗人VEGF单抗分子。优选地，本发明所述的所述抗人VEGF单抗分子由具有全人源框架的轻链和/或重链可变区组成。为方便描述，本发明就此内容分成以下几方面进行描述。I.抗人VEGF单抗分子；II.制备抗人VEGF单抗分子；III.用于治疗的配方和使用方法。以及IV.抗人VEGF抗体分子的其他用途。

I.抗人VEGF抗体分子

本发明的单抗可以用多种技术获得，包括但不限于Kohler and Milstein，Nature 256：495(1975)发表的标准的杂交瘤技术。尽管原则上这一技术是受偏爱的，但其他获得单抗的技术也可以应用，例如转基因小鼠或杂交瘤技术。小鼠中的杂交瘤技术已经十分成熟。免疫和融合伙伴已经十分清楚。但是，用小鼠或其他非人动物杂交瘤产生的抗体会引起HAMA反应，从而导致用于人体疾病治疗时会引起副作用。以这些抗体为基础获得的嵌合的或人源化的单抗用于人体时仍然能够引起HACA反应，从而导致类似的免疫反应，尽管比起原型分子轻微。全人源杂交瘤技术仍然处于开发状态，尚不足以获得用于人类疾病治疗的单抗。

对于人类疾病治疗来说，需要全人源抗体以减少或消除引起副作用的HAMA或HACA反应。尽管转基因小鼠已经有很成功的记录，其他技术也是可以选择的。

抗体库技术，特别是由CAT及其他机构建立的全人源抗体库技术就是其中值得考虑的一种选择。CAT建立的技术在一些治疗性抗体的开发上获得了某种程度的成功，引起了国际上的关注，但是它依然有非常明显的问题：获得高亲和力scFv分子的几率很低。这就需要对该技术进行改进，以满足治疗性抗体的需要。

本发明对现有抗体库技术的最重要的改进有：(1)用3000位来自于不同民族和地区的健康成年人血样构建了超大规模全人源天然Fab抗体库，称之为HuLib。显然，与已发表的抗体库相比，该抗体库具有更丰富的遗传变异。对于熟知本领域的人员来说，不难理解这将大大提高遗传复杂性和通过淘筛或其他方法获得高亲和力Fab分子的可能性。此处可以使用的其他抗体库可以是合成的或部分合成的，也可以是scFv，起始材料也可以是其他非人动物，例如小鼠。(2)为了提高亲和力和改变获得的Fab分子亲和力以外的其他性状以满足治疗的需要，采用了分子进化技术。通过分子进化改进的分子可以借助哺乳动物细胞、酵母菌细胞或细菌细胞进行生产。

本发明中的原型Fab分子是用人VEGF作为抗原上述抗体库进行淘筛获得的，它将被用于后续通过分子进化的原型分子，以获得亲和力等技术指标达到治疗性药物要求的候选单抗。

本发明的分子进化技术是通过PCR引入突变的，它包括：(1)关键氨基酸(KA)扫描。KA扫描被用来在人工进化之前检定最有意义、最有可能获得有用突变体的位点，以减少无效突变。KA扫描是检定可以通过任何可能的突变方案并通过亲和力测定获得有效突变体的氨基酸位点的过程。若一个具有一个特定氨基酸位点突变的突变子的亲和力发生了变化，该位点就是有用的突变位点，反之亦然。基于这样的扫描方法就可以确定有效的和无效的突变位点，并可借助Cunningham和Wells(Science，1998，244：1081-1085)的方法在设计突变方案之前对各位点进行分类。借此可以大大简化突变设计的数据处理，并减少甚至避免无效突变，这又使突变后亚库的构建和淘筛大大简化。(2)突变引物设计。突变引物设计是这一技术中获得足够数量的有用突变的关键步骤，本发明中采用了以GCR引物设计方案，详细情况见PCT/CN2009/074839。本发明中所述的目标区域(即拟突变的区域)是一个抗体分子的CDR区，优先选择的是轻链和重链的CDR3。本发明中，所述的随机突变优先选择的是在每一个有用突变位点以19种或20种天然氨基酸进行饱和随机突变。(3)此外，根据Kabat计数法确定的目标CDR的侧翼序列也有一些氨基酸对于产生对亲和力有意义的突变子是重要的，至少在某些情况下，某种程度上是这样。因为此，KA扫描应当覆盖CDR及其侧翼氨基酸以获得更广泛的亲和力改善的变异。

在本发明，有用的氨基酸位点可以用本领域熟知的方法突变为随机氨基酸或特定的氨基酸。突变为拟定的氨基酸序列可以通过改变编码该氨基酸的核酸序列来实现。这种编码在特定CDR区具有一个或多个突变的突变子的核酸分子可以用本领域熟知的方法获得。所述的突变方法包括但不限于对已经提前制备的编码CDR区的核酸进行定点突变、寡核苷酸介导的突变、位点特异性突变或随机PCR突变、表达框突变等。制备这种取代突变子的一种优选方法是定点突变。这一技术在本领域是广为熟知(see，e.g.，Carter et al，1985，NAR，13：4431-4443，and Kunkel et al，1987，PNAS，82：488-492)。以PCR为基础的突变方法，其突变核苷酸被置入到了引物中，从而使相应的PCR产物带有突变，这也是可达到此目的的一种优选的方法，详细情况可参考see Vallette et al，(1989)NAR，723-733。本发明中最佳的突变方法是用根据GCR方法(详见PCT/CN2009/074839)或其他可用的方法设计引物，通过PCR在特定的位点进行随机突变。必要时可以同时对一个以上的位点进行突变，从而获得具有多个突变的突变子。

本发明采用Kabat方法编码各个CDR区(EA，et al，1991，Sequences of proteins ofimmunological interest，5th ed.U.S.Department of Health and Human Services，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)。

在某些实施例中，抗人VEGF单抗分子由一条轻链和带有全人源恒定区的一条重链组成。对于本领域技术人员，不难理解当本发明的抗人VEGF单抗分子用于人体治疗疾病时将很少或没有免疫反应。

本发明的某些实施例中，抗人VEGF单抗分子带有Fc区，其优选来源是直接从人种系获得或通过其他途径例如全长DNA合成，人基因组库等。

本发明提供一种亲和力高、解离速率低的抗人VEGF单抗，该单抗在低剂量下是有效的。本领域技术人员不难理解，本发明的抗人VEGF单抗分子特别适合用于人体疾病的治疗，它不像带有鼠源成分的嵌合型抗人VEGF单抗分子(例如Rituxan)那样容易引发HACA反应。

本发明所述的CDR可以与任何类型的框架区整合为有功能的scFv、Fab和/或进一步与Fc区整合从而形成有功能的全长抗体分子。优选的CDR区与全人源框架区或其亚区和种系的或经过修饰的Fc区进行整合。可以用于与本发明的CDR区整合的全人源框架包括但不限于KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(见(1)Kabat et al，1991，Sequencesof Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services，and(2)NIH，USA；and Wu et al，1970，J Exp Med 132：211-250)。

II.产生结合VEGF分子的方法

本发明的抗体或抗体片段可以通过轻链和重链基因在受体细胞中的重组表达来实现。所述受体细胞可以是哺乳动物细胞，也可以是酵母或细菌细胞。

本发明中轻链和重链的表达可以通过瞬时或稳定表达来实现。两种表达策略都包括用一种或多种带有编码抗体轻链和重链的DNA片段的表达载体转染(哺乳动物和酵母系统)或转化(细菌系统)受体细胞，从而使轻链和重链在受体细胞中表达，优选的表达方式是分泌到培养基中，可以用本领域技术人员熟知的层析等方法从中回收抗体。标准的重组DNA方法可以有效地用于轻链和重链基因的获得、克隆至表达载体以及引入到受体细胞。

本发明中在分子进化之前或之后通过淘筛获得的抗体分子是Fab形式的。这种形式可以通过本领域的技术人员熟知的基因工程技术方便地进一步转换成scFv、全长抗体或其他形式。

本发明中，一旦通过上述方法获得了编码所需VL和VH区的DNA片段，就可以用标准基因工程方法进一步转换成全长的抗体轻链和重链基因、Fab片段基因或scFv基因。

为获得全长轻链基因，可以把编码VL区的DNA整合到人轻链恒定区。优先选择的是人kappa或lambda恒定区，最优先选择的是人kappa恒定区。为了获得全长重链基因，可以把编码VH区的DNA整合到重链的恒定区。重链恒定区可以从以下几种中选择，IgG，、IgA、IgE、IgM或IgD。优先选择的是IgG1～IgG4，最优先选择IgG1(gamma)的恒定区。

为了获得单链Fv基因，可以用PCR方法从上述Fab分子进一步获得VH-和VL-DNA编码区，然后用(Gly4)3编码区作Linker把两个片段连接成一个完整分子，使得所述VH和VL序列可以用McCafferty et al，1990，Nature 348：552-554描述的方法以单链Fv蛋白的方式在E.coli中表达。

为了表达本发明所述的抗体或抗体的片段，可以把其相应的轻链和重链编码序列插入到表达载体的转录和翻译控制序列之间。本发明所述的表达载体包含调控序列如启动子、增强子等。所述的表达载体及其控制序列应当与受体细胞兼容。编码轻链和重链的基因可以分别插入到两个独立的载体，也可以插入到同一个载体。所述表达载体可以预置了恒定区，也可以不预置恒定区。如果一个抗体基因只含有可变区，应当使用预置了恒定区的表达载体。

除了转录和翻译调控序列，本发明的表达载体还含有：(1)在每一个表达框有一个信号肽序列，它可以促进抗体从受体细胞分泌到培养基中；(2)至少一个复制起点；(3)一个或多个选择标记基因，借此可方便地对引入了表达载体的受体细胞进行筛选。典型的选择标记基因可为受体细胞提供抗性，例如细菌对抗生素的抗性，哺乳动物细胞或其他受体细胞对G418、潮霉素和MTX等的抗性。所有这些信息对本领域的人员都已经广为熟知。优选的用于本发明的受体细胞包括具有或不具有DHFR的CHO细胞系、HEK293细胞系。抗体的表达是通过培养携带有上述表达载体的受体细胞，然后对产物进行纯化进行的。

本发明的受体细胞也可易用来生产截短的抗体片段，如Fab或scFv。为此目的，尽管哺乳动物或其他受体细胞也可以使用，但以E.coli为代表的细菌是优先选择的受体细胞。本发明中抗体或抗体片段的回收和纯化主要包括：(1)对样品进行调适，即为纯化做准备。首先要去除细胞、细胞碎片、脂质和凝聚物。为此，可先离心，然后0.45μm过滤的方法。(2)层析，包括但不限于亲和、离子交换、分子筛的等层系方法。，在有些情况下，超滤或透析也可选用。本发明优先选择的纯化方法是：Protein A/G亲和后在目标抗体可结合到柱子上、阴离子可穿过的低pH下进行阳离子交换层析。也可以在抗体分子可穿过，但阴离子可结合到柱子上的高pH下用阴离子层析。在离子交换层系中，许多具有不同等电点的杂蛋白可以被去除。(3)如有必要，可用分子筛对已经获得的原液进行进一步纯化。

为获得高纯度的单抗，本发明中在过滤后经过GE HealthCare生产的MabselectSuRe，Capto S和Capto Q进行纯化。为建立更有效的方法，也可以使用包括MabselectSuRe和CaptoA dhere两种组分的两步法。

III.制剂及其应用

本发明的抗人VEGF单抗，包括全长的和截短的，都是治疗或诊断与VEGF相关的人体疾病的有用材料。如上所述，抗人VEGF单抗可用于治疗多种实体瘤、AMD等疾病。

对于熟知本领域的人来说会知道，与各种放射性或非放射性标记物偶联的抗人VEGF对于诊断和治疗是有用的。可用于此目的放射性标记物包括但不限于¹³¹I，¹²⁵I，⁹⁹Tc和⁹⁰Y，可用于此目地的非放射标记物包括但不限于酶(例如HRP，AP等)、荧光染料、毒素等。

本领域的技术人员都知道，与各种放射性或非放射性标记物偶联的抗人VEGF对于诊断和治疗是有用的。可用于此目的放射性标记物包括但不限于¹³¹I，¹²⁵I，⁹⁹Tc和⁹⁰Y，可用于此目地的非放射标记物包括但不限于酶(例如HRP，AP等)、荧光染料、毒素等。

在优选的案例中，接受治疗的客体是非免疫抑制的(如SLE和RA病人)。尽管机理仍然不清楚，但本领域的技术人员很清楚，本发明的抗人VEGF抗体分子引起HACA反应的可能性比以前知道的抗人VEGF抗体要低很多，特别是对非免疫抑制的病人来说更是如此。因此，非免疫抑制的病人可以不用过分顾忌引起副作用的HACA反应。此外，本发明的抗体分子的亲和能力显著提高，因此其有效剂量可明显降低。这进一步避免了可能的HACA反应。本发明的抗人VEGF单抗分子可以与包括但不限于化疗或放疗等其他抗肿瘤治疗方法联用，在某些情况下，也可以与一些细胞因子，如G-CSF联用。

本发明的抗人VEGF抗体分子可以制备成适于给病人使用的剂型，其含有一种人VEGF结合分子，例如抗体或抗体片段，和一种或多种作为医药可接受的载体，例如溶剂、分散介质、包裹剂、抗生素、抗真菌物质、等渗物质、减缓吸收物质以及其他的生理学上能接受的物质。可接受的载体物质包括以下一种或多种：水、盐、磷酸盐缓冲液、葡聚糖、甘油、乙醇等，可单用或组合使用。优选的等渗剂是糖、聚乙醇如mannitol，sorbito，也可以是氯化钠。最优先选择的等渗剂是海藻糖。所述载体可进一步含有微量auxiliary物质，如润湿剂、乳化剂、防腐剂或缓冲液，这些物质有助于提高所述分子的货架期或有效性。

本发明的组分可以形成多种多样的形式，例如注射或输液、分散液或悬浮液等。本发明的优选方式是注射液或输液。

IV.抗人VEGF单抗的其他应用

本发明的抗人VEGF单抗可用于样品中VEGF定性或定量免疫检测。免疫检测是一种检测在含有复杂混合物的溶液中是某种物质是否存在或浓度的方法。除了结合的特异性外，所有免疫检测的主要共同特点是可产生可检测的信号。当今，多数免疫检测方法都依赖于与可测标记相关的分析试剂。本发明可用的标记可以从以下物质中选择：放射性同位素、酶、荧光物质、磷光物质和合学发光染料、磁性颗粒、染料、金和银等的胶体、金属螯合剂、辅酶等。本发明中优选方案是酶(例如HRP和AP)，以及荧光染料。其中最选的是HRP和AP等酶。

本领域中的许多检测方法都是广为熟知并在临床或科学研究中广泛应用，例如疾病检测、生物化学研究等。

附图说明

图1是Fab表达载体pCOMb3M结构示意图。其中，Plac是在E.coli中表达的启动子，ompA和pelB是信号肽编码序列，GPIII是噬菌体尾部蛋白GPIII的编码序列，MCS1和MCS2是Fab轻链和重链的克隆位点。

图2是全长抗体分子在哺乳动物细胞(如CHO、HEK293等)瞬时或稳定表达的双元表达载体pGP6C构建过程及结构示意图。为了在哺乳动物细胞表达抗体的轻链和重链，用如下方法构建了双表达框表达载体。(1).用PCR为基础的全基因合成方法(Xiong A S，Yao Q H，PengR H，et al.，2004，Nucleic Acids Research，32(12)：e98.)按照GenBank AccessionNo.AB608262.1序列资料合成人IgG1轻链(Kappa)恒定区CL，5’增加多克隆位点PstI/NheI/BglII/EcoRI/EcoRV/XhoI，3’-端增加SV40 poly A signal编码区(简写为pASV40)5’-端22个碱基(以pCI-Neo为模板)，以便于通过重叠PCR与Pcmv片段进行拼接。片段长度为345bp。(2)以P3(ttccctttagtgagggttaatg，pASV405’-端引物区)和P4(ccggatcgatccttatcggattt/ACCACATTTGTAG AGGTTTTACTTG，Pcmv3’-端引物区/pA 5’-端引物区)为引物，pCI-Neo为模板扩增pASV40片段，长度为295bp。以P1(ctgcag(PstI)gctagcagatctgaattc gatatcctcgag，多克隆位点-CL片段5’-端引物区)和P4为引物进行重叠PCR对上述两个片段拼接，获得多克隆位点-CL-pA片段，长度为618bp。(3)以P5(caagtaaaacctctacaaatgtggta/aaatccgataaggatcgatccgg，pASV403’-端引物区/Pcmv5’-端引物)和P6(ggtacc(Kpni)CTGTGGAGAGAAAGG CAAAGTG，KpnI位点/PCMV 3’-端引物区)为引物，pCI-Neo(Invitrogen)为模板进行PCR扩增，获得1151bp片段。用P1和P6为引物通过重叠对上述两个片段拼接，其最终结构为：PstI-多克隆位点-CL-pA-PCMV-KpnI，长度为1791bp。该片段克隆至pUC57上，测序验证无误后，插入到phCMV1(Gene TherapySystems，Inc.)载体的PstI/KpnI位点，即构成预置了CL的双表达框表达载体。最后，把根据GenBank Accession No.BC092518.1人工合成的人CH(Gamma)片段插入到上述载体的Acc65I/NotI位点，即构成预置了人轻链恒定区CL和重链恒定区CH的双表达框载体pGP6C。

图3是从3D7进化出的几个Fab分子及其阳性对照和阴性对照Avastin-和Humira-Fab(自备)的亲和力比较图。亲和力以Friguet测定。

图4是全长F6B2及其阳性对照Avastin(自备)亲和力比较图，亲和力为Friguet法测定。

图5是F6B2和Avastin从VEGF解离速率比较图。

图6是抗VEGF单抗对荷DHL4肿瘤的裸鼠肿瘤生长速率比较图。

图7是用活体模型测定了所述抗体对人VEGF促进内皮细胞生长作用的抑制效应，并比较了所述3D7、6B2和Fab-12三种抗体和阴性对照Humira Fab对HR-8348(结直肠癌细胞)(图7A)、HepG2(肝癌细胞)(图7B)和MDA-MB231细胞(人乳腺癌细胞)(图7C)生长的抑制作用。

具体实施方式

以下实施例是为了说明或进一步阐释本发明的某些优选的实施例以及某些论点，并非要限制本发明的范围。

实施例1.大规模全人源抗体库构建

这一实施例描述如何构建Fab形式的超大规模全人源天然抗体库。本发明的Fab抗体库是用来自不同地区、不同民族的3000多名健康成人的血样，参照以下文献构建的，详细构建过程在文献目录之后描述。

1.Dantas，BC，et al，2005，Construction of a human Fab phage display library fromantibody repertoires of osteosarcoma patients.Gene.Mo.Res，4(2)：126-140.

2.Hiroshi，T，et al，1999，Preparation of Recombinant Human Monoclonal AntibodyFab Fragments Specific for Entamoeba histolytica，Clinical and Diagnostic LaborImmunol，May 1999，383-387.

3.Wu，BP，et al，2001，Construction and selection of the natural immune Fabantibody phage display library from patients with colorectal cancer，World JGastroenterol，7(6)：811-815.

4.Lee，CV，et al，2004，High-affinity Human Antibodies from Phage-displayedSynthetic Fab Libraries with a Single Framework Scaffold，J Mol Biol，340，1073-1093.

5.Michael H，et al，2005，Antibody phage display，Mod Asp Immunobiol，15：47-49.

6.De Haard HJ，et al，1999，A large non-immunized human Fab fragment phage librarythat permits rapid isolation and kinetic analysis of high affinity antibodie.J Biol Chem，1999，274：18218-18230.

7.Fellouse，FA，2007，High-throughput generation of synthetic antibodies fromhighly functional minimalist phage-displayed libraries.J Mol Biol 373，924-940.

1.血样和cDNA合成

取每个供体的血样1毫升混合，用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，然后用Invitrogen或Roche公司的试剂盒分离总mRNA，用GIBCO的逆转录试剂盒合成cDNA的第一链。所有步骤按照制造商的说明书进行。

2.扩增重链和轻链的Fab区

为了扩增编码kappa和lambda轻链以及gamma重链的Fd区，采用了表1所示的引物组。除了上述轻链或重链的互补序列外，引物上了带有特定的酶切位点和保护碱基以便于克隆。用100μl体系进行PCR扩增，正义链和反意链引物均采用1mM终浓度，PCR按下述条件进行25个循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟；94℃4分钟预变性，72℃5分钟后延伸。用QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN GmbH，Hilden，Germany)纯化扩增的DNA片段。纯化的片段用SacI/HindIII或XhoI/SpeI酶切后琼脂糖电泳分离，用QIAEXGel Extraction Kit进行胶回收。

表1.用于人免疫球蛋白基因PCR扩增的引物组，下划线部分是增加的酶切位点，兼并密码为：M＝A or C，Y＝C or T，W＝A or T，R＝A or G，H＝A，C，or T，S＝C or G，and K＝T or G.

3.Fab轻链和重链PCR产物克隆到表达载体pCOMb3M

把编码轻链的DNA连接到表达载体pCOMb3M(在pCOMb3H的SacI/XbaI位点之间增加了一个HindIII位点，以方便克隆轻链和重链，详细序列见GenBank Accession No.AF268280，其结构示意图见附图1。然后，把编码Fd重链的DNA连接到上述插入了轻链基因的pCOMb3M，从而形成pCOMb3M/Fab。连接好的载体DNA在1.2％琼脂糖凝胶电泳上与未连接的DNA分离后电击转化大肠杆菌TG1细胞。DNA样品应当完全脱盐。

4.转化

新接种的E.coli TG1菌株250RPM振荡培养至A600约0.5～0.7(大约2～2.5小时)，然后用冰冷的含10％甘油的1mM HEPES(pH7.0)洗涤细胞两次，然后分成100μl的小份，并进行电击。

电击在BIO-RAD Gene Pulser上进行，条件是：25μF，2.5kV，200ohms(100μl)，所有用具和液体均在冰浴预冷。100ng pCOMb3M/Fab DNA水溶液加入到电击杯，立即进行电击。获得的时间常数是4.5～5msec。电击后的细胞立即用1ml新鲜的LB-G或2×YT-G培养基重悬。上述电击共进行10次，所获细胞混合后在含有6ml无抗生素2×YT-G的50毫升离心管中37℃、250RPM培养1小时。然后，加入75μl 20mg/ml的氨苄青霉素和6×10¹⁰pfu的M13KO7，以拯救pCOMb3M/Fab噬粒。1000×g离心20min收获上清，得噬粒悬浮液。

上述过程共重复200次电击，每次可获得约0.67～5.66×10⁸克隆，混合所得噬粒悬浮液，即为超大规模全人源抗体库，称之为HuLib。200次电击的总库容为6.2×10¹⁰分子。拯救的库分成500μl的小份(含约2.7×10¹²噬菌体颗粒)，立即使用或4℃保存备用。

实施例2.用人VEGF对全人源抗体库淘筛

以自备Avastin-Fab为阳性对照，以重组人VEGF为抗原对上述HuLib进行淘筛。淘筛过程如下：

把1小份HuLib加入到预先用重组人VEGF蛋白包被的25毫升细胞培养方瓶中，37℃温育1小时。然后，用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次后，加入1ml对数期的TG1细胞，37C震荡培养16小时。上清转移到一只新的50ml试管，12000rpm离心10分钟。取500μl上清，按照上述方法再次淘筛，总计进行4轮。最后一轮完毕后，获得的细菌细胞悬液稀释至100000细胞/毫升，在含0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂培养平板上筛选，以获得单斑。用上述平板的单斑接种10块96孔深孔板，每孔加入0.25ml带氨苄青霉素的LB培养基，每孔一个单斑，37℃震荡培养16小时后，5000rpm离心20分钟，按孔收取上清，转移至新的96深孔板，4℃保存备用。

用10μg/ml的重组人VEGF包被10块96孔免疫板，从上述单斑上清保存物中每孔取10μl转移至包被的板，37℃温育1小时后，有含1％Tween-20的PBS洗涤20次后，加入1μl HRP标记的羊抗M13单抗，37℃温育30分钟，如上洗涤10次。然后，加入200μl含有0.025％DAB和1μl 1％H₂O₂的PBS，读取595nm光密度。OD值最高的孔就是亲和力最高的Fab。依据上述OD值，鉴定出了427个OD值比阳性对照高的克隆，进一步亲和力分析发现，5B2、6G3、6H4、4D1和3D7的OD值较高，其中3D7是最高的。

用Friguent et al.(Friguet，B.et al.，1985，J.Immunol.Methods，77：305-319)对3D7的测定发现，其解离常数为1561pM。

根据DNA测序结果推断的7F2表达的单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为：SEQ IDNO.1；重链可变区氨基酸序列为：SEQ ID NO.2。

原型分子3D7轻链可变区氨基酸序列：

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQFVGFYIHWYQQKPGKAPKLLIYAASERATGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWLNNPFTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：1)

原型分子3D7重链可变区氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVAYIAPSYGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRSSDASYSYSAWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)

注：带下划线的是CDR区(氨基酸序列中)或CDR编码区(DNA序列中).

实施例3分子进化

用Cunningham and Wells(Science，244：1081-1085，1989)的方法对7F2克隆的所有CDR进行分析，鉴定出对甘氨酸取代敏感的残基，这些残基即为优选的突变位点。下表是3D7克隆中的优选氨基酸位点，其中带下划线的是对取代极为敏感的，带点的是对取代比较敏感的，它们都是优选的突变位点。

表1.3D7克隆的优选突变氨基酸位点

  CDR1  CDR2  CDR3

  轻链  RATQDATVASAW  YASSFIYS  QNSFLNAAT  重链  AASGFTIGDYAMH  GPATPYGATTYYADSVKG  FSFDASYSMDY

用寡核苷酸介导的随机突变(Kunkel法)对上述优选位点进行突变，通过淘筛可获得对这些位点进一步改良的抗体分子。简要过程是：为了在上述优选位点引入突变，根据Kunkel法设计了突变引物，并以pCOMb3M为载体构建了Fab次级抗体库。采用实施例2以及本领域熟知的方法，以人VEGF为抗原对该次级库进行四轮常规淘筛。

以轻链的CDR1为例来进一步说明引物的设计和合成。确定的编码在优选位点带有随机突变的轻链CDR1的引物为：

5’-CGCNNNACCCAGGACGCCNNNNNNGCCTCCGCCTGG-3’，N为A、T、C或G.。

这一序列与其5’-和3’-端侧翼序列整合后形成如下片段：

5’-gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcCGCNNNACCCAGGACGCCNNNNNNGCCTCCGCCTGGtggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctat-3，

这一序列编码轻链CDR1，在其优选位点及侧翼序列引入了随机突变。

用本领域熟知的化学法或PCR法合成上述序列。带有优选突变的其他CDR区以此方法进行设计并与其侧翼序列拼接。拼接可以用本领域熟知的重叠PCR进行。通过重叠PCR，可以把这些片段进一步拼接成编码Fab轻链和重链的序列。

把上述序列插入到pCOM3bM，然后引入到E.coli菌株TG1，即可构成所述Fab次级库。按实施例2的方法对人VEGF进行四轮淘筛，获得了107个OD值超过阳性对照的克隆。如图3所示，克隆6G7、2A3、4C6和6B2的OD值最高。对最好的克隆6B2亲和力的测定在下面部分描述。

表2.抗人VEGF Fab分子CDR区的氨基酸序列.

  CDR1  CDR2  CDR3  轻链  RGTQDASTAIAW  YSVSFIYS  QQSYSNAFT  重链  AASGFSISDYWMH  GGITPVGGYTYYGDSLKG  FGFFLSYVMDY

DNA测序结果显示，6B2的轻链可变区编码序列为SEQ ID NO.3，编码SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；重链可变区的编码序列为SEQ ID NO.5，编码SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。由此推断的Fab轻链氨基酸序列为：SEQ ID NO.8；重链氨基酸序列为：SEQ ID NO.10。候选分子6B2编码轻链可变区的DNA序列：

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCTTCCGTGTCTGCATCTATAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGCGCCTCCCAGGACGCCTCCTACTCCTCCGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTGAACTCCTGATCTATTCCGCCGCCTCCTACGAGTCCGGCGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAGTCCTCCGCCTCCCCCGCCACCTTCGGCCAAGGGACGCGACTGGAGATTAAACGAACT(SEQ ID NO：3)

候选分子6B2轻链可变区氨基酸序列：

DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQDASYSSAWYQQRPGKAPELLIYSAASYESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQSSASPATFGQGTRLEIKRT(SEQ ID NO：4)

候选分子6B2编码重链可变区的DNA序列：

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTCGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGCTTCGACATCTACGACGACGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGTACATCGCCCCCTCCTACGGCTACACCCGCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTTTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGTCTGTGTATTACTGTGCGCGCTCCTCCGACGCCTCCTACTCCTACTCCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTCGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO：5)

候选分子6B2重链可变区氨基酸序列：

EVQLVQSGGGVVQPRRSLRLSCAASGFDIYDDDIHWVRQAPGKGLEWVYIAPSYGYTRYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTSVYYCARSSDASYSYSAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)

编码6B2 Fab轻链可变区的DNA序列：

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCTTCCGTGTCTGCATCTATAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGCGCCTCCCAGGACGCCTCCTACTCCTCCGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTGAACTCCTGATCTATTCCGCCGCCTCCTACGAGTCCGGCGTGCCCTCCAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAGTCCTCCGCCTCCCCCGCCACCTTCGGCCAAGGGACGCGACTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO：7)

编码6B2Fab轻链可变区氨基酸序列：

EVQLVQSGGGVVQPRRSLRLSCAASGFDIYDDDIHWVRQAPGKGLEWVYIAPSYGYTRYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTSVYYCARSSDASYSYSAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH(SEQID NO：8)

编码6B2Fab重链可变区的DNA序列：

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTCGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGCTTCGACATCTACGACGACGACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGTACATCGCCCCCTCCTACGGCTACACCCGCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTTTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGTCTGTGTATTACTGTGCGCGCTCCTCCGACGCCTCCTACTCCTACTCCGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTCGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC(SEQ ID NO：9)

编码6B2 Fab重链氨基酸序列：

EVQLVQSGGGVVQPRRSLRLSCAASGFDIYDDDIHWVRQAPGKGLEWVYIAPSYGYTRYADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTSVYYCARSSDASYSYSAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH(SEQ IDNO：10)

注：带下划线的是CDR区(氨基酸序列中)或CDR编码区(DNA序列中).

实施例4.全长6B2蛋白制备

用pGP6C做表达载体、DG44为受体细胞获得了稳转细胞系，对6B2全长蛋白进行了表达，详细操作描述如下。

pGP6C的构建详见附图2。

把6B2的重链和轻链可变区克隆到已预置了恒定区和信号肽序列编码区的双表达框表达载体pGP6C。

上述重组表达载体称之为pGP6C/6B2，用来瞬转DG44细胞，以检查是否可以产生正确的全长6B2抗体分子及其表达是否正常。如结构正确、表达正常，则用Kpn2出线性化pGP6C/6B2载体。

用上述线性化的载体DNA转染DHFR^-的预先适应了无血清悬浮培养的DG44受体细胞。转染可用电击或LipFamine2000或其他转染试剂进行，同时进行三个转染。转染完毕，所述细胞在20，50，100 and 200nM G418压力下进行选择，每浓度1次培养2周。然后转移至96孔板培养至70％覆盖度，换成选择培养基(含5％透析胎牛血清和适当水平的G418)进行筛选，并监控其生长情况，直至为转染的细胞死去，只留下转染的细胞。所述带有转染细胞的板生长大约4周，直至形成细胞团。镜检观察产生的细胞团，至适当大小(大于孔底面积的＞60％)，并确认每孔只有一个细胞团。根据对细胞上清的IgGκELISA检测结果，从960个转染子中筛选出98个表达水平相对较高的，并对其进行了静态培养鉴定。对选出的细胞系在EX302无血清培养基(JRH产品)中进行悬浮培养，用ELISA法进一步检定其表达水平并对细胞生长速率进行观察。根据收获上清的抗体浓度和可接受的生长特性，选出了两个最好的细胞系在EX302无血清培养基中进行批式摇瓶培养。用Protein AHPLC法测定，两个细胞系都可产生6B2全长抗体分子，产率在10～33pg/cell/day。

以Invitrogen的mRNA纯化试剂盒分离纯化mRNA后常规方法进行反转录，把获得的cDNA克隆至pUC57，菌落PCR鉴定阳性克隆后，进行DNA测序，证实两个克隆都有全长的轻链和重链编码区。根据DNA测序结果推断的氨基酸序列与预期相同。

用GE Healthcare的重组抗体的纯化MabSelect/Capto S/Capto Q方案对重组抗体进行纯化。

实施例5.进化后的亲和力测定

亲和力测定与比较

本发明中的待测样品是在E.coli DH5α中表达的6G7、2A3、4C6和6B2及其原型抗体3D7的Fab抗体分子，用Protein L亲和层析纯化得到的。自备的Fab-12是根据Wei-ChingLiang等(2006，JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，281(2)：951-961)提供的编码序列利用PCR为基础的全基因合成方法合成全长后插入到pCOMb3M，在E.coli DH5α中表达后，用Protein L亲和层析纯化得到的。

以人VEGF为抗原，对变异体6G7、2A3、4C6和6B2及其原型抗体3D7进行了亲和力分析，阳性对照为自备的Fab-12。

抗体和人VEGF在溶液中共温育至平衡，用固化的人VEGF进行ELISA测定自由抗体的浓度，并根据Friguent et al.(Friguet，B t al，1985，J Immunol Methods，77：305-319)的方法计算亲和力(Kd)。

根据亲和力测定结果，6B2是最好的克隆，可作为进一步测定生物活性以评价其临床应用价值的对象。

附图3是6G7、2A3、4C6和6B2及其原型抗体3D7以及阳性对照Fab-12的亲和力数据。本图数据表明，与其原型分子3D7以及阳性对照Fab-12相比，进化后的6B2的亲和力有大幅度提高。后续研究中还将对这一改进的生物学功能进行检测。阴性对照与该抗原没有结合能力，这里未给出试验数据。

计算得出的3D7、6B2和Fab-12的Kd值为1561、276和1348pM。显然，进化后，亲和力有了很大提高。

同时进行的另一试验中测定了全长F6B2和Fab-12的全长形式的亲和力。附图4给出了同时测定的全长6B2(此处称为F6B2)和Avastin的亲和力。该图说明，与其阳性对照Avastin相比，F6B2的亲和力得到很大提高。根据Friguent公式得出的F6B2和Avastin的亲和力是22and 1512pM。

解离速率比较

为了测得这些抗体的解离速率，1ml人HUVEC细胞(human umbilical vein endothelialcells)在azide/2DOG存在的情况下与2μg/ml ¹²⁵I标记的抗体37℃温育2小时，以达到最大结合量。3000rpm离心15分钟后，去上清，沉淀快速重悬于1ml培养基，并立即转移到含有9ml 37℃培养基的15ml conical管中，充分混合。此后2小时进行多点取样，每次0.4ml，用phthalate oils进行分离以测定保持在细胞表面的放射性标记抗体的水平。如图5所示，F6B2的解离速率明显低于Avastin。

实施例6.抗人VEGF抗体对VEGF诱导的细胞分裂的抑制作用

已经证明，VEGF是一种可刺激血管内皮细胞分裂的促细胞分裂剂，其有效浓度为25pg/ml，饱和浓度是500pg/ml，但没有刺激其他细胞类型(如牛血管平滑肌细胞和角膜内皮细胞)分化的作用。本试验用牛肾上腺皮质衍生的毛细血管内皮细胞作为靶细胞，以Gospodarowicz D等建立的方法(Gospodarowicz D，et al，1989，PNAS，86：7311)and Leunget al(Leung et al，1989，Science 246：1306-1309)进行内皮细胞生长试验。

在添加了10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺的低糖DEME培养基培养牛肾上腺皮质衍生的毛细血管内皮细胞。为测定细胞分裂情况，以500细胞/孔接种内皮细胞到96孔板，并加入等量的重组人VEGF，以促进细胞生长。

在接近VEGF最大效应浓度(3ng/ml)条件下，对3D7、6B2、自备Fab-12和Humira Fab抑制牛毛细血管内皮细胞分化作用进行了比较。上述重组Fab梯度稀释后加入培养孔，使其浓度分别达到1至10000ng/ml，三重复。2-3小时后，加入重组人VEGF至终浓度3ng/ml。5至6天后，用Trypsin消化后分散培养的细胞，MTT反应后测定密度570nM处的光密度。如图6所示，所有三种抗人VEGF抗体3D7、6B2和Fab-12均可中和人VEGF促进内皮细胞分化的作用，但抗人TNFa抗体Humira不能。

如图6所示，Fab-12、6B2和3D7效果不同，其ED50分别为179±5ng/ml、26±3ng/ml(about 0.186nM)和83±2ng/ml。这些数据说明，与其原型分子3D7相比，6B2的效果显著提高，甚至比阳性对照Fab-12还高。

实施例7.活体中抗肿瘤功能试验

用活体模型测定了所述抗体对人VEGF促进内皮细胞生长作用的抑制效应，并比较了所述3D7、6B2和Fab-12三种抗体和阴性对照Humira Fab对HR-8348(结直肠癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)和MDA-MB231细胞(人乳腺癌细胞)生长的抑制作用。

如图7所示，在剂量为5mg/ml情况下，接种细胞8周后肿瘤大小证明，三种抗体都能显著抑制所有三种供试细胞的生长。与阴性对照相比，在所有剂量下，三种癌症模型的肿瘤体积都变小了，且6B2的抑制作用最为明显，超过了阳性对照。但阴性对照未见可见抑制作用。

图7数据还说明，与阴性对照相比，3D7和6B2都对肿瘤生长有抑制作用。